离子交换层析去多糖

❶ 离子交换层析可用于哪些种类蛋白质的分离

离子交换层析是利用蛋白质在不同PH带不同种电荷的方法，利用离子交换的方法分离专蛋白的。
离子交换属内的介质一般是树脂，阳离子交换型的，使用前树脂先用碱处理成钠型，将氨基酸混合液（pH=2-3)上柱，pH=2-3时，氨基酸主要以阳离子形式存在，与树脂上的钠离子发生交换而被“挂”在树脂上，再用洗脱剂洗脱。不同的氨基酸（带的电荷不同）与树脂的亲和力不同，要将其分离洗脱下来，需要降低它们之间的亲和力，方法是逐步提高洗脱剂的pH和盐浓度，这样各种氨基酸将以不同的速度被洗脱下来，反之亦然。

不同反荷离子与树脂亲和力是不同的，其强弱关系为阳性竞争离子：Ag+〉CS+〉K+〉NH4+〉Na+〉H+〉Li+ 阴性竞争离子：I->NO3->(PO4)3->CN-〉HSO3-〉Mg2+〉HCO3-〉HCOO-〉CH3COO-〉OH-〉F- 如果某种离子溶液洗脱效果不好，可用另一种亲和力强的离子代替之，等电点＞7选择阳离子交换树脂，等电点＜7选择阴离子交换树脂。

❷ 提取植物蛋白时如何除去多糖

1. 过碘酸钠氧化, 再HYDROZIDE共价层析, 氧化的糖成醛,能与叠氮胺成共价键. 简单实用
2. 过BORONIC ACID亲和层析回. BORONIC ACID能与多糖形成共价键. 适用于多答糖是5环结构(如果糖).
3. 离子交换层析. 廉价,实用.
4. 疏水层析. 回收率低
5. 试试不同的多糖亲和层析. 如麦芽糖亲和层析就很普遍

上面的层析材料SIGMA都有

❸ 离子交换层析中流出物质顺序是什么

若用离子交换层析分离物质，以蛋白质为例，离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阴离子交换树脂；而带有负电荷的称之阳离子树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。

由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。

反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。

(3)离子交换层析去多糖扩展阅读：

对于离子交换纤维素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的颗粒，以保证有较好的均匀度，对于已溶胀好的产品则不必经这一步骤。

溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理，使之成为带H+或OH-的交换剂型。阴离子交换剂常用“碱-酸-碱”处理，使最终转为-OH-型或盐型交换剂；对于阳离子交换剂则用“酸-碱-酸”处理，使最终转为-H-型交换剂。

梯度不要上升太快，要恰好使移动的区带在快到柱末端时达到解吸状态。目的物的过早解吸，会引起区带扩散；而目的物的过晚解吸会使峰形过宽。

❹ 柱层析分离纯化多糖

在使用部分收集器时，每个梯度应洗至苯酚-硫酸法基本无多糖检出为止

❺ 多糖的纯化方法与哪些

ctab即十六烷基三甲基溴化铵，是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在这种条件下，蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里，在高离子强度的溶液里，ctab与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。因此，ctab可以用于从大量产生粘多糖的有机体如植物以及某些革兰氏阴性菌（包括e.coli的某些株）中制备纯化dna
去垢剂(表面活性剂)是一类即具有亲水基又具有疏水基的物质，一般具有乳化、分散、和增溶作用，可分阴离子、阳离子和中性去垢剂等多种类型，中性去垢剂在蛋白提取钟应用的较多。
a．中性去垢剂
又称非离子表面活性剂，对蛋白质的变性作用影响较少，宜于蛋白质或酶提取之用。一般市售中性去垢剂有聚乙二醇类，如peg200；多元醇类表面活性剂，如山梨醇、司盘类和吐温类；聚氧乙烯脂肪醇醚，如苄泽类、平平加类；聚氧乙烯烷基苯酚醚，如igepal
co、乳化剂op、triton、pluronic(用作消泡剂、润湿剂、增溶剂)、泡敌。中性去垢剂作用后可通过sephadex
lh-50柱除去；也可直接上deae-sephadex柱层析分离目的蛋白，不必先除去去垢剂。
b．阴离子去垢剂
常见的有十二烷基硫酸钠和十二烷基璜酸钠。前者可促进核蛋白的溶解，将核酸释放出来，并对核酸酶有一定抑制作用，常用于核酸的提取。
c．阳离子去垢剂
如洁尔灭、新洁尔灭、ctab、cpc、zeph、克菌定、消毒净（tmpb）、杜灭芬等，消毒灭菌类居多。
d．天然表面活性剂
又称为生物表面活性剂，包括种类较为广泛，如各种树胶（阿拉伯胶、杏胶、桃胶、果胶）、明胶、皂甙、卵磷脂、豆磷脂、琼脂、海藻酸钠、酪蛋白、胆甾醇、胆酸类、多糖类（如环糊精）等。
e．两性表面活性剂
在碱性水溶液中呈阴离子表面活性剂的性质，起泡性好，去污力也强；在酸性溶液中则呈现阳离子表面活性剂特征，其杀菌性很强。
蛋白质变性剂的作用是破坏蛋白质的次级键，如氢键、盐键和疏水力，引起天然构象的解体；它们并不破坏共价键，如肽键和二硫键，故不涉及一级结构的改变。变性剂有溶解型和沉淀型两类，sds、尿素和胍盐是有效的溶解型变性剂，而三氯乙酸、甲醇、和氯仿/异戊醇是有效的沉淀变性剂。一般而言，变性剂应用时常大大过量，破坏氢键的变性剂用量至少两倍于氨基酸的克分子数，如1克蛋白质可可结合1.4g。
sds溶于水可达25%，对温度敏感，w/v贮存液最为方便。需要注意的是sds的钾盐是不溶性的，所以sds溶液中要避免混入钾盐。
尿素极易溶于水，可达10mol/l,在8mol/l以上要注意温度以防止沉淀。尿素在水中缓慢分解形成氨及高度活性的氰酸离子，故要防止高温。
三氯乙酸与过氯酸（tca，pca）都是极好的沉淀剂，能沉淀蛋白质和核酸，前者应用更为广泛。

❻ 多糖类的提取方法

一、提取与纯化动植物中存在的多糖或微生物胞内多糖，因其细胞或组织外大多有脂质包围，要使多糖释放出来，第一步就是去除表面脂质，常用醇或醚回流脱脂。第二步将脱脂后的残渣以水为主体的溶液提取取多糖 （即冷水，热水，热或冷的0.1-1.0mol/L NaOH，热或冷的1%醋酸或1%苯酚等），这样提取得到的多糖提取液含有许多杂质，主要是无机盐，低分子量的有机物质及高分子量的蛋白质、木质素等。第三步则要除去这些杂质，对于无机盐及低分子量的有机物质可用透析法、离子交换树脂或凝胶过滤法除去；对于大分子杂质可用酶消化 （如蛋白酶．木质素酶） ，乙醇或丙酮等溶剂沉淀法或金属络合物法。多糖提取液中除去蛋白质是一个很重要的步骤，常用的方法有Sevag法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法，后者较为剧烈，对于含呋喃糖残基的多糖由于连接键不稳定，所以不宜使用。但该法效率较高，操作简便，植物来源的多糖常采用该法。上述三种方法均不适合于糖肽，因为糖肽也会像蛋白质那样沉淀出来。除去蛋白质后，应再透析一次，选用不同规格的超滤膜和透析袋进行超滤和透析，可以将不同分子大小的多糖进行分离和纯化，该法在除去小分子物质十分实用，同时能满足大生产的需要。具有广阔的应用前景。至此，得到的提取液基本上是没有蛋白质与小分子杂质的多糖混合物。一般来讲，通过上述方法所得到的是多糖的混合物，如果要得到单一的多糖，还必须对该混合物进行纯化。柱层析在多糖的纯化较为常用，常分为两类：一是只有分子筛作用的凝胶柱层析， 它根据多糖分子的大小和形状不同而达到分离目的，常用的凝胶有葡聚糖凝胶及琼脂糖凝胶，以及性能更佳的Sephacryl等。洗脱剂为各种浓度的盐溶液及缓冲液，其离子强度不应低于0.02mol/L。二是离子交换层析，它不仅根据分子量的不同，同时也具有分子筛的作用，常用的交换剂有DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖和 DEAE-琼脂糖等，此法适合于分离各种酸性，中性多糖和粘多糖。多糖的纯化还可用其他方法，如制备性高效液相层析、制备性区带电泳，亲和层析等，这些方法有时对制备一些小量纯品供分析用是很有用处的。

❼ 离子交换层析与疏水层析有何区别

离子交换层析是利用蛋白质在不同PH带不同种电荷的方法，利用离子交换的方法分离蛋白的。离子交换内的介质一般是树脂，阳离子交换型的，使用前树脂先用碱处理成钠型，将氨基酸混合液（pH=2-3)上柱，pH=2-3时，氨基酸主要以阳离子形式存在，与树脂上的钠离子发生交换而被“挂”在树脂上，再用洗脱剂洗脱。不同的氨基酸（带的电荷不同）与树脂的亲和力不同，要将其分离洗脱下来，需要降低它们之间的亲和力，方法是逐步提高洗脱剂的pH和盐浓度，这样各种氨基酸将以不同的速度被洗脱下来，反之亦然。不同反荷离子与树脂亲和力是不同的，其强弱关系为阳性竞争离子：Ag+〉CS+〉K+〉NH4+〉Na+〉H+〉Li+阴性竞争离子：I->NO3->(PO4)3->CN-〉HSO3-〉Mg2+〉HCO3-〉HCOO-〉CH3COO-〉OH-〉F-如果某种离子溶液洗脱效果不好，可用另一种亲和力强的离子代替之，等电点＞7选择阳离子交换树脂，等电点＜7选择阴离子交换树脂。

❽ 求一种多糖的分离和药物活性

2.1 概述
 在自然科学，尤其是生命科学高度发展的今天，蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构与功能的研究是探求生命奥秘的中心课题，而生物大分子结构与功能的研究，必须首先解决生物大分子的制备问题，有能够达到足够纯度的生物大分子的制备工作为前题，结构与功能的研究就无从谈起。然而生物大分子的分离纯化与制备是一件十分细致而困难的工作。

 与化学产品的分离制备相比较，生物大分子的制备有以下主要特点：
 ⑴生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至几千种化合物。
 ⑵许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离纯化的步骤繁多，流程长。
 ⑶许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制备最困难之处。
 ⑷生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判断。

 生物大分子的制备通常可按以下步骤进行：
 ①确定要制备的生物大分子的目的和要求，是进行科研、开发还是要发现新的物质。
 ②建立相应的可靠的分析测定方法，这是制备生物大分子的关键。
 ③通过文献调研和预备性实验，掌握生物大分子目的产物的物理化学性质。
 ④生物材料的破碎和预处理。
 ⑤分离纯化方案的选择和探索，这是最困难的过程。
 ⑥生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定，要求达到一维电泳一条带，二维电泳一个点，或HPLC和毛细管电泳都是一个峰。
 ⑦产物的浓缩，干燥和保存。


 分析测定的方法主要有两类：
 即生物学和物理、化学的测定方法。
 生物学的测定法主要有：酶的各种测活方法、蛋白质含量的各种测定法、免疫化学方法、放射性同位素示踪法等；
 物理、化学方法主要有：比色法、气相色谱和液相色谱法、光谱法（紫外／可见、红外和荧光等分光光度法）、电泳法、以及核磁共振等。
 实际操作中尽可能多用仪器分析方法，以使分析测定更加快速、简便。

要了解的生物大分子的物理、化学性质主要有：
 ①在水和各种有机溶剂中的溶解性。
 ②在不同温度、pH 值和各种缓冲液中生物大分子的稳定性。
 ③固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。
 ④各种物理性质：如分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数。
 ⑤其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性。
 ⑥对其他生物分子的特殊亲和力。

 制备生物大分子的分离纯化方法多种多样，主要是利用它们之间特异性的差异，如分子的大小、形状、酸碱性、溶解性、溶解度、极性、电荷和与其他分子的亲和性等。
 各种方法的基本原理可以归纳为两个方面：
 ①利用混合物中几个组分分配系数的差异，把它们分配到两个或几个相中，如盐析、有机溶剂沉淀、层析和结晶等；
 ②将混合物置于某一物相（大多数是液相）中，通过物理力场的作用，使各组分分配于不同的区域，从而达到分离的目的，如电泳、离心、超滤等。
 目前纯化蛋白质等生物大分子的关键技术是电泳、层析和高速与超速离心。

 2.2 生物大分子制备的前处理
 2.2.1 生物材料的选择
 制备生物大分子，首先要选择适当的生物材料。材料的来源无非是动物、植物和微生物及其代谢产物。
 选择的材料应含量高、来源丰富、制备工艺简单、成本低，尽可能保持新鲜，尽快加工处理。
 动物组织要先除去结缔组织、脂肪等非活性部分，绞碎后在适当的溶剂中提取，如果所要求的成分在细胞内，则要先破碎细胞。
 植物要先去壳、除脂。
 微生物材料要及时将菌体与发酵液分开。
 生物材料如暂不提取，应冰冻保存。动物材料则需深度冷冻保存。

 2.2.2 细胞的破碎
 不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织，其细胞破碎的难易不一，使用的方法也不相同，如动物脏器的细胞膜较脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有较坚固的纤维素、半纤维素组成的细胞壁，要采取专门的细胞破碎方法。
 (1)机械法：
 1) 研磨：将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中，加入少量石英砂研磨或匀浆。
 2) 组织捣碎器：这是一种较剧烈的破碎细胞的方法，通常可先用家用食品加工机将组织打碎，然后再用10000r/min～20000r/min的内刀式组织捣碎机(即高速分散器)将组织的细胞打碎。

 (2)物理法：
 1) 反复冻融法：将待破碎的细胞冷至－15℃到－20℃，然后放于室温(或40℃)迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。
 2) 超声波处理法：此法是借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。破碎微生物细菌和酵母菌时，时间要长一些。
 3) 压榨法：这是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。在1000×105Pa～2000×105Pa 的高压下使细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。
 4) 冷热交替法：从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此法。在90℃左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。

 (3)化学与生物化学方法：
 1) 自溶法：将新鲜的生物材料存放于一定的pH和适当的温度下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来。
 2) 溶胀法：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，将细胞膜胀破释放出细胞内含物。
 3) 酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶和酯酶等，于37℃，pH8，处理15分钟，可以专一性地将细胞壁分解。
 4) 有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。


 2.2.3 生物大分子的提取
 “提取”是在分离纯化之前将经过预处理或破碎的细胞置于溶剂中，使被分离的生物大分子充分地释放到溶剂中，并尽可能保持原来的天然状态不丢失生物活性的过程。
 影响提取的因素主要有：
 目的产物在提取的溶剂中溶解度的大小；
 由固相扩散到液相的难易；
 溶剂的pH值和提取时间等。
 通常：
 极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂；
 碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂；
 温度升高，溶解度加大；
 远离等电点的pH值，溶解度增加。
 提取时所选择的条件应有利于目的产物溶解度的增加和保持其生物活性。

 ⑴ 水溶液提取：
 蛋白质和酶的提取一般以水溶液为主。稀盐溶液和缓冲液对蛋白质的稳定性好，溶解度大，是提取蛋白质和酶最常用的溶剂。用水溶液提取生物大分子应注意的几个主要影响因素是：
 1) 盐浓度（即离子强度）：
 离子强度对生物大分子的溶解度有极大的影响，有些物质，如DNA-蛋白复合物，在高离子强度下溶解度增加。
 绝大多数蛋白质和酶，在低离子强度的溶液中都有较大的溶解度，如在纯水中加入少量中性盐，蛋白质的溶解度比在纯水时大大增加，称为“盐溶”现象。盐溶现象的产生主要是少量离子的活动，减少了偶极分子之间极性基团的静电吸引力，增加了溶质和溶剂分子间相互作用力的结果。
 为了提高提取效率，有时需要降低或提高溶剂的极性。向水溶液中加入蔗糖或甘油可使其极性降低，增加离子强度（如加入KCl、NaCl、NH4Cl或(NH4)2SO4）可以增加溶液的极性。


 2) pH值：蛋白质、酶与核酸的溶解度和稳定性与pH值有关。过酸、过碱均应尽量避免，一般控制在pH=6～8范围内，提取溶剂的pH应在蛋白质和酶的稳定范围内，通常选择偏离等电点的两侧。
 3) 温度：为防止变性和降解，制备具有活性的蛋白质和酶，提取时一般在0℃～5℃的低温操作。
 4) 防止蛋白酶或核酸酶的降解作用：加入抑制剂或调节提取液的pH、离子强度或极性等方法使相应的水解酶失去活性，防止它们对欲提纯的蛋白质、酶及核酸的降解作用。

 5) 搅拌与氧化：搅拌能促使被提取物的溶解，一般采用温和搅拌为宜，速度太快容易产生大量泡沫，增大了与空气的接触面，会引起酶等物质的变性失活。因为一般蛋白质都含有相当数量的巯基，有些巯基常常是活性部位的必需基团，若提取液中有氧化剂或与空气中的氧气接触过多都会使巯基氧化为分子内或分子间的二硫键，导致酶活性的丧失。在提取液中加入少量巯基乙醇或半胱氨酸以防止巯基氧化。

 ⑵ 有机溶剂提取
 一些和脂类结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶难溶于水、稀盐、稀酸、或稀碱中，常用不同比例的有机溶剂提取。
 常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、正丁酮等，这些溶剂可以与水互溶或部分互溶，同时具有亲水性和亲脂性。
 有些蛋白质和酶既溶于稀酸、稀碱，又能溶于含有一定比例的有机溶剂的水溶液中，在这种情况下，采用稀的有机溶液提取常常可以防止水解酶的破坏，并兼有除去杂质提高纯化效果的作用。
例如，胰岛素（见讲义p36）。

 2.3 生物大分子的分离纯化
 由于生物体的组成成分是如此复杂，数千种乃至上万种生物分子又处于同一体系中，因此不可能有一个适合于各类分子的固定的分离程序，但多数分离工作关键部分的基本手段是相同的。
 为了避免盲目性，节省实验探索时间，要认真参考和借鉴前人的经验，少走弯路。常用的分离纯化方法和技术有：
 沉淀法（包括：盐析、有机溶剂沉淀、选择性沉淀等）、离心、吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、快速制备型液相色谱以及等电聚焦制备电泳等。本章以介绍沉淀法为主。

 2.3.1 沉淀法
 沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。沉淀法（即溶解度法）操作简便，成本低廉，不仅用于实验室中，也用于某些生产目的的制备过程，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。通过沉淀，将目的生物大分子转入固相沉淀或留在液相，而与杂质得到初步的分离。
 其基本原理是根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的，不同溶解度的产生是由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力的差异而引起的，溶解度的大小与溶质和溶剂的化学性质及结构有关，溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的pH值、离子强度和极性都会使溶质的溶解度产生明显的改变。

 在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是：
 ⑴中性盐沉淀（盐析法）：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。
 ⑵有机溶剂沉淀：多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分离纯化。
 ⑶选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）：多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变性的杂蛋白。
 ⑷等电点沉淀：用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀，但此法单独应用较少，多与其他方法结合使用。
 ⑸有机聚合物沉淀： 是发展较快的一种新方法， 主要使用PEG聚乙二醇（Polyethyene glycol）作为沉淀剂。

 2.3.1.1 中性盐沉淀（盐析法）
 在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析”。除了蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离。
 盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，已有八十多年的历史，其突出的优点是：
 ①成本低，不需要特别昂贵的设备。
 ②操作简单、安全。
 ③对许多生物活性物质具有稳定作用。

 ⑴ 中性盐沉淀蛋白质的基本原理
 蛋白质和酶均易溶于水，因为该分子的－COOH、－NH2和－OH都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成1nm～100nm颗粒的亲水胶体，削弱了蛋白质分子之间的作用力，蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也越大。亲水胶体在水中的稳定因素有两个：即电荷和水膜。因为中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所以加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。盐析示意图如下页“图 4”所示。

 ⑵ 中性盐的选择
 常用的中性盐中最重要的是（NH4）2SO4，因为它与其他常用盐类相比有十分突出的优点：
 1) 溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这是其他盐类所不具备的。由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析操作也要求在低温下（0～4℃）进行。由下表可以看到， 硫铵在0℃时的溶解度，远远高于其它盐类：
 表2-1 几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水）
 0℃ 20℃ 80℃ 100 ℃
（NH4)2SO4 70.6 75.4 95.3 103
 Na2SO4 4.9 18.9 43.3 42.2
 NaH2PO4 1.6 7.8 93.8 101






 2) 分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵
盐析，一步就可以除去75％的杂蛋白，纯
度提高了四倍。
 3) 不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的
作用。有的酶或蛋白质用2～3mol/L浓度的
（NH4）2SO4保存可达数年之久。
 4) 价格便宜，废液不污染环境。

 ⑶ 盐析的操作方法
 最常用的是固体硫酸铵加入法。将其研成细粉，在搅拌下缓慢均匀少量多次地加入，接近计划饱和度时，加盐的速度更要慢一些，尽量避免局部硫酸铵浓度过大而造成不应有的蛋白质沉淀。盐析后要在冰浴中放置一段时间，待沉淀完全后再离心与过滤。
 在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离，高浓度硫酸铵常用过滤方法。
 各种饱和度下需加固体硫酸铵的量可由附录中查出。

 ⑷ 盐析曲线的制作
 如果要分离一种新的蛋白质和酶，没有文献数据可以借鉴，则应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度。具体操作方法如下(讲义p39)：

蛋白质量(mg)或酶活力

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 硫铵饱
和度％

 ⑸盐析的影响因素
 1) 蛋白质的浓度：高浓度的蛋白质用稍低的硫酸铵饱和度沉淀，若蛋白质浓度过高，易产生各种蛋白质的共沉淀作用。低浓度的蛋白质，共沉淀作用小，但回收率降低。较适中的蛋白质浓度是2.5％～3.0％，相当于25 mg/mL～30mg/mL。
 2) pH值对盐析的影响：在等电点处溶解度小，pH值常选在该蛋白质的等电点附近。
 3) 温度的影响：对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子，在高离子强度溶液中，温度升高，它们的溶解度反而减小。在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解度大多数还是随浓度升高而增加的。一般情况下，可在室温下进行。但对于某些对温度敏感的酶，要求在0℃～4℃下操作，以避免活力丧失。


 2.3.1.2 有机溶剂沉淀法
 ⑴基本原理
 有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用的沉淀方法之一。其原理主要是：
 ①降低水溶液的介电常数，向溶液中加入有机溶剂能降低溶液的介电常数，减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。
 ②由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏了蛋白质分子的水膜，因而发生沉淀作用。


 有机溶剂沉淀法的优点是：
 ①分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。
 ②沉淀不用脱盐，过滤比较容易（如有必要，可用透析袋脱有机溶剂）。因而在生化制备中有广泛的应用。
 其缺点是对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。
 ⑵有机溶剂的选择和浓度的计算
 用于生化制备的有机溶剂的选择首先是要能与水互溶。沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。
 为了获得沉淀而不着重于进行分离，可用溶液体积的倍数：如加入一倍、二倍、三倍原溶液体积的有机溶剂，来进行有机溶剂沉淀。

 ⑶有机溶剂沉淀的影响因素
 1) 温度：多数生物大分子如蛋白质、酶和核酸在有机溶剂中对温度特别敏感，温度稍高就会引起变性，且有机溶剂与水混合时产生放热反应，因此必须预冷，操作要在冰盐浴中进行，加入有机溶剂时必须缓慢且不断搅拌以免局部过浓。
 一般规律是温度越低，得到的蛋白质活性越高。
 2) 样品浓度：低浓度样品回收率低，要使用比例更大的有机溶剂进行沉淀。高浓度样品，可以节省有机溶剂，减少变性的危险，但杂蛋白的共沉淀作用大。
 通常使用5mg/mL～20mg/mL的蛋白质初浓度为宜。


 3) pH值：选择在样品稳定的pH值范围内，通常是选在等电点附近，从而提高此沉淀法的分辨能力。
 4) 离子强度：盐浓度太大或太小都有不利影响，通常盐浓度以不超过5％为宜，使用乙醇的量也以不超过原蛋白质水溶液的2倍体积为宜，少量的中性盐对蛋白质变性有良好的保护作用，但盐浓度过高会增加蛋白质在水中的溶解度，降低了沉淀效果，通常是在低浓度缓冲液中沉淀蛋白质。
 沉淀所得的固体样品，如果不是立即溶解进行下一步的分离，则应尽可能抽干沉淀，减少其中有机溶剂的含量，如若必要可以装透析袋透析脱有机溶剂，以免影响样品的生物活性。

 2.3.1.3 选择性变性沉淀法
 这一方法是利用生物大分子与非目的生物大分子在物理化学性质等方面的差异，选择一定的条件使杂蛋白等非目的物变性沉淀而得到分离提纯。
 ⑴ 热变性
 利用生物大分子对热的稳定性不同，加热升高温度使非目的生物大分子变性沉淀而保留目的物在溶液中。
 ⑵ 表面活性剂和有机溶剂变性
 使那些对表面活性剂和有机溶剂敏感性强的杂蛋白变性沉淀。通常在冰浴或冷室中进行。
 ⑶ 选择性酸碱变性
 利用对pH值的稳定性不同而使杂蛋白变性沉淀。通常是在分离纯化流程中附带进行的分离纯化步骤。

 2.3.1.4 等电点沉淀法
 利用具有不同等电点的两性电解质，在达到电中性时溶解度最低，易发生沉淀，从而实现分离的方法。氨基酸、蛋白质、酶和核酸都是两性电解质，可以利用此法进行初步的沉淀分离。
 由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且带有水膜的蛋白质等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，单独使用此法分辨率较低，因而此法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起配合使用，以提高沉淀能力和分离效果。
 此法主要用于在分离纯化流程中去除杂蛋白，而不用于沉淀目的物。

 2.3.1.5 有机聚合物沉淀法
 有机聚合物是六十年代发展起来的一类重要的沉淀剂，最早应用于提纯免疫球蛋白和沉淀一些细菌和病毒。近年来广泛用于核酸和酶的纯化。其中应用最多的是
“聚乙二醇”【HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH (n ＞4)】( Polyethylene Glycol 简写为 PEG )，它的亲水性强，溶干水和许多有机溶剂，对热稳定，有广泛围的分子量，在生物大分子制备中，用的较多的是分子量为6000～20000的 PEG。
 本方法的优点是：
 ①操作条件温和，不易引起生物大分子变性。
 ②沉淀效能高，使用很少量的P“EG即可以沉淀相当多
的生物大分子。
 ③沉淀后有机聚合物容易去除。

 2.3.2 透析
 自Thomas Graham 1861年发明透析方法至今已有一百多年。透析已成为生物化学实验室最简便最常用的分离纯化技术之一。在生物大分子的制备过程中，除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析的技术。
 透析只需要使用专用的半透膜即可完成。保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为“保留液”，袋（膜）外的溶液称为“渗出液”或“透析液”。截留分子量MwCO通常为1万左右。
 用1％ BaCl2检查(NH4)2SO4，用1％ AgNO3 检查NaCl、KCl等。

 2.3.3 超滤
 超过滤即超滤，自20年代问世后，直至60年代以来发展迅速，很快由实验室规模的分离手段发展成重要的工业单元操作技术。超滤现已成为一种重要的生化实验技术，广泛用于含有各种小分子溶质的各种生物大分子（如蛋白质、酶、核酸等）的浓缩、分离和纯化。
 超滤是一种加压膜分离技术，即在一定的压力下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜，而使大分子溶质不能透过，留在膜的一边，从而使大分子物质得到了部分的纯化。

 超滤根据所加的操作压力和所用膜的平均孔径的不同，可分为微孔过滤、超滤和反渗透三种。
 微孔过滤所用的操作压通常小于4×104Pa，膜的平均孔径为500埃～14微米（1微米＝104埃），用于分离较大的微粒、细菌和污染物等。
 超滤所用操作压为4×104Pa～7×105Pa，膜的平均孔径为10—100埃，用于分离大分子溶质。
 反渗透所用的操作压比超滤更大，常达到35×105Pa～140×105Pa，膜的平均孔径最小，一般为10埃以下，用于分离小分子溶质，如海水脱盐，制高纯水等。

 超滤技术的优点是操作简便，成本低廉，不需增加任何化学试剂，尤其是超滤技术的实验条件温和，与蒸发、冰冻干燥相比没有相的变化，而且不引起温度、pH的变化，因而可以防止生物大分子的变性、失活和自溶。
 在生物大分子的制备技术中，超滤主要用于生物大分子的脱盐、脱水和浓缩等。
 超滤法也有一定的局限性，它不能直接得到干粉制剂。对于蛋白质溶液，一般只能得到10～50％的浓度。

 超滤技术的关键是膜。
 常用的膜是由乙酸纤维或硝酸纤维或此二者的混合物制成。近年来发展了非纤维型的各向异性膜，例如聚砜膜、聚砜酰胺膜和聚丙烯腈膜等。这种膜在pH 1～14都是稳定的，且能在90℃下正常工作。超滤膜通常是比较稳定的，能连续用1～2年。
 超滤膜的基本性能指标：水通量（cm3/(cm2•h)）；截留率（以百分率％表示）；化学物理稳定性（包括机械强度）等。
 超滤装置由若干超滤组件构成。分为板框式、管式、螺旋卷式和中空纤维式四种主要类型。
 由于超滤法处理的液体多数是含有水溶性生物大分子、有机胶体、多糖及微生物等。这些物质极易粘附和沉积于膜表面上，造成严重的浓差极化和堵塞，这是超滤法最关键的问题，要克服浓差极化，通常可加大液体流量，加强湍流和加强搅拌。

 2.3.4 冰冻干燥
 冰冻干燥机是生化与分子生物学实验室必备的仪器之一，因为大多数生物大分子分离纯化后的最终产品多数是水溶液，要从水溶液中得到固体产品，最好的办法就是冰冻干燥

❾ 请教离子交换层析与亲和层析方面的问题

亲和层析是通过层析介质表面键合的配基与目标物质特异性吸附，然后非目标物流穿，再改变流动相是目标物质的特异性吸附消失，从而达到纯化目的。凝胶层析是通过层析介质孔径的设定，使分子量大小相差比较大的物质通过的路径不一样，从而达到分离效果。离子交换是通过层析介质表面的带电荷的基团与目标之间产生吸附，通过改变盐浓度使吸附力的大小改变，从而使不同的物质解吸的速度不一样，达到分离的效果。离子交换又分阴离子交换和阳离子交换。一般来说以上三种，离子交换应用面最广，亲和特异性最好，体积排阻的话只能对分子量差距很明显的物质进行分离。

❿ 多糖的纯化方法与哪些

多糖纯化：
a、分部沉淀法：根据各种多糖在不同浓度的低级醇或丙酮中具有不同溶解度的性质，逐次按比例由小到大加入甲醇或乙醇或丙酮，收集不同浓度下析出的沉淀，经反复溶解与沉淀后，直到测得的物理常数恒定（最常用的是比旋光度测定或电泳检查）。这种方法适合于分离各种溶解度相差较大的多糖。为了多糖的稳定，常在pH7进行，唯酸性多糖在pH7时－COOH是以－COO` 离子形式存在的，需在pH2－4进行分离，为了防止苷键水解，操作宜迅速。此外也可将多糖制成各种衍生物如甲醚化物、乙酰化物等，然后将多糖衍生物溶于醇中，最后加入乙醚等极性更小的溶剂进行分级沉淀分离。
b、盐析法：在天然产物的水提液中，加入无机盐，使其达到一定浓度或饱和，促使有效成分在水中溶解度降低沉淀析出，与其它水溶性较大的杂质分离。常做盐析的无机盐的有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等。
c、季铵盐沉淀法：季铵盐及其氢氧化物是一类乳化剂，可与酸性糖形成不溶性沉淀，常用于酸性多糖的分离。通常季胺盐及其氢氧化物并不与中性多糖产生沉淀，但当溶液的PH增高或加入硼砂缓冲液使糖的酸度增高时，也会与中性多糖形成沉淀。常用的季铵盐有十六烷基三甲胺的溴化物（CTAB）及其氢氧化物（cetyl trimethyl ammonium hydroxide，CTA－OH）和十六烷基吡啶（cetylpyridinm hydroride，CP－OH）。CTAB或CP－OH的浓度一般为1％－10％（W/V）的多糖溶液中，酸性多糖可从中性多糖中沉淀出来，所以控制季铵盐的浓度也能分离各种不同的酸性多糖。值得注意的是酸性多糖混合物溶液的PH要小于9，而且不能有硼砂存在，否则中性多糖将会被沉淀出来
d、柱层析：
纤维素柱层析：纤维素柱层析对多糖的分离既有吸附色谱的性质，又具有分配色谱的性质，所用的洗脱剂是水和不同浓度乙醇的水溶液，流出柱的先后顺序通常是水溶性大的先出柱，水溶性差的最后出柱，与分级沉淀法正好相反。
纤维素阴离子交换柱层析：最常见的交换剂为DEAE－纤维素（硼酸型或碱型），洗脱剂可用不同浓度的碱溶液、硼砂溶液、盐溶液等。此方法目前最为常用。它一方面可纯化多糖，另一方面还适于分离各种酸性多糖、中性多糖和粘多糖。
凝胶柱层析：凝胶柱层析可将多糖按分子大小和形状不同分离开来，常用的凝胶有葡聚糖凝胶（sephadex G）、琼脂糖凝胶（sepharose bio－gel A）、聚丙烯酰胺凝胶（bio－gel P）等，常用的洗脱剂是各种浓度的盐溶液及缓冲液，但它们的离子强度最好不低于0.02。出柱的顺序是大分子的先出柱，小分子的后出柱。由于糖分子与凝胶间的相互作用，洗脱液的体积与蛋白质的分离有很大的差别。在多糖分离时，通常是用孔隙小的凝胶如sephadex G－25、G－50等先脱去多糖中的无机盐及小分子化合物，然后再用孔隙大的凝胶sephadex G－200等进行分离。凝胶柱层析法不适合于粘多糖的分离。