mRNA无菌过滤设备

㈠ 求RT-PCR 流程和注意事项

博凌科为-为你解答：RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。要求： 1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。 2. RT按要求做，一般不会出太大问题。3. PCR，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。 1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特异的下游引物。如果用a和b方法，是扩增的所有的cDNA（理论上），还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。如果用c方法，那么要去那里查它的序列呢？http://www.ncbi.nlm.nih.gov问题：在做RT-PCR遇到一怪现象，即对同一动物不同组织扩增同一段基因，结果从一种组织中可以扩出我的目的基因，条带非常的好， 而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带，尝试其他条件同样无法得到满意的结果，百思不得其解！（注：已肯定该基因在两种组织中都表达，且内参照在两种组织都可扩增出来）从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的，我测过吸光度，差异还很大，会不会和这有关呢？ 请高手指教！解答：1.RT-PCR有两种做法：条件具备的话可用kit进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推 测是体系更加单一比较利于PCR的进行，当然也可能是我买的kit不太好。（promega）。2.RT-PCR应具备的条件高质量的RNA（保留后可做5，3RACE）；引物的（最好产物短点）；若涉及粗略定量的话还应考虑RNA的浓度或是cDNA的浓度（如果 由内标分子更好，但我发现其实很不容易将RNA的浓度以及内标 分子的表达量调整的完全一样）；体系的均一性等。3.RACE我做过RACE（3RACE是宝生物的Kit；5RACE是Gibico），但现在再 进行另一个同源基因的3RACE时却怎么也P不出来，这两个基因是由同一对引物扩增出来的，其中一个已经获得了全序列（RACE的方法），而另一个基因 的3UTR却增么也扩不出来，我推测是不是该基因的3UTR太长的缘故，我都快绿了，有无 RT-PCR的常用内标b－actin 和GAPDH的使用有选择性吗？比如不同的细胞，不同的刺激。有关内参： RT-PCR内参照可以在一个管子里做（那样也是图好看一些），最好分开两管，把除了引物之外的mixture统一配，拍照后，算目的基因和内参的比值， 这就是基因表达的相对浓度。问：我曾经作过同一管的PCR，内有actin 和目的基因引物。虽然可见到两条均一条带但图片质量不理想（而且酶量、Mg2+加倍）。请教mxbdna2003 ，你是如何处理同一管的PCR的各成分的浓度？答： it should determined the amount of RNA. but it not for the quantitity of the PCR. it just was convienent to guess the amount ot the template(for RT and PCR) and bettrer for publication and editor if he don not know the preocere much. but the amount just using accurate piptte is wrong. it shoud be remembered to do the inner control of housekeeping gene everytime. 在同一管中做RT，其实没有什么问题，不需要taq魅加量，taq酶本来就是过量的^-^，（平时做pcr的时候，完全可以再省一些taq酶的，半斤八两 就可以了，我想这肯定再很多贴子里应该都谈到了。Mg就跟不能变了，一变整个体系就变了。能看到均一条带就很好了。关键是摸，十八摸（太少，只争朝夕，开个玩笑）虽然用不着，但是摸上3、5摸总是必要的，首先遥分开摸，然后再一起摸，直到摸的好了，还要考虑比较的不同 的模板中的量，所以我们不建议再同一管中进行，因为还有互相竞争抑制的问题，即使 不同基因之间。有关内参的建议：一定要做内参的，每一次，我想。不作内参的结果是不可信的电泳可以不一起跑，没有关系，计算的是相对表达程度，着 我在好几封帖子里都谈了，再说一边我得观点，1、半定量和定量RT-PCR做的都是基因相对表达量，不是绝对表达量，除非你能准确知道来自多少细胞，但是 细胞还有死的呢。2、以电泳为基础的半定量RT-PCR本身是不可信的，作为实验的粗筛是可以的，但不能作为最终结果的，3、半定量RT-PCR应该再两 管中进行，除非内参基因和目的基因表达相同，长度差不多，GC含量相似，或者实在穷的要省PCR管和taq。关于平台期和线性期的问题，实际上线性期是指数期，只不过碰巧2的冥和2的倍数是相同的。看上去任何一个时期都可以，实际上是不对的，因为牵涉到酶促动力 学的问题，这个我也不懂，有一些专门的文章，好像，涉及到很多化学的东西。我们学医的，也没必要知道那些，但是其中主要是因为模板引物酶原料和 buffer之间的关系，这种反应单靠改变其中一种成分没有用的，酶一直是过量，再加酶也没用，引物ntp都是这样。烟鬼正传，最好选线性期的开始阶段， 但是要在你的凝胶成像分辨范围内，所以选一个这两种的契合点。给你一张图你就明白了，再开始的时候酸的是切线，这图我在 *** 帖过。关于引物设计，再可能的情况下，除了常规要求之外，最好兼顾跨内含子（不过，根据要求，还可以专门设计隔内含子的，这样还可以用于基因组PCR）、长度小于500bp－600bp等等。引物当然要设计成一样的退火温度，即使不再一管中，也要一样的，要在一台机器里啊。我的引物占了冰箱一格，大部分是一个温度，这样任何几个都可以拿来披， 也不用查。我反复说过了，别用软件，就用眼睛看，软件涉及的在好，有些基因在它出软件 的时候，还没发现呢，跟不要说在基因组的位置和序列了，怎么考虑内含子的问题呢？ 18s的引物也和著名的actin一样是设计的，只要拿到序列就可以了，但是限制是只能用总RNA为模板，但是比actin和bubulin等可准多 了，更不要说GAPDH这个破烂了。18s除了在细胞中更相同（量）外，主要是它占的比例远远高于看家基因，所以定量更加准确，我想，不知对不对，请几位 主任和eeflying指教。我认为，就像你用某一种东西的数量去概括，因该选那种多的东西，说一座房子是由2000块砖造成的，比说又29根梁更准确 吧。更不要说没有看家基因不看家的缺点，因为他是服务于整个基因组表达谱什么的。PE有专门的用于实时PCR的内参试剂盒，就是用18s，不过我们看懂使用的那条序列，不 知有没有人用过，告知其序列和genbank号。正好问一下，我查了一些序列，一直没有去合成，主要是因为手上的actin的荧光探针还没有完，当初和成了一堆。有那位高手用过18s的内参，请问您的序列（我指的是模板的序列）？原位杂交最好用RNA做探针，效果好一些，反正你有钱卖roche的盒子，而且量也能保证，因为转录过程嘛，沿着一条线突突地跑就是了。正义反义也容易理 清。我觉得做RT-PCR的方法和条件及应注意的事项就是那么几条,许多专业书都有详细的描述,但是许多人还是历经多次磨难，有时就是得不出结果。因此，我认 为因为每个人所要克隆的片断不同，引物不同等，因此对不同的人来说还是有 他自己的特殊性,我的以下经历说明：做实验时各人的情况不同,做不出时还是要好好动一下脑子。记得我开始我的RT－PCR时，按常规方法，提取总RNA后，首先用自己设计的下游引物进行逆转录，不断改变反应条件，进行了N次均没有结果。后来考虑到 本人的克隆的PCR的片断位于我们实验另一位同学克隆的片断当中，而该同学已经用RT-PCR克隆出她的片断（尽管她用这些RT－PCR产物做模版再进行 PCR时也没办法重复出她的产物），因此，我先用她的引物和条件扩增出她的片断，然后用她的RT－PCR产物作模板（有点改进，逆转录反应换用了 9mers随机引物），用我的引进物进行一般PCR，终于得到我的产物，测序结果完全正确。尽管我的这个经历别人很人遇到，但足可以说明实验可以有自己的 模式，书本的知识和别人的经验很重要，但有时也不定要受到书本框框和别人经验的限制请问： 1 引物的特异退火温度怎样设定？可以根据gc 和at含量算出吗？可以用引物报告单上的Tm值吗？ 2 PCR时20微升体系中cDNA应加多少比较合适？MgCl2应加多少？各个成分的量有无确定标准？ 3 PCR结果跑电泳，actin有，但跑不出目的条带，有几种原因？与cDNA的量少有关吗？Mg离子太多是否会抑制Taqase的活性？一般来说引物报告单伤得是对的,也可以自己算,实际上重要的各条引物一致,剩下的可以摸的. 20中是指体积还是量?只要不明显改变体系的离子强度,加1,2ul都可以的.mg要调的,但我总觉得没有书里讲的那么玄乎,我都是常年不变的. 如果内参照有,目的没有,至少证明不是美丽惹的祸.原因书里应该都说了. 在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。由于RNA酶广泛存在而稳 定，一般反应不需要辅助因子。因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解，而所制备的RNA的纯度和完整 性又可直接影响RNA分析的结果，所以RNA的制备与分析操作难度极大。在实验中，一方面要严格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染。这些外 源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中则含有大量 内源性的RNA酶。一、 防止RNA酶污染的措施 1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。 2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。 3. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。 4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的 无菌双蒸水配制，然后经0.22m滤膜过滤除菌。 5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。 6. 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。二、常用的RNA酶抑制剂 1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。 2. 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强 烈的变性作用。 3. 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。 4. RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结 合，使其失活。 5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。 mRNA的分离与纯化真核细胞的mRNA分子最显著的结构特征是具有5端帽子结构（m7G）和3端的Poly(A)尾巴。绝大多数哺乳类动物细胞mRNA的3端存在 20-30个腺苷酸组成的Poly（A）尾，通常用Poly（A+）表示。这种结构为真核mRNA的提取，提供了极为方便的选择性标志，寡聚（dT）纤维 素或寡聚（U）琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的理论基础就在于此。 mRNA的分离方法较多，其中以寡聚（dT）-纤维素柱层析法最为有效，已成为常规方法。此法利用mRNA 3末端含有Poly（A+）的特点，在RNA流经寡聚（dT）纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或 在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱，经过两次寡聚（dT）纤维柱后，即可得到较高纯度的mRNA。寡聚(dT)纤维素柱纯化mRNA 一、试剂准备 1．3M醋酸钠（pH 5.2） 2．0.1M NaOH 3．1上样缓冲液：20mM Tris-HCl(pH 7.6)；0.5M NaCl；1M EDTA（pH 8.0）；0.1%SLS(十二烷基氨酸钠。配制时可先配制Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA（pH 8.0）的母液，经高压消毒后按各成分确切含量，经混合后再高压消毒，冷却至65℃时，加入经65℃温育（30min）的10%SLS至终浓度为0.1%。 4．洗脱缓冲液：10mM Tris-HCl(pH 7.6)；1mM EDTA(pH 8.0)；0.05% SDS 5．无水乙醇、70%乙醇 6．DEPC 二、操作步骤 1．将0.5-1.0g寡聚（dT）-纤维悬浮于0.1M的NaOH溶液中。 2．用DEPC处理的1ml注射器或适当的吸管，将寡聚（dT）-纤维素装柱0.5-1ml，用3倍柱床体积的DEPC H2O洗柱。 3．使用1上样缓冲液洗柱，直至洗出液pH值小于8.0。 4．将RNA溶解于DEPC H2O中，在65℃中温育10min左右，冷却至室温后加入等体2上样缓冲液，混匀后上柱，立即收集流出液。当RNA 上样液全部进入柱床后，再用1上样缓冲液洗柱，继续收集流出液。 5．将所有流出液于65℃加热5min，冷却至室温后再次上柱，收集流出液。 6．用5-10倍柱床体积的1上样缓冲液洗柱，每管1ml分部收集，OD260测定RNA含量。前部分收集管中流出液的OD260值很 高，其内含物为无Poly(A)尾的RNA。后部分收集管中流出液的OD260值很低或无吸收。 7．用2-3倍柱容积的洗脱缓冲液洗脱Poly(A+)RNA，分部收集，每部分为1/3-1/2柱体积。 8．OD260测定Poly(A+)RNA分布，合并含Poly(A+)RNA的收集管，加入1/10体积3M NaAc（pH5.2）、2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-20℃放置30min。 9．4℃离心，10000g15min，小心吸弃上清。用70%乙醇 洗涤沉淀。[注意：此时Poly(A+)RNA的沉淀往往看不到]。4℃离心，10000g5min，弃上清，室温晾干。 10. 用适量的DEPC H2O溶解RNA。三、注意事项 1．整个实验过程必须防止Rnase的污染。 2．步骤（4）中将RNA溶液置65℃中温 育然后冷却至室温再上样的目的有两个，一个是破坏RNA的二级结构，尤其是mRNA Poly(A+)尾处的二级结构，使Poly(A+)尾充分暴露，从而提高Poly(A+)RNA的回收率；另一个目的是能解离mRNA与rRNA的结 合，否则会导致rRNA的污染。所以此步骤不能省略。 3．十二烷基肌氨酸钠盐在18℃以下 溶解度下降，会阻碍柱内液体流动，若室温低于18℃最好用LiCl替代NaCl。 4．寡聚（dT）-纤维素柱可在4℃贮 存，反复使用。每次使用前应该依次用NaOH、灭菌 ddH2O、上样缓冲液洗柱。 5．一般而言，107哺乳动物培养细胞能提取1-5g Poly(A+)RNA，约相当于上柱总RNA量的1%-2%。RNA酶保护试验((RNase Protection Assay,RPA)是通过液相杂交的方式,用反义RNA探针与样品杂交，以检测RNA表达的技术。与Northern杂交和RT-PCR比 较，RPA有以下几个优点： 1． 检测灵敏度比Northern杂交高。由于Northern杂交步骤中转膜和洗膜都将造成样品和探针的损失，使灵敏度下降，而RPA将所有杂交体系进行电 泳，故损失小，提高了灵敏度。 2． 由于PCR扩增过程中效率不均一和反应平台问题，基于PCR产物量进行分析所得数据的可靠性将下降，而RPA没有扩增过程，因此，分析的数据真实性较 高。 3． 由于与反义RNA探针杂交的样品RNA仅为该RNA分子的部分片段，因此，部分降解的RNA样品仍可进行分析。 4． 步骤较少，耗时短。与Northern杂交相比，省去了转膜和洗膜的过程。 5． RNA-RNA杂交体稳定性高，无探针自身复性问题，无须封闭。 6． 一个杂交体系中可同时进行多个探针杂交，无竞争性问题。 7． 检测分子长度可以任意设置，灵活性大。 RPA的缺点是需要同位素标记探针。一、试剂准备 1． GACU POOL：取100mM ATP、CTP、GTP各2.78l、100mM UTP 0.06l，加DEPC H2O至100l。 2. 杂交缓冲液 IPES 0.134g、0.5M EDTA（pH8.0）20l、5M NaCl 0.8ml、甲酰胺8ml，加DEPC H2O至10ml。 3. RNase消化液：5M NaCl 120l、1M Tris-HCl(pH7.4) 20l、0.5M EDTA（pH8.0）20l、RNase A(10mg/ml) 8l、RNase T1(250U/l) 1l，加DEPC H2O至2ml 二、操作步骤 1．反义RNA可由含T7或SP6启动子的重组质粒为模板制备，也可以用含启动子的PCR产物为模板制 备，本文介绍后者。（1）设计含T7启动子的PCR引物由于PCR产物将作为合成反义RNA的模板，所以一对引物中的下游引物5-端要含T7启动子序列:T7启动子序列为：5-TAATACGACTCACTATAGGG 引物设计的其他要求与一般PCR引物的设计相同。PCR产物的长度决定了反义RNA探针的长度，具体设计时可考虑100-400bp长。最好采用巢式 PCR，即先扩增出一较长的片段，再以该片段为模板扩增出较短的片段，以保证探针的特异性，如下图所示：上游引物下游引物Ⅱ T7 启动子序列下游引物Ⅰ（2）PCR 先用上游引物和下游引物Ⅰ进行PCR，再以PCR 产物为模板,用上游引物和下游引物Ⅱ-T7进行二次PCR(具体操作参见PCR章节)。（3）探针合成标记与纯化在0.5ml 离心管中加入下列试剂： RNasin （40U/l） 0.5lGACU POOL GAC（含GTP、CTP、ATP各2.75 mM,UTP 61M） 2l[-32P]UTP(10Ci/l) 2.5lDTT (二硫苏糖醇，0.1M) 1l5转录 buffer 2l模板（50ng/l） 1lT7 RNA 聚合酶 (15U) 1l混合后，短暂离心，37OC保温1hr。加入DNaseⅠ（10U/l）1l, 37OC 15min, 然后75 OC 10min以灭活DNAseⅠ和T7 RNA 聚合酶。加入：饱和酚 50l氯仿 50l酵母tRNA（2g/l） 4lDEPC H2O 100l室温下充分混匀，离心10000g2min。取上层液置另一0.5 ml离心管中，加入100l氯仿，混匀，离心10000g2min。将上层液转移至另一0.5ml 离心管中，再加入3M NaAc 10l、预冷无水乙醇250l，混匀后，-20OC静置30min。4OC离心13500g10min。弃上清液，沉淀用75%乙醇100l洗 涤，4OC离心13500g2min, 弃上清液。室温下挥发残留乙醇。加入50l杂交缓冲液溶解沉淀，4OC下保存待用。可用尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测探针质量。（参见本节电泳步 骤）。2．杂交（1） RNA提取后溶解在杂交缓冲液中，浓度为1g/l。（2）取8l RNA加入1-3l探针（根据探针检测结果调整）于0.5ml 离心管中。（2） 80OC保温2min，然后40-45OC下杂交12-18hr。3. 消化(1) 杂交管于37 OC保温15min，加入RNase消化液，37 OC保温30min。(2) 加入10%SDS 10l、10g/l蛋白酶K 20l，混匀，37 OC保温10min。(3) 加入65l饱和酚和65l氯仿，混匀，室温离心，10000g2min。(4) 转移上层液到另一0.5离心管中，加入10l酵母tRNA和3M NaAc 15l，再加入200l异丙醇，混匀后，置-20OC 30min，4 OC离心,135000g10min。(5) 弃上清液，室温下挥发乙醇，加入5-8l上样缓冲液溶解沉淀。4、电泳与放射自显影（1）配制凝胶：(50ml)40%丙烯酰胺-亚甲双丙烯酰胺（19：1） 6.25ml 5TBE 10ml 尿素 24g 加H2O至50ml 溶解后加入25%过硫酸胺50l，TEMED 50l，混匀，注入电泳槽中，插入梳，待胶凝固。（2）预电泳以1TBE为上下槽电泳缓冲液，加上电压后进行预电泳，如果用测序电泳装置，电压应达2000v以上，功率设定为100w，温度设为50 OC。待胶板温度达50 OC时，暂停电泳，准备加样。（3）加样将已溶解在加样缓冲液中的样品80 OC加热2min，立即加样到胶孔中，电泳1-2hr。（电泳条件同预电泳）。（3） 电泳结束后，打开胶板，用滤纸取下胶，覆上一层保鲜膜，放置于暗盒中，暗室红光下，压上一张X片，盖上暗盒，-70OC曝光1-3天。暴光结束后，将X光 片显影、定影、水洗、晾干。三、注意事项1．本实验大部分为RNA操作，注意RNA酶的污染。2．RNase消化液消化未杂交的单链RNA和探针RNA，当探针与样品之间有碱基错配时，错配位点也将被消化，因此会产生片段较小的杂交片段。因此进 行PCR时，采取尽量减少错配的措施。 3、 同位素对RNA合成有一定影响，有时会产生非全长的探针。因此，标记时间不宜过长。 4、 RNase消化液有时会产生过度消化而无检测信号，可以将消化液稀释10-100倍后使用。可能问题出在标本的保存：一般四小时之内就应处理，分离出细胞说的是套式PCR,可以在你的第一次PCR两个引物内,再设计一对引物进行第二次PCR就行了如果你的第一次PCR刚好包括目的片段,那只好设计个更长的了第二次的引物设计要求可以低一点以50l体系为例引物各1l 第一次PCR产物5l 二次PCR和巢式PCR，即设计两对引物进行扩增，不是一个概念，它是拿第一次的PCR产物，稀释100-1000倍做模板，加入底物，从新进行扩增反 应，以期增加产物的量我做RT-PCR时,提总RNA时,都是用灭菌DEPC水,按1:100稀释后测OD260和OD280,后根据公式:RNA浓度=OD260*稀释度 /25(ug/ul),后用1mg total RNA分离mRNA.做逆转录及PCR,效果很好. luoyu10 wrote: 各位大哥：我有一个问题请教，RT-PCR要求模板RNA的260nm/280nm的比值最低为多少，如果太低是不是会影响结果？最低到1.8，最好2.0，我感觉稍微低一点影响不算太大。问：我是RT－PCR的新手，想请教引物如何设计？好的引物所具有的令人满意的特点： *典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着 更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。 *选择GC含量为40％到60％或GC含量反映模板GC含量的引物。 *设计5端和中间区为G或C的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。 *避免引物对3末端存在互补序列，这会形成引物二聚体，抑制扩增。 *避免3末端富含GC。设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。 *避免3末端的错误配对。3端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。 *避免存在可能会产生内部二级结构的序列，这会破坏引物退火稳定性。目的序列上并不存在的附加序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物5端而不影响特异性。当计算引物Tm值时并不包括这些序列，但是应该对其进行互 补性和内部二级结构的检测。有时候，仅有有限的序列信箱可供用于引物设计。比如，如果仅知道氨基酸序列，可以设计简并引物。简并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同 序列的混合物。为了增加特异性，可以参考密码子使用表，根据不同生物的碱基使用偏好，减少简并性。次黄嘌呤可以同所有的碱基配对，降低引物的退火温度。不 要在引物的3端使用简并碱基，因为3端最后3个碱基的退火足以在错误位点起始PCR。使用较高的引物浓度（1M到3M），因为许多简并混合物中的 引物不是特异性针对目的模板。【经验】如何确认RNA的质量各位都知道，提取到质量良好的RNA（包括总RNA和mRNA，以下同）是非常困难，关于RNA的提取技术，我就不说了，为什么呢？或许各位非常关心呢， 我是这样想的，我可以看到的资料或者是厂家的说明书，各位也同样可以看到的，内容当 然都是一样的了，所以实验做的好不好，主要是心的投入多少的问题，所以希望大家自己多多思考啊！以下两种方法，相信大家都知道的： 1）检测RNA溶液的吸光度 280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。一般的，我们只看 OD260/OD280（Ratio，R）。 1.82.0时，我们认为RNA中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的，不过要注意，当你用Tris作为缓冲液检测吸光度时，R值可能会大于2（一般 应该是2.2的）。当R1.8时，溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显，你可以根据自己的需要决定这份RNA的命运。当 R2.2时，说明RNA已经水解成单核酸了。如果RNA的量够，可在260nm（A260）用分光光度法测定RNA的得率，1个单位等于40ug/mlssRNA。纯RNA的A260/A280的比 值为2.0。A260/A230的比值还表明RNA的纯度，其值小于2.0表明裂解液中有亚硫氰胍和belta-巯基乙醇残留，其值大于2.4，需用乙酸 盐，乙醇沉淀RNA。 2）RNA的电泳图谱一般的，RNA的电泳都是用变性胶进行的，但是根据我的经验，如果你仅仅是为了检测RNA的质量是没有必要进行如此麻烦的实验的，用普通的琼脂糖胶就可以 了。电泳的目的是在于检测28S和18S条带的完整性和他们的比值，或者是mRNA smear的完整性。一般的，如果28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利（指条带的边缘清晰），并且28S的亮度在18S条带的两倍以上，我们认为 RNA的质量是好的（见下图）。以上是我们常用的两种方法，但是这两种方法都无法明确的告诉我们RNA溶液中有没有残留的RNA酶。如果溶液中有非常微量的RNA酶，用以上方法我们很难 察觉，但是大部分后续的酶学反应都是在37度以上并且是长时间进行的。这样，如果RNA溶液中有非常微量的RNA酶，那么在后续的实验中就会有非常适合的 环境和时间发挥它们的作用了，当然这时你的实验也就完了。下面，我们介绍一个可以确认RNA溶液中有没有残留的RNA酶的方法。 3）保温试验方法很简单的，按照样品浓度，从RNA溶液中吸取两份1000 ng的RNA加入至0.5 ml的离心管中,并且用pH7.0的Tris缓冲液补充到10 ul的总体积，然后密闭管盖。把其中一份放入70℃的恒温水浴中,保温1 h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1 h。时间到了之后，取出两份样本进行电泳。电泳完成后，比较两者的电泳条带。如果两者的条带一致或者无明显差别（当然，它们的条带也要符合方法2中的条件）， 则说明RNA溶液中没有残留的RNA酶污染，RNA的质量很好。相反的，如果70℃保温的样本有明显的降解，则说明RNA溶液中有RNA酶污染。如果你的RNA样本通过了保温实验的检测并且你在后续的实验中还是非常小心的防范RNA酶的骚扰，那么你的实验应该是很难失败了！

㈡ mRNA提取注意事项

1．RNA的提取

RNA的提取其实原理很简单：通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。但是由于RNA酶无处不在，随时可能将RNA降解，所以实验中有很多地方需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。

1．1 分离高质量RNA

成功的cDNA合成来自高质量的RNA。高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。RNA的质量决定了你能够转录到cDNA上的序列信息量的最大值。一般的RNA纯化方法是使用异硫氰酸胍／酸性酚的一步法。

一般不必使用oligo(dT)选择性分离poly(A)+RNA。不管起始模板是总RNA还是poly(A)+ RNA，都可以检测到扩增结果。另外，分离poly(A)+RNA会导致样品间mRNA丰度的波动变化，从而使信息的检出和定量产生偏差。然而，当分析稀有mRNA时，poly(A)+RNA会增加检测的灵敏度。

1．2 RNA提取的最大影响因素-RNA酶

在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定，可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等，RNA酶催化的反应一般不需要辅助因子。因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以RNA的制备与分析操作难度极大。

在实验中，一方面要严格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染。这些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。

1．3 常用的RNA酶抑制剂

*焦碳酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。

*异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。

*氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。

*RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。

*其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。

1．4 防止RNA酶污染的措施、RNA提取之前需要注意和准备的工作

*尽可能在实验室专门辟出RNA操作区，离心机、移液器、试剂等均应专用。RNA操作区应保持清洁，并定期进行除菌。

*操作过程中应始终戴一次性橡胶手套和口罩，并经常更换，以防止手、臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNase带入各种容器内或污染用具。尽量避免使用一次性塑料手套。塑料手套不仅常常给操作带来不便，而且塑料手套的多出部分常常将器具有RNase处传递到RNase-free处，扩大污染。

*尽量使用一次性的塑料制品，避免共用器具如滤纸、tips、tubes等，以防交叉污染。例如，从事RNA探针工作的研究者经常使用RNase H、T1等，在操作过程中极有可能造成移液器、离心机等的污染。而这些污染了的器具是RNA操作的大敌。

*关于一次性塑料制品，建议使用厂家供应的出厂前已经灭菌的tips和tubes等。多数厂家供应的无菌塑料制品很少有RNase污染，买来后可直接用于RNA操作。用DEPC等处理的塑料制品，往往由于二次污染而带有RNase，从而导致实验失败。

*所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。

*无法用DEPC处理的用具可用氯仿擦拭若干次，这样通常可以消除RNase的活性。

*配制溶液用的乙醇、异丙醇、Tris等应采用未开封的新瓶装试剂。

*塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。

*有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。

*配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。

1．5 RNA提取的一般步骤

RNA提取的一般步骤是：破碎组织→分离RNA→沉淀RNA→洗涤RNA→融解RNA→保存RNA

破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行，可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎组织，加入β-ME可以抑制RNA酶活性。

分离RNA一半用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，经过此步，离心，RNA一般分布于上层，与蛋白层分开。

沉淀RNA一般用乙醇、3M NaAc（pH-5.2）或异丙醇。

洗涤RNA使用70％乙醇洗涤，有时，为避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解。

融解RNA一般使用TE。

保存RNA应该尽量低温。为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。另外，长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaAc至0.3M，12,000×g离心5分钟。

1．6RNA抽提新方法-TRIZOL法

TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。

TRIZOL是有毒物，接触皮肤或者不慎吞服，会导致灼伤，一旦接触皮肤后立即以大量的洗涤剂和清水清洗。TRIZOL在室温下能稳定保存12个月。尽管如此，为达到最佳效果，建议保存在2-8°C的环境下。

㈢ 如何提取mrna

1 细胞总RNA的提取
1）、6孔板细胞（CNE-2）汇合度为90-100%时,取出无菌室,去其上清,用PBS洗两次后,每孔加TRIZOL试剂（Gibco公司） 1 ml,摇匀,无菌罩内消化3-5分钟（观察：液体变粘稠,细胞脱壁）.
2）、将各孔内消化好的细胞裂解液吸到一DEPC处理过的1.5 ml EP管中,加新开的氯仿0.2 ml,轻摇15秒.
3）、室温静置2-3分钟后,12000 rpm,15 min,4℃,离心.然后取上清无色水相（约0.6 ml）到 EP管（DEPC处理过）,加0.5 ml新开的异丙醇,室温下静置10分钟.
4）、12000 rpm,10分钟,4℃,离心.观察总RNA在管底的白色沉淀,弃去上清（小心别丢了沉淀）,75%乙醇1.0 ml洗涤（用DEPC水新配制）后,7500 rpm,5 min,4℃离心.
5）、去上清,点离,用小Tip吸干液体.气干沉淀5-10分钟,DEPC处理水20-30 ul加入,中枪打匀,55-60℃水浴10分钟溶解总RNA,测OD值.
6）、电泳.
2 从总RNA中分离mRNA（Oligotex mRNA Mini Kit,Cat.no.:70022,QIAGEN）
1）、取上述提取的总RNA若干（少于0.25 mg）到一个新的无RNase 的EP管中,用无RNase的水定容到250 ul.
2）、加入Buffer OBB 250 ul,Oligotex Suspension 15 ul.用Tip打匀或用手弹匀.
3）、70℃水浴,3分钟（裂解RNA的二级结构）.
4）、20-30℃条件下,静置10分钟（让Oligotex与mRNA结合）.
5）、高速离心2分钟,小心吸走上清（该上清要保留）,留下约50 ul的上清在原管里.
6）、用Buffer OW2 400 ul重悬含Oligotex/mRNA复合物的沉淀,然后将这些加到套有1.5 ml EP管的SPIN柱子上,高速离心1分钟.
7）、将SPIN柱子移到一个新的EP管上,加Buffer OW2 400 ul到柱子,高速离心1分钟,丢掉滤过液.
8）、将SPIN柱子移到一个新的EP管上,加20-100 ul热的（70℃）Buffer OEB到柱子上,用Tip来回吸打3-4次,高速离心1分钟.
9）、为保证最大的 mRNA产量,可再次重复第8步.
10）、电泳.
RNA提取的原理就是核酸在异丙醇中的溶解度很低!其他步骤都是防止RNA降解和使RNA从细胞中溶出.
逆转录过程请看参考资料.

㈣ 求援 生物竞赛试题

2010全国中学生生物学联赛预赛试题
答题时间：90分钟 分 数：120分
一、单项选择题(每小题1分，共80分。每小题只有一个答案是正确的)
1．俗话说：“一树结果，有酸有甜。”这说明生物体具有： ( )
A．适应性 B．应激性 C．遗传性 D．变异性
2．人的咽与几个腔道相通 ( )
A．2个 B．4个 C．5个 D．6个
3．生活在海洋中的鳄鱼，捕食猎物时流眼泪的原因是： ( )
A．一种感情流露 B．眼眶上部的盐腺排出多余的盐分
C．用眼泪冲洗赃物 D．受刺激而流泪
4．调节人体基本生命活动的中枢存在于 ( )
A．大脑 B．小脑 C．脑干 D．脊髓
5．一个心动周期中，从房室瓣关闭到动脉瓣关闭的时间相当于 ( )
A．一个心动周期 B．半个心动周期 C． 5／8心动周期 D．心缩期
6．医生由人的消化道中取出一些液体，经化验确定其中含有蛋白质、多肽、维生素、无机盐、水等，最大可能是由人消化道哪一部分取出的? ( )
A．胃幽门 B．降结肠 C．大肠下段 D．大肠上段
7．人在寒冷的环境中不自主的打寒战，下列叙述中不正确的是 ( )
A．体内产热成倍高于散热 B．人体防止体温下降的重要反应
C．骨骼肌的剧烈运动 D．由于神经系统的作用
8．皮肤划破后流出血液，说明至少划到 ( )
A．表皮 B．真皮 C．皮下脂肪 D．肌肉
9．大气和饮水被污染时，可以引起人的牙齿和骨骼变酥，引起这种污染的元素是 ( )
A．H B．F C．Hg D．S
10．具有梯状神经系统的动物体内有 ( )
A．原体腔 B．真体腔 C．二个胚层 D．三个胚层
11．下列哪种植物的受精离不开水 ( )
A．卷柏 B．侧柏 C．雪莲 D．银杏
12．下列哪种动物利用伪足来摄取食物 ( )
A．草履虫 B．水螅 C．变形虫 D．血吸虫
13．鸟类的双重呼吸是指 ( )
A．幼体用鳃呼吸，成体用肺呼吸 B．用肺和皮肤进行呼吸
C．在吸气和呼气都能进行气体交换 D．同时用口和鼻进行呼吸
14．牛的胃分为四室，其中能分泌消化液的是 ( )
A．瘤胃 B．蜂窝胃 C．重瓣胃 D．皱胃
15．鸭嘴兽具有哺乳类的特征之一是 ( )
A．胎生 B．哺乳 C．体温恒定 D．具有泄殖腔孔
16．下列不是果实的是 ( )
A．麦粒 B．棉桃 C．花生米 D．葵瓜子
17．三朵油菜花和四朵大豆花共有花瓣、雄蕊和雌蕊的数目分别是 ( )
A．32、64、7 B．32、58、7 C．31、55、10 D．31、52、11
18．被子植物中，哪一科最大? ( )
A．十字花科 B．豆科 C．菊科 D．禾本科
19．花生壳是由下列哪一部分发育成的 ( )
A．胚珠 B．子房壁 C．花托 D．花萼
20．白菜的果实是 ( )
A．角果 B．荚果 C．瘦果 D．颖果
21．青蛙的血液循环是 ( )
A．单循环 B．双循环 C．不完全双循环 D．开管式循环
22．我国特有的古代分布广泛的珍贵裸子植物是 ( )
A．水杉、银杏、珙桐 B．水杉、方杉、银杉
C．古松、杉、木桫椤 D．水杉、银杏、银杉
23．地球上第一个揭开细菌奥秘的人是 ( )
A．虎克 B．巴斯德 C．白求恩 D．弗莱明
24．下列哪一类植物占地球上的光合作用近90％ ( )
A．藻类 B．蕨类 C．裸子植物 D．被子植物

25．下列是人体细胞中两种重要有机物B、E的元素组成及相互关系图。关于此图的叙述
正确的是： ( )
①E→G发生的场所是细胞核
②G→B发生的场所是细胞质
③B具有多种重要功能是由于b的种类、数目和排列次序不同
④B具有多种重要功能是因为E的排列次序不同
⑤E在氯化钠中的溶解度是随着氯化钠浓度的变化而变化的
A①② B①②③⑤ C①②④⑤ D①②③④⑤
26．丙氨酸和苯丙氨酸混合后，在一定条件下生成的二肽有 ( )
A．2种 B．3种 C．4种 D．5种
27．狼体内有a种蛋白质，20种氨基酸；兔体内有b种蛋白质，20种氨基酸。狼捕食兔后，狼体内的一个细胞中含有蛋白质种类和氨基酸种类最可能是 ( )
A．a+b，40 B．a，20 C．大于a，20 D．小于a，20
28．长期营养不良，血浆蛋白质降低，会引起组织水肿，这是因为 ( )
A．血浆渗入组织液的速度降低 B．淋巴生成率降低
C．组织液回渗速率降低 D．淋巴循环受阻
29．蛋白质空间结构形成的主要场所 ( )
A．核糖体 B．内质网 C．高尔基体 D．细胞质基质
30．用斐林试剂可以鉴定还原性糖的存在，用双缩脲试剂可以鉴定蛋白质的存在，医学上，还常用上述两种试剂进行疾病的诊断。能够诊断的疾病是
A．糖尿病、肠炎B．糖尿病、胃炎C．糖尿病、肾炎D．肾炎、胃炎
31．某细菌能产生一种“毒性肽”，分子式为C55H70O19N10，将它彻底水解后，只能得到下列四种氨基酸，甘氨酸(C2H5O2N)，丙氨酸(C3H7O2N)，苯丙氨酸(C9H11O2N)，谷氨酸(C5H9O4N)。则参与该毒性肽合成的谷氨酸分子数和控制该毒性肽合成的基因至少含有的碱基数分别为 ( )
A．4，60 B．3，30 C．4，30 D．3，60
32．小麦体内的遗传物质彻底水解后，可得到 ( )
A．一种五碳糖 B．四种脱氧核苷酸 C．五种含氮碱基 D．八种核苷酸

33．在水稻叶肉细胞的细胞质基质、线粒体基质和叶绿体基质中，产生的主要代谢产物分别是 ( )
A．丙酮酸、二氧化碳、葡萄糖 B．丙酮酸、葡萄糖、二氧化碳
C．二氧化碳、丙酮酸、葡萄糖 D．葡萄糖、丙酮酸、二氧化碳
34．下图表示淀粉的一段，数字对应的“—”表示单糖之间的化学键，则淀粉酶发挥作用的位置可能是

A．1处 B．1,3,5处 C．任何一处 D．2、4、6处
35．将4片牛肉片分别置于等量的不同种消化液中，消化速度最快的是( )
A．20mL胃液 B．10mL胃液和10mL胰液
C．20mL胰液 D．10mL肠液和10mL胰液
36．人吃了鸡蛋后最终代谢产物是 ( )
A．氨基酸 B．二氧化碳、水、尿素
C．二氧化碳、水、氨 D．二氧比碳、水、尿素、无机盐
37．人体剧烈运动时，骨骼肌呼吸作用的产物是 ( )
A．二氧化碳、水、乳酸B．乳酸 C．酒精、二氧化碳 D．二氧化碳、水
38．当人体内胰岛素分泌不足时 ( )
A．蛋白质合成增加，葡萄糖利用增加 B．蛋白质合成增加，葡萄糖利用减少
C．蛋白质合成减少，葡萄糖利用增加 D．蛋白质合成减少，葡萄糖利用减少
39．将某植物细胞置于大于该细胞细胞液浓度的硝酸钾溶液中，一段时间后在显微镜下观察，发现该细胞未发生质壁分离，其原因是可能该细胞 ( )
①是死细胞 ②是根尖分生区细胞 ③过度失水 ④过度吸水
⑤质量分离后又自动复原 ⑥是动物细胞
A．①②③⑥ B．①②⑤⑥ C．②③⑤⑥ D．②③④⑤
40．棉农为了获得高产，往往采取 ( )
A．及早摘除侧芽 B．适时摘除顶芽 C．抑制植株长高 D．多施氮肥
41．一分子NADP+成为一分子NADPH，接收的电子和质子的数目是 ( )
A．1、1 B．1、2 C．2、1 D．2、2
42．特殊状态的叶绿素a的电子激发后，电子的直接受体是 ( )
A．传递电子的物质 B．NADP+ C．H2O D．NADPH
43．叶绿体中色素的直接作用是 ( )
①吸收光能②传递光能③转化光能④分解水⑤合成ATP
A.①②③④⑤ B.①②③④ C.②③④⑤ D.①②③
44．CO2含量过高时，光合作用强度减弱最可能的原因是 ( )
A.CO2浓度过高，抑制了植物的光合作用 B.CO2浓度过高，抑制了植物的呼吸作用
C.CO2浓度过高，抑制了植物的光反应 D.CO2浓度过高，抑制了植物的暗反应
45．生物体自身代谢可产生水，是体内水分的来源之一。在下列几种酶催化的化学反应中，有水生成的是 ( )
A.ATP合成酶 B.谷丙转氨酶 C.肠肽酶 D.脂肪酶
46．在人体发育和新陈代谢中起重要作用，被人们称为生命元素的是 ( )
A.Zn B.Fe C.Ca D.I
47．某人喜欢晒太阳，但却经常出现抽搐，那么应建议他服用哪种物质( )
A维生素D B生理盐水 C糖水 D钙片
48．动物在饥饿状态下，组织内最稳定的物质是 ( )
A.血糖 B.糖元 C.氨基酸 D.脂肪
49．能调节人体血糖含量处于相对稳定状态的激素是 ( )
①甲状腺激素②胰岛素③胰高血糖素
A.①② B.②③ C.② D.多种激素共同作用
50．决定反射时间长短的主要因素是 ( )
A.刺激强度的高低 B.感受器的兴奋性
C.中枢突触数目的多少 D.效应器的兴奋性
51．在减数分裂中，含有与体细胞相同的染色体数目，但不含同源染色体的时期是 ( )
A.减Ⅰ分裂后期 B.分裂间期 C.减Ⅱ分裂前期 D.减Ⅱ分裂后期
52．已知某抗原为一蛋白质分子，由一条多肽链形成，且构成该蛋白质分子的氨基酸的平均相对分子质量为128。根据抗原的性质，我们可以推知，通常组成该抗原蛋白质分子的氨基酸数目一般不少于 ( )
A.91个 B.79个 C.30个 D.20个

53．一个含23对同源染色体的卵原细胞，经减数分裂产生的卵细胞可能类型有 ( )
A．223种 B．2种 C．1种 D．不能确定
54．用32P和35S分别标记噬菌体的DNA和蛋白质，用该噬菌体去侵染细菌，增殖10代，子代噬菌体的情况是 ( )
A.绝大部分含32P B.绝大部分含32S
C.绝大部分不含32P D.绝大部分不含32S
55．将愈伤组织细胞在一种包含所有必需物质的培养基中培养了几小时(培养基中还含有用氚标记的胞嘧啶),如果再用放射性自显影技术检测这些愈伤组织细胞，不会发现放射性物质的是 ( )
A.线粒体 B.核糖体 C.细胞核 D.液泡
56．大豆根尖细胞所含的核酸中,含有碱基A、G、C、T的核苷酸种类共有
A.8 B.7 C.5 D.4
57．具有两对相对性状的纯合体杂交(两对相对性状独立遗传)，F2中重组类型占F2总数的比例为 ( )
A.10／16 B.6／16 C.9／16 D.6／16或10／16
58．玉米间作与单作相比，可以明显提高产量。易染病抗倒伏玉米甲〔aaBB)与抗病易倒伏玉米乙(AAbb〕间作，甲株所结玉米胚、胚乳的基因型分别为:
①AaBb②aaBB③AAbb④AaaBBb⑤aaaBBB⑥AAAbbb
A.①④ B.③⑥ C. ①②④⑤ D.②③⑤⑥
59．已知AUG、GUG为起始密码，UAA、UGA、UAG为终止密码。某原核生物的一个信使RNA碱基排列顺序如下：A一U一U一C一G一A一U一G一A一C……(40个碱基)……一C一U一C一U一A一G一A一U一C一U信使RNA控制合成的蛋白质含氨基酸的个数为 A.20个 B.15个 C.16个 D.18个
60．在“DNA粗提取与鉴定”的实验中，将提取获得的含DNA的粘稠物(含较多的杂质)分别处理如下：
①放入2mol•L-1的NaCl溶液中，搅拌后过滤，得到滤液D和粘稠物d
②放入0.14mol•L-1的NaCl溶液中,搅拌后过滤,得到滤液E和粘稠物e
③放入冷却的95%的酒精溶液中，搅拌后过滤，得到滤液F和粘稠物f
以上获得的滤液和粘稠物中，因含DNA较少而可以丢弃的是( )
A. d. E. F B. D. e. f C. d. e. F D. D. E. f
61．科学家近几年发现了铃蟾抗菌肽，通过化学分析得知它由22个氨基酸组成，那么与之相应的遗传信息很可能存在干哪一项中 ( )

A. 22个核苷酸 B. 66对脱氧核苷酸 C.约70对核苷酸 D.约200对脱氧核苷酸
62．用3H分别标记的胸苷和尿苷(它们均为合成核酸的原科)，分别处理活的洋葱根尖，过一段时间后检测大分子放射性，最可能的结果是( )
A．部分细胞检测到前者，所有细胞都能检测到后者
B．部分细胞检测到前者，只有局部区域的细胞能检测到后者
C．两者都能在所有细胞中检测到D．两者都不能在所有细胞中检测到
63．如果在一个种群中，基因型AA的比例占25%基因型Aa的比例为50 %,基因型aa的比例占25%。已知基因型aa的个体失去求偶和繁殖的能力，则随机交配一代后基因型aa的个体所占的比例为： ( )
A 1/16 B 1/9 C 1/8 D 1/4
64．已知果蝇的灰身和黑身是一对相对性状，基因位于常染色体上。将纯种的灰身果蝇和黑身果蝇杂交，F1全为灰身。让F1自由交配产生F2，让F2中的灰身果蝇自由交配，后代中灰身和黑身果蝇的比例为 ( )
A 2：1 B 3：1 C 4：1 D 8：1
65．某夫妇所生的2个孩子的基因型分别为AA和aa，试计算该夫妇在理论上接连生出这样的2个孩子的几率是 ( )
A 1/2 B 1/4 C 1/8 D 1/16
66．分析某生物的双链DNA分子，发现鸟嘌呤与胞嘧啶之和占全部碱基的a%（a>0)，其中一条链上鸟嘌呤占该链全部碱基的b% (b>0),则对应链中鸟嘌呤占整个DNA分子碱基的比例为 ( )
A.a／2％—b／2％ B.a％—b％ C.(a％—b％)／(1—a％) D.b％—a／2％
67．某豌豆的基因型为Aa，让其连续自交三代，其后代中a基因的频率是
A.12.5％ B.25％ C.50％ D.75％
68．下列有母系遗传性状的是 ( )
A.紫茉莉花色的遗传 B.棉花叶形的遗传
C.高粱的雄性不育 D.豌豆粒形的遗传
69．有关基因工程的叙述，错误的是 ( )
A.DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来
B.限制性内切酶可用于目的基因的获得
C.目的基因须由运载体导入受体细胞
D.人工合成的基因可以不用限制酶
70．植物细胞融台常用的诱导剂是 ( )
A.PEP B.PEG C.ATP D.质粒
71．关于效应B细胞的来源的叙述中正确的是 ( )
A.效应B细胞多数来源于B细胞直接受到抗原的刺激
B.记忆细胞在处理抗原后能够产生效应B细胞
C.效应B细胞全产生于T细胞呈递抗原后
D.B细胞在胸腺中发育成为效应B细胞
72．植物体细胞杂交尚未解决的问题有 ( )
A.去掉细胞壁，分离出有活力的原生质体 B.将杂种细胞培育成植株
C.让杂种植物按照人们的需要表现出亲代的优良性状 D.尚未培育出属间杂种植物
73．“生物导弹”是指 ( )
A.单克隆抗体 B.杂交瘤细胞
C.产生特定抗体的B淋巴细胞 D.在单抗体上连接抗癌药物
74．下列说法中正确的是 ( )
A.酶活性的调节不利于微生物的生长、繁殖
B.酶合成的调节增强了微生物的适应能力
C.酶合成的调节与酶活性的调节不能共存于同一种微生物体内
D.大肠杆菌分解利用葡萄糟的酶属于诱导酶
75．“白色农业”属于生物工程中的“发酵工程”和“酶工程”，人们在工厂车间内都要穿戴白色工作服从事劳动生产，故形象的称谓“白色农业”。请回答：“三色农业”生产的食品 分别称之为绿色食品、蓝色食品和白色食品。下列属于白色食品的是 ( )
A.食醋 B.海带 C.面粉 D.花生油
76．利用酵母菌发酵生产酒精时，投放的适宜原料和生产酒精阶段要控制的必要条件分别是 ( )
A.玉米粉，有氧 B.大豆粉，有氧 C.大豆粉，无氧 D.玉米粉，无氧
77．黄巢的著名诗作：“待到秋来九月八，我花开后百花杀，冲天香阵透长安，满城尽带黄金甲。”这里所指的影响开花的生态因素是 ( )
A.光照强度和温度 B.长日照条件 C.短日照条件 D.湿度和温度
78．硫循环不同于碳循环的主要是 ( )
A.进入生态群落的途径 B.在食物链中的传递形式
C.通过微生物从大气进入植物体 D.在生态系统内通过有机物传递
79．五灵脂可作药材，橡胶树可提取橡胶，人们受响尾蛇对温度变化极为敏感的启发研制成了“响尾蛇”空对空导弹，这些都说明野生生物具有 ( )
A.直接使用价值 B.间接使用价值 C.潜在使用价值 D.A、B均正确
80．下列几组选项中，三种自然灾害或环境问题之间有逐级因果关系的是
①寒潮、霜冻、盐碱地②地震、泥石流、水土流失③酸雨、臭氧层破坏、杀伤性紫外线④森林减少、温室效应、海平面升高
A.② B.①② C.④ D.③④
二、判断题(判断下列各题，正确的在括号内画“√”号；错误的在括号内画“×”号，答错的扣1分，不答不给分，满分20分，最低分0分)
1.放线菌是一种丝状的、无定型细胞核的、能产生分生孢子的多细胞生物( )
2.DNA双链的两条互补链带有不同的遗传信息 ( )
3.人体分解代谢过程中产生的蛋白质代谢终产物包括尿素和尿酸 ( )
4.爱鸟周期间，同学到市场上买了许多虎皮鹦鹉放到野外，这样做可以保护虎皮鹦鹉 ( )
5.白鳍豚和蝙蝠一样，是靠回声定位来觅食和探测目标的 ( )
6.芽孢和孢子都具有繁殖作用 ( )
7.目前已知的离开活细胞可独立生活的最小生物是支原体，它是最小的细胞型生物( )
8.革兰氏阳性细菌经革兰氏染色后呈红色，革兰氏阴性细菌经革兰氏染色后呈紫色( )
9.毒品中的可卡因是从罂粟中提取出来的 ( )
10.若一个人的胸腺先天发育不良，造成的结果是细胞免疫丧失，体液免疫正常( )
11.花生种子因为没有极核与精子结合成的受精极核的形成故无胚乳 ( )
12.厚角组织是只留细胞壁的死细胞 ( )
13.根的初生木质部和初生韧皮部的分化过程都为“外始式” ( )
14.无体腔的二胚层动物为线形动物 ( )
15.软体动物全都为开管式循环 ( )
16.大麻哈鱼由海洋到江河繁殖称溯河洄游 ( )
17.在人的终尿形成过程中，通过肾小管的重吸收，能把对人有利的全部葡萄糖，大部分水，全部无机盐吸收回血液 ( )
18.若人的精子细胞核中DNA为n，则体细胞中的DNA为2n ( )
19.兴奋通过突触时由电位变化转化为递质释放，再转化为电位变化 ( )
20.温室往往无风少虫，使得风媒花和虫媒花传粉困难，“花而不实”。萘乙酸可以帮助人们解决这一难题。 ( )
三、填空(每空1分，共20分)
1．新鲜的鸡蛋打开后，可以看到蛋黄上有一粒白色的小圆点，这是＿＿＿。
2．家蚕的口器属于＿＿＿＿式，蜜蜂的口器属于＿＿＿＿式，＿＿＿＿动物在昆虫中寿命最短。
3．繁殖葡萄的优良品种最常用的方法是＿＿＿＿；繁殖苹果的优良品种最常用的方法是＿＿＿＿．
4．把浸软了的玉米粒从中间纵切开，再用稀碘液涂在切口上，玉米粒结构的＿＿＿＿部分会变成＿＿＿色，
5．请填出下列植物的胎座类型：
黄瓜＿＿＿＿ 苹果＿＿＿＿大豆＿＿＿＿。
6．将四组生长发育状况相同的豌豆幼苗，分别放入A、B、C、D四种培养液中，在光照、温度、PH等均适宜的条件下培养。A为蒸馏水；B为0．025mol／LNaCl溶液；C为含有全部必需元素且总浓度是0．025mol／L溶液；D为含有全部必需元素且总浓度是0．5mol／L溶液。一段时间后，C组生长发育正常。A、B、D三组幼苗均死亡。
回答下列问题：
(1)请解释幼苗死亡原因：
A是因为＿＿＿＿ B是因为＿＿＿＿＿ D是因为＿＿＿＿＿＿
(2)提高盐碱化地区农作物产量的两大途径是＿＿＿＿＿；＿＿＿＿＿＿＿
7．“螳螂捕蝉，黄雀在后”为题，写出最简单的食物链＿＿＿＿此链共有＿＿个营养级，含总能量最多的生物是＿＿，螳螂被更狡猾的黄雀所捕食，这体现了生物的--------

一、选择题：
题号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
答案 D D B C D A A B B D
题号 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
答案 A C C D B C B C B A
题号 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
答案 B D B A D C D C C C
题号 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
答案 A A A D D D A D B A
题号 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50
答案 C A D B A A D A D C
题号 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60
答案 D A C C D B D C C A
题号 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70
答案 D A B D C A C C A B
题号 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80
答案 B C D B A D C A A C
二、判断题：
1、×2、√ 3、× 4、× 5、√ 6、× 7、√ 8、× 9、× l0、×11、×12、×13、√14、× 15、×16、√ 17、×18、×1 9、√ 20、√
三、填空题：
1、胚盘。
2、咀嚼式，嚼吸式，蜉蝣。
3、扦插，嫁接。
4、胚乳，蓝。
5、侧膜胎座，中轴胎座，边缘胎座。
6、(1)A是因为没有矿质营养元素。
B是因为营养元素不全。
D是因为溶液浓度过大。
(2)改良土壤、种植耐盐碱的作物(或选用耐盐碱的作物品种)。
7、植物→蝉→螳螂→黄雀，四，植物，适应的相对性。
不知道你要什么类型的，给你2010全国中学生生物学联赛预赛试题，你自己可以到网上找找，肯定会有
你要搞竞赛的话，可以找老师要呀

㈤ 培养细胞如何提取mRNA，如何逆转录

1
细胞总RNA的提取
1）、6孔板细胞（CNE-2）汇合度为90-100%时，取出无菌室，去其上清，用PBS洗两次后，每孔加TRIZOL试剂（Gibco公司）
1
ml，摇匀，无菌罩内消化3-5分钟（观察：液体变粘稠，细胞脱壁）。
2）、将各孔内消化好的细胞裂解液吸到一DEPC处理过的1.5
ml
EP管中，加新开的氯仿0.2
ml，轻摇15秒。
3）、室温静置2-3分钟后，12000
rpm，15
min，4℃，离心。然后取上清无色水相（约0.6
ml）到
EP管（DEPC处理过），加0.5
ml新开的异丙醇，室温下静置10分钟。
4）、12000
rpm，10分钟，4℃，离心。观察总RNA在管底的白色沉淀，弃去上清（小心别丢了沉淀），75%乙醇1.0
ml洗涤（用DEPC水新配制）后，7500
rpm，5
min，4℃离心。
5）、去上清，点离，用小Tip吸干液体。气干沉淀5-10分钟，
DEPC处理水20-30
ul加入，中枪打匀，55-60℃水浴10分钟溶解总RNA，测OD值。
6）、电泳。
2
从总RNA中分离mRNA（Oligotex
mRNA
Mini
Kit,Cat.no.:70022,
QIAGEN）
1）、取上述提取的总RNA若干（少于0.25
mg）到一个新的无RNase
的EP管中，用无RNase的水定容到250
ul。
2）、加入Buffer
OBB
250
ul,
Oligotex
Suspension
15
ul。用Tip打匀或用手弹匀。
3）、70℃水浴，3分钟（裂解RNA的二级结构）。
4）、20-30℃条件下，静置10分钟（让Oligotex与mRNA结合）。
5）、高速离心2分钟，小心吸走上清（该上清要保留），留下约50
ul的上清在原管里。
6）、用Buffer
OW2
400
ul重悬含Oligotex/mRNA复合物的沉淀，然后将这些加到套有1.5
ml
EP管的SPIN柱子上，高速离心1分钟。
7）、将SPIN柱子移到一个新的EP管上，加Buffer
OW2
400
ul到柱子，高速离心1分钟，丢掉滤过液。
8）、将SPIN柱子移到一个新的EP管上，加20-100
ul热的（70℃）Buffer
OEB到柱子上，用Tip来回吸打3-4次，高速离心1分钟。
9）、为保证最大的
mRNA产量，可再次重复第8步。
10）、电泳。
RNA提取的原理就是核酸在异丙醇中的溶解度很低！其他步骤都是防止RNA降解和使RNA从细胞中溶出。
逆转录过程请看参考资料。

㈥ 麦门冬对硬皮病与什么作用

激活VEGF启动子,致使VEGFmRNA转录增加、合成增多,促进血管生成。与VEGF相似,EG-VEGF也由缺氧调节,在EG—VEGF的基因转录起始位点的上游区同样拥有一个HIF一1的连接位点,后者与EG.VEGF前导序列的作用元件结合后引起EG-VEGF的转录。EG—VEGF 与受体结合后,激活磷脂酰肌醇3激酶,丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(phosphatjdyIjnositol 3-kinase, PI.3K/Akt)信号通路和丝裂原活化蛋白激酶(mibgen·activated protein kinase,MAPK)。PI-3K 信号通路被激活后,引起Akt的活化,可上调核转录因子NF-K B和抑凋亡基因Bcl-2的表达,诱导周期素CyclinDl的表达上调和周期素依赖性蛋白激酶抑制剂P21 cipl、p27 kipl的表达下调,促进细胞生长和加速细胞周期的进程。MAPK信号途径可激活细胞外信号调节蛋白激酶(extrace¨uIar signal·regulated protein kinases,ERK)、C-Jun氨基末端激酶(c—Jun N-terminalkinase,JNK) 和p38MAPK亚家族活性,促进细胞增殖、分化与血管发生,从而提高心肌血流灌注,改善心肌缺血程度。通过蛋白芯片技术筛选:参苈加颗粒能够调节心力衰竭大鼠心肌EG-VEGF的表达,从而对心力衰竭大鼠心肌起保护作用。芯片分析结果显示:与空白组相比,模型组的表达下调;与模型组比较, 治疗组的表达上调:模型组与空白组相比表达无差异。 5结论参苈加颗粒通过调节EG—VEGF的表达,对心力衰竭大鼠的心脏起到保护作用。其可能机制是 EG.VEGF/PK.1能激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)p44/42和磷脂酰肌醇孓激酶(PI-3K)信号通路,导致内皮细胞的增殖、迁移和存活,诱导新生血管形成,提高血流灌注,改善心肌缺血程度从而对心力衰竭大鼠的心肌起到保护作用。麦门冬汤对硬皮病小鼠皮肤CTGF、TGF-13、PDGF含量的影响◆王振亮宋建平张晓艳田瑞曼贾丽丽崔庆安(河南中医学院仲景医药研究所,郑州450008) 摘要:目的:观察麦门冬汤对BALB/C硬皮病小鼠皮肤组织及其结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)、转化生长因子(transforming growth factpr,TGF)13、血小板生长因子(platelet.derived growth factpr,PDGF)含量的影响。方法:选8周龄60只8ALB/C 小鼠用博莱霉素(BLM)制作硬皮病模型,并随机分为5组,每组12只。使用麦门冬汤大、中、小剂量治疗3周。观察各组小鼠皮肤改善情况及皮肤中CTGF、TGF-B、PDGF的含量。结果:麦门冬汤大、中剂量均能减轻BLM致硬皮病小鼠的真皮厚度,三组均可以减轻BLM致硬皮病小鼠的纤维化指数和CTGF、TGF一13含量,而且存在明显的量效关系。大剂量组还能降低皮肤组织中PDGF的含量。结论:麦门冬汤能改善模型小鼠的皮肤硬化,对皮肤组织中CTGF、TGF-13、PDGF的含量有降低作用。关键词:麦门冬汤;硬皮病:小鼠模型系统性硬化症(systemic sclerosis,SSc)是一种病因不明,以皮肤和内脏纤维化为特征的慢’基金项目:国家自然科学基金项目(项目批准号:81072716)。通讯作者:王振亮,男,医学博士,博士后,教授,主任医师,硕士生导师,从事中西医结合风湿免疫病的研究。 282 伸景学术研究h教育教学性多系统疾病。为了观察麦门冬汤对SSc的防治作用,我们建立博莱霉素(BLM)硬皮病动物模型, 观察麦门冬汤对SSc皮肤的软化作用,以及对SSc发病过程中重要影响因素结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)、转化生长因子(transforming growth factpr,TGF) B、血小板生长因子(platelet.derived growth factpr,PDGF)的影响,现报告如下。 1材料与方法 1.1动物与分组8周龄近交系BALB/c小鼠60只,体质量18~229,雌性,由河北省实验动物中心提供,许可证号SCXK(冀)2008-01-003,合格证号110,SPF饲料和水饲养,并用玉米芯垫料。实验前剃去小鼠背部中央区被毛,并随机分为6组,每组12只,分别为正常对照组(正常组)、模型对照组(模型组)、麦门冬汤汤大剂量组(以下简称大剂量组)、麦门冬汤汤中剂量组(以下简称中剂量组)、麦门冬汤小剂量组(以下简称小剂量组)。 1.2药物及试剂麦门冬汤(由麦门冬、半夏、人参、甘草、粳米、大枣等组成)药物购于仲景大药房,经我校药学院检验为合格产品。用凉水1000ml浸泡半小时,大火煎开后改为小火,再煎煮半小时后过滤,而后加水再煎如上法,浓缩至用药量。博来霉素(BLM,15 mg/支)由日本化药株式会社生产,批号740130。CTGF、TGF-8、PDGF等试剂盒均购于美国奥迪生物公司,批号201106。 1.3模型制备与给药按照文献方法,模型组和观察组小鼠背部皮内注射100 uI(200 ug/m1) 的博来霉素溶液,每天1次,连续3周。正常组小鼠用磷酸盐缓冲液(PBS)O.1mI做背部皮内注射。 3周造模成功后开始灌胃给药,容量0.2 millOg体质量,每天1次,连续3周。给药量以209小鼠和70kg***按照体表面积折算(系数0.0026),其中大、中、小剂量组分别是***用量的5、3、1 倍,即34.7299.kg·1、17.3699.kg一1、8.6899。kg一1。正常组和模型组给与等容量生理盐水。 1.4指标检测 1.4.1病理学观察对模型小鼠皮损处皮肤进行HE染色,肉眼和显微镜观察小鼠皮肤的变化。 1.4.2皮肤厚度切取小鼠背部注射区皮肤,固定于10%甲醛液,石蜡包埋,苏木素2伊红(HE) 染色。并用彩色病理图像分析系统测定皮肤厚度(表皮填皮),每只小鼠的切片随机取5处测皮肤厚度后,求得该小鼠皮肤厚度的均值(i)。 1.4.3纤维化指数用Masson三色染色,计算纤维化指数。染色的结果判定:胶原纤维呈亮绿色,肌纤维呈红色,细胞核呈黑色。用细胞免疫组织化学定量分析系统将Masson染色皮肤组织切片的图像在40倍物镜下采集至计算机中,每只小鼠的切片随即取10个视野,每个视野26万像素,以亮绿色(胶原纤维)为阳性,求得阳性面积,阳性强度均值,将两者相乘得胶原纤维组织化学指数, 计算出每只小鼠指数的均值(i)。 1.4.4皮肤中CTGF、TGF-B、PDGF含量测定实验结束处死动物,切取小鼠背部注射区6mmh 6mm大小皮组织,剪碎后与生理盐水研磨成2%组织浆,3000dmin,离心lOmin,取部分上清液,严格按照试剂盒要求的操作步骤进行,用ELISA法分别测

㈦ 为什么不能用培养过夜的菌液提rna

提高目的基因的表达效 率,基因工程菌带外源 基因、 硫酸铵，提高质粒稳定性，蛋白合成增加： 低拷贝质粒工程菌产生不含质粒 子代菌频率高如增加工程菌质粒拷 贝数可提高稳定性、果糖 等。高温或低温都会使发酵异常。 温度对发酵过程的影响是多 方面的、甘油，从而控制乙酸 的产生、参数测量与控制系 统，才能提高 工程菌的生长，适于表达外源基因。 好氧微生物利用溶解于培养液 中的氧气进行呼吸。 质粒不稳定可分为，可缩短生长延迟期， 菌体迅速繁衍,计算比值

(稳定性stability)

二.5 ×10

40 0 0。

⒊ 温度的影响
温毒对基因表达的调控作用 发生在复制转录翻译和小分子调节 分子的合成等水平上、最大安全性、最佳速度 和最低失败率等。

采用调节搅拌转速的方法： 葡萄糖，可减少乙酸的抑制作用

分批培养中选择不同的碳源；

⑵这两种菌比数率差异的大小， 培养及消毒过程不得游离异物。

一， 细胞生长减慢，反而会抑制后 期菌体的生长， 减小了重组菌与质粒丢失菌的生长速 率的差别，都可以提高 质粒稳定性.4左右、培养基各种组分，使用cI阻遏蛋 白的温度敏感型突变株（clts857）。

第六节 基因工程菌生长代谢 的特点
菌体的生长通常用比生长速率来 表示。 无机磷在许多代谢反应中是 一个效应因子，减少它的抑制作用、减少代谢副产物积累。对发酵 影响较大的几个因素有，生长速率和菌体总蛋白合成均减 少。 外源基因的高效表达需要大量 的能量,最佳化的工艺是获得: 最快周期，培养前 期重点是优化工程菌的生长条 件、最好质 量。 工程菌培养可通过选用不同的碳 源控制补料和稀释速率等方法来控制 菌体的生长。

发酵时。 维持较高的DO2值: ⑴通过摇瓶操作基因工程菌生长的基 础条件， 影响终产物的形成并导致减产.0～ 6。高生长数率时质粒拷贝数下降,如温度、保证高传质作用的搅 拌器、空气无菌过滤装置、氯化铵等，对pH进行适当的调节， 但稳定性增加。这与工程菌大量前体被利用引起 前体不足，提 高对氧的需求。 葡萄糖对lac启动子有阻遏作用、精细的温度控制和灭菌系 统。
质 粒 拷 贝 数
1 950

3 0.2 0、提高外 源蛋白产率有重要意义。常用的碳源有,并合成 被称为魔点的ppGpp的结果； 当温度升高42 0C时、培养 基组分和溶解氧浓度

有些含质粒菌对发酵环境的 改变比不含质粒菌反应慢。常用的氮源有， 影响生物大分子的和成和菌体的生 长。 它通过影响RNA链的延深过程减少 转录，都会改变菌 体的能量代谢和小分子前体的供应，而基 因工程发酵是为了获得最大量的基 因表达产物; 培养后期重点是优化外源蛋白 的表达条件。 适当提高pH。 培养条件的改变： 分裂不稳定 结构不稳定

分裂不稳定。

对发酵罐要求。 也可能ppGpp是通过干扰RNA聚合酶 与PL启动子专一识别反应、 碳氧比，从而产生“严紧反应”有 关,发酵的目的是使外源基因高 效表达;h

β-半乳糖苷酶工程菌的连续养

质粒稳定性的分析方法
样品
不含抗性标记抗生素 10-12h 100个菌落 含抗性标记抗生素

平 板 培 养基

平板培养基

10-12h

统计生长菌落数
重复三次、甘露糖： 提供菌体生长最适生长条件，所以 应根据工程菌的生长和代谢情 况：外源基因既高效表达、提高质粒稳定性的方法
为了提高质粒稳定性。

对同一工程菌控制不同的比生长 数率可改变质粒的拷贝数。 若能提高溶氧速度和氧的利用 率。它不仅涉及宿主载体和克 隆基因之间的相互关系还和环境有 关，酪蛋白水解物有 利于产物的合成与分泌， 使外源基因高效表达。

不同的碳源对菌体的生长和外源基 因表达有较大的影响。通过间歇 供氧和改变稀释数率， 改变菌体代谢产物的反应方向。乳糖 对lac启动子有利。

大肠杆菌中克隆携带氧能力的 VHB蛋白的基因可提高菌体生长 速率：

⑴先使菌体生长至一定密度。 接种量的大小影响发酵的产量和发酵 周期。 加入蛋氨酸和酵母提取物都能减 少乙酸的产生、 透析培养。它影响各种酶的反应速度： ⒈培养基的影响 ⒉接种量的影响 ⒊温度的影响 ⒋溶解氧的影响 ⒌诱导时机的影响 ⒍pH的影响

⒈培养基的影响 培养基的组成既要提高工程菌的 生长速率。

第七节基因工程菌发酵
基因工程菌的培养过程包括;个为止。

二， 提高活菌产量，使游离的 RNA聚合酶浓度降低。一般在对数生长期或对数生长后期升 温诱导表达，ST值下降。

⒌ 诱导时机的影响
对于λPL启动子型的工程菌。但使用甘油菌体得率较大，在 28～30 0C下培养时；
⑵再诱导外源基因的表达

由于第一阶段外源基因未表达，可提 高产量，细胞生长并非主要目标、残留气 体处理装置，增加了质粒稳定性，间歇改 变培养条件以改变两种菌比生长速 率,其最佳pH为6、菌体生长与前体供应的关系
在基础培养基中加入氨基酸 （小分子前体）能使菌体比生长率 提高。

在培养基中加入抗菌素抑制质粒
丢失菌的生长、积累 对受体细胞的影响、培养液配制和连续操作系统、基因工程菌的培养设备
应用发酵罐大规模培养基因工程菌： 中等拷贝质粒（56拷贝）的工程菌中 与前体合成有关的酶增加：指工程菌分裂时出现一 定比例不含质粒子代菌的现象。

质粒存在对菌体代谢的影响;菌体量的比 值是基本恒定的，细胞快速繁殖、氨水、乳糖， 保证纯菌培养、基因工程菌的发酵工艺
基因工程菌的发酵与传统的微 生物发酵不同，从而影响菌体的生长，则能提高发酵产率， 而使用葡萄糖菌体产生的副产品较多，菌体会产生乙酸。

它的浓度增加会导致在合成mRNA和 rRNA时RNA聚合酶在模板上的移动产生 停顿。 接种量小，该突变体能合成有活 性的阻遏蛋白阻遏PL启动子的转录。

⒋ 溶解氧的影响
对于好氧发酵,核糖体在密码子上停留、玉米浆、 连续培养、pH、最高产量，工程菌培
养采用两阶段培养法。 控制菌体的生长对提高质粒的稳 定性。使用葡萄糖和 甘油对菌体比生长速率及呼吸强度相 差不大、最 周全的废物处理效果。

大肠杆菌的蛋白#47第五节 基因工程菌的 稳定性
基因工程菌在传代过程中常 出现质粒不稳定的现象， 培养过程不得污染,溶解氧浓度是重 要的参数。还有无机盐。

接种量过高,经过一 段时间后间歇或连续地补加新鲜 培养基。

二，影 响菌体生长、菌体的生长与能量的关系
碳源物质是组成培养基的主要成分： 发酵罐体、蛋 白胨， 又有利于产品分离纯化。

“严紧反应”是当氨酰tRNA不足 时。

发酵罐的组成有： 补料分批培养。 碳源物质为细胞提供能量。

三，影 响代谢调控机制。

菌种

一级种子摇瓶

二级种子罐培养

扩大培养

原料

发酵培养 基配制

灭菌

发酵生产

代谢产物分离

微生物工业发酵过程简图

一，随DO2浓度的下降，其最佳pH在6、质粒不稳定产生的原因
常见分裂不稳定的两个因素。 高拷贝质粒的工程菌（240拷贝） 中，微生物发酵 目的是为了获得初级或次级代谢产 物，因而菌体的生长 速度反映了蛋白质的合成速度、维 生素等。

⒍ pH的影响
pH对细胞的正常生长和外源蛋 白的高效表达都有影响， 代谢物积累过多.8～7。 它不同于微生物发酵，使 启动子启动转录，磷浓度不同、最低消耗。 调控环境参数如温度。

总之。 采用磷酸乙酰化酶缺陷株作为 宿组主细胞，对营养和 氧需求量急增。

接种量大; ⑵通过培养罐操作确定培养参数和控 制方案以及顺序。色氨酸 对trp启动子控制的基因有影响。

在氮源中.5。
ppGpp是一个重要的调控分子, 可改变培养过程中的氧供给，使菌龄 老化。

如采取两段培养工艺。 结构不稳定。

菌体生长数率对质粒拷贝数和质粒稳定性 有一影响，营养和氧成了 菌群旺盛代谢的限制因素，菌体延迟期较长，又要保持工程菌的稳定性，这些酶的 基因大多受终产物的反馈调节.4

生长数率#47。

⒉接种量的影响
接种量是指移入的种子液体积和培养 液体积的比例，RNA链延长速度减慢。

⒈补料分批培养 补料分批培养是将种子接入 发酵反应器中进行培养。 温度还影响蛋白质的活性和包 含体的形成，促进细胞的呼吸作用，利于外源蛋白产物 的形成，使菌体进一步生长的方 法，不利于外源基因表达、酪蛋白水解物，发酵后 期下降幅度更大，该阻遏蛋白失活，严紧控制的启动 子如rrnA等的转录减少， 致工程菌生长速率降低。

在对数生长期。

工艺要求，可改善质粒稳定性，连 续培养中控制稀释速率等都能一定范 围内控制菌体的生长：酵母提取液，当菌体生 长所需能量大于菌体有氧代谢提供的 能量时，
这时菌体数目倍增、 固定化培养、缺失所致工程菌性 能的改变

一，阻止乙酸产生，使菌体生长过快，又适合代谢产物合成的温 度，导致培养 基的pH值下降、基因工程菌的培养方式
基因工程菌的培养方式、pH； 高拷贝质粒工程菌产生不含质粒 子代菌频率低但对稳定性不利，很快进入对数生 长期。

适宜的发酵温度是既适合菌体 的生长：
⑴含质粒菌产生不含质粒子代菌的 频率，分析表达产物的合成。 基因工程菌质粒的表达需与宿 主细胞竞争共同的前体和催化结构：指外源基因从质粒上丢 失或碱基重排，

直到细胞密度达到109#47

㈧ RNA的提取方法

1、酚抽提法：先用蛋酶K、SDS破碎细胞，消化蛋白，然后用酚和酚-氯萃取，高速离心后取上清，所得DNA大小为100-150kb

2、甲酰胺解聚法：破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合，再透析获得DNA可得DNA200kb左右。

3、玻璃棒缠绕法：用盐酸胍裂解细胞，将裂解物铺于乙醇上，然后用带钩或U型玻璃棒在界面轻搅，DNA沉淀液绕于玻棒。生成DNA约80kb。

4、异丙醇沉淀法：基本同1法，仅用二倍容积异丙醇替代乙醇，可去除小分子RNA（在异丙醇中可溶状态）

5、表面活性剂快速制备法：用Triton X-100A或NP40表面活性剂破碎细胞，然后用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。

6、加热法快速制备：加热96℃-100℃，五分钟，然后离心后取上清，可用于PCR反应。

7、碱变性快速制备：先用NaOH作用20分钟，再加HCI中和，离心后取上清，含少量DNA。

(8)mRNA无菌过滤设备扩展阅读：

DNA提取原则：

1、保证核酸一级结构的完整性；

2、核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；

3、其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；

4、其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。

㈨ 请问有谁知道核酸引物和探针PAGE纯化的步骤

第20章 细胞基因分离鉴定和原位杂交

第一节 细胞DNA、RNA的分离鉴定技术

一、培养细胞基因组DNA的提取及鉴定
人和哺乳动物细胞基因组DNA的分离通常是在有EDTA、Sarkosye等一类去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞，随后用酚、氯仿抽提，经RNase处理和纯化来提取DNA，可用于细胞凋亡中对所引起DNA断裂、凝胶电泳呈现“梯形”条带的实验，在细胞凋亡章节中已介绍了有关DNA的提取和凝胶电泳鉴定，除此之外，提取纯化的DNA还可用于分析其结构，序列限制性内切酶片断长度多态性及其基因定位和克隆。
(一)DNA提取方法：
(1)取单层细胞，经无钙、镁PBS洗一次，用0.25%胰蛋白酶消化，细胞悬液经PBS洗2次,弃上清，取细胞沉淀。
(2)加入2ml细胞裂解液(10mM Tris HCL，pH8.0，0.1mol/L EDTA，10mmol/L NaCL，1%SDS)充分混匀，加入蛋白酶K至终浓度为0.5～1g/L、Sarkosye终浓度为0.5%，混匀裂解蛋白呈糊状。
(3)50℃水浴2小时，转入37℃水浴过夜，次日加入等体积的饱和酚，轻轻颠倒混匀，以防止DNA断裂，约3分钟。
12000r/min离心15分钟（室温）
(4)取水相，再加入等体积酚/氯仿(1:1),同样颠倒混匀，去除蛋白质
12000 r/min离心15分钟（室温）
(5)再重复步骤(4)，再用等体积酚/氯仿(1:1)抽提一次
(6)取水相，再加入等体积氯仿，去除酚及蛋白质，颠倒混匀
12000 r/min离心15分钟（室温）
(7)取水相，加入2倍体积的预冷无水乙醇，沉淀DNA，混匀-20℃放置1小时
12000 r/min离心15分钟（室温）
(8)用70%乙醇洗涤一次，按上法离心将沉淀真空干燥10分钟。
(9)加入RNase A至终浓度100mg/L，37℃水浴消化1小时，消化污染的RNA。
(10)加入蛋白酶K至终浓度0.4g/L、Sarkosye至终浓度0.5%，混匀，50℃水浴2小时，加入Nace至终浓度10mmol/L。
(11)用等体积饱和酚各抽提一次，步骤同前。
(12)吸上清，加入氯仿/异戊醇(24:1)，按上法再抽一次。
(13)取水相，加入2倍体积预冷无水乙醇，-20℃ 1小时。
(14)取沉淀用70%乙醇洗一次，真空干燥10分钟后溶于少量TE中，4℃贮存。
(二)DNA纯度检测及含量计算
DNA浓度用紫外分光光度计测定，核酸的光吸收值位于波长260nm处，蛋白质则位于280nm，分别测定后，其OD260/OD280的比值应大于1.75.低于此值，说明DNA中仍残留较多的蛋白质，此时可用酚、氯仿继续抽提纯化。若比值大于1.9表明DNA链破坏，断裂严重，已成为小分子，因此操作应轻柔。
取少许DNA溶液，经紫外线扫描，吸收峰值位于波长260nm处，其纯度应为OD260/OD280=1.8
OD260值为1的溶液大约含50μg/mL DNA，故DNA的浓度(μg/mL)=OD260值×50mg/L×稀释倍数。
DNA总量(μg)=DNA浓度(μg/mL)×总体积(mL)
DNA分子量大小测定，可用含溴化乙锭的1%琼脂凝胶电泳法测定，根据加入标准品片断的电泳迁移距离计算样品片断分子量大小，此技术还可用作分离基因组DNA，进一步进行Southern吸印分析。
二、培养细胞总RNA的提取及鉴定
细胞中含有三类RNA即rRNA、mRNA和tRNA，其中mRNA传递蛋白质全部遗传信息是克隆表达功能性蛋白基因的最佳来源，是蛋白质合成的场所,有特殊意义,不同的细胞所表达某种蛋白的mRNA的种类和产量是不同的，为了提高细胞转录的mRNA的种类和产量，通常需加入诱导剂来对细胞进行刺激培养，如抗原、病毒、PHA、ConA、LPS等。
提取细胞总RNA的方法，常用强烈变性剂如盐酸胍溶液处理细胞，我们在细胞凋亡的bcl-2基因的RT-PCR法基因克隆中介绍了异硫氰酸胍一步法，但不纯，本文介绍用盐酸胍来裂解细胞可导致细胞结构破坏，核蛋白二级结构破坏，可利于提取总RNA，也可从总RNA中提取mRNA，从而分析mRNA表达量，建立cDNA文库，以及对mRNA的调控和进行反义RNA研究。
变性液：7mol/L盐酸胍，25m mol/L棕檬酸钠pH7.0，0.5%Sarkosye，0.1mol/L β-巯基乙醇。
水平衡酚：在饱和酚中加入等体积DEPC处理的三蒸水(或新鲜无菌的三蒸水)混匀后去除水相，再重复处理二次即可。
所用玻璃、塑料制品、金属器材可用0.1% DEPC水浸泡过夜后消毒无菌，其中玻璃、金属器材也可用180℃干烤6小时，以去除被污染的RNA酶。
(一)总RNA的提取方法：
1、消化收集细胞方法同前。
2、向离心管中的细胞沉淀物中加1.5mL变性液，立即充分混匀。
3、加入1.5mL水平衡酚、0.15ml 2mol/L乙酸钠PH4.0、以及0.05mL氯仿，剧烈振荡混匀30秒后，立即置冰上放置15分钟，4℃ 12000r/min离心15分钟。
4、取水相，加入等体积酚/氯仿(1:1)混匀，剧烈振荡10分钟，4℃12000rpm离心15分钟。
5、取水相，加入等体积氯仿，剧烈振荡10分钟，再同上离心，再如此反复抽提一次后取水相，加入等体积的预冷的异丙醇(或异戊醇)混匀，低温放置20分钟，再同上离心。
6、取沉淀用70%预冷乙醇洗两次，干燥10分钟，溶于DEPC处理的三蒸水中以溶解RNA，分装,-20℃冻存。
(二)总RNA的鉴定及含量计算
1、RNA纯度及含量测定
取少量提取的RNA，经紫外线扫描，吸收峰位于波长260nm处，RNA纯度为OD260/OD280=1.8～2。
OD260值为1的RNA溶液约含有40μg/mL，故RNA浓度(μg/mL)=OD260值×40μg/mL×稀释倍数。
2、RNA分子量大小鉴定
2.1 配液：
(1)10×MOPS电泳缓冲液配制
将41.2g[2-(N-玛琳代)丙磺碱，2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid，MOPS]溶于800mL经DEPC处理的50mmol/L乙酸钠液中，用2mol/L NaoH调整pH至7.0，加入20mL经DEPC处理的0.5mol/L EDTA(pH8.0)，再加经DEPC处理的水至总体积为1000mL过滤除菌，避光室温保存。
(2)甲醛加样缓冲液：1mmol/L EDTApPH8.0、0.25%溴酚兰、0.25%二甲苯青FF、
50%甘油
2.2 操作步骤：
(1)制平板胶：1.2%琼脂糖煮沸，冷却至60℃，加入10×MOPS缓冲液及甲醛溶液，使三者的比例为3.5:1.1:1，或三者的终浓度分别为1.2%、1及10%，于室温放置30分钟或更长时间，使胶凝固。
(2)在无菌离心管中混合下列液体。
RNA(最多30μg) 4.5uL
10×MOPS电泳缓冲液 1.0uL
甲醛 3.5uL
65℃温育15分钟，水浴冷却、离心
(3)加入2ul DEPC处理的加样缓冲液上样，进行电泳，5V/cm电压，3小时直到溴酚兰至胶的中部，可用已知RNA标本作分子量标准品，如28srRNA或9S兔β-球蛋白mRNA。
(4)电泳完毕，取出凝胶，浸泡在溴化乙锭溶液中(终浓度0.5g/L)染色30～45分钟，紫外透射仪观察分子量大小。

第二节 核酸蛋白转移电泳及杂交

一、DNA Southern Blot及杂交
本技术可用于基因组DNA特定序列定位，尤其可分析某些基因的限制性内切酶长度多态性，对遗传性疾病的早期基因诊断、产前诊断或基因变异等方面的研究有应用价值，其过程包括：样品DNA内切酶水解、水解片断的琼脂糖凝胶电泳分离、分离后水解片断的转移(固定)、特异性DNA片断的分子杂交及放射自显影。
(一)样品DNA内切酶水解
限制性内切酶(RE)可裂解双链DNA，每种酶其特点是具有高度特异性的DNA裂解点和不同电离子强度的特殊反应条件。不同产品其反应条件不同，应根据说明书操作。单位(U)RE活性是在37℃ 1小时内能将1μg DNA所有特异性位点切断的酶用量。若用两种以上不同的内切酶，要注意RE的最适盐浓度，要由低向高逐级添加适量盐逐个进行DNA切割。
1、配液：10×限制性酶消化缓冲液
10×buffer O—无盐：100mmol/L Tris HCL pH7.4
1mg/mL BSA
100mmoL/L MgCL2
10mmol/L DTT(二硫苏糖醇)
10×bnffer L—低盐：缓冲液O
0.5mol/L Nacl
10×bnffer H—高盐：缓冲液O
1.0mol/L Nacl
2、操作步骤：
(1)将DNA(0.2～1.0μg)溶液加入EP管中,并加入适量H2O总体积为18μL，混匀。
(2)加入2mL 10×限制酶缓冲液，根据厂家建议的盐浓度选择不同的缓冲液。
(3)加1～2U限制性内切酶充分混合。
(4)37℃温育适当时间，时间需先进行预试验，摸索所需消化的时间，通常用琼脂糖凝胶电泳鉴定，酶解充分，各片断分子量从大到小分布均匀。
(5)加入0.5mol/L EDTA pH8.0使达到终浓度为10mmol/L终止反应。
(6)消化后的DNA直接进行琼脂糖电泳，方法同前，可用于分析或Southern Blot。
(二)Southern Blot及杂交。
将经电泳走在琼脂糖中的DNA变性、中和后，以毛细管作用在高盐缓冲液中转移至硝酸纤维膜上，再用放射性探针检测与之杂交的DNA。
1、配液：
(1)变性溶液：1.5mol/L Nacl 0.5mol/L NaoH
(2)中和溶液：200mL 20×SSC
100mL 1mol/L HCL
100mL 1mol/L Tris HCL pH8.0加水至500mL。
(3)20×SSC： 在800mlH2O中溶解175.3g Nacl和88.2g柠檬酸钠，加入数滴10mol/L NaoH调pH至7.0加水至1000ml，高压消毒灭菌。
(4)预杂交液：12.5mL 1mol K3 PO4 pH7.4
125mL 20×SSC
25mL 100×Denhardt'S溶液
5mL 5mg/mL鱼精DNA
250mL 100%去离子甲酰胺
82.5mL H2O(总体积为500mL)
(5)100×Denhardt'S液：10g聚蔗糖(Ficoll400)
10g聚乙烯吡咯烷硐
10g牛血清白蛋白(组分V)
加H2O至500ml
2、操作步骤(如图20-1)：

图20-1 Southern Blot装置图
(1)内切酶消化的DNA，总体积为50uL，加入10uL加样缓冲液进行12-24琼脂糖电泳。
(2)用溴化乙锭染色，紫外灯下观察并照像，在胶的旁边放一尺子。
(3)将电泳胶取出，用以下各溶液浸泡处理，同时轻轻摇动：
500mL 0.2mol/L HCL 10分钟，水洗若干次
500mL变性液中浸泡15分钟×2
500mL中和溶液浸泡30分钟。
(4)剪一张硝酸纤维素膜，每边小于胶3mm。
(5)剪3～5层滤纸，大小每边比硝酸纤维膜小7mm，再剪一张滤纸，比胶的宽度长30～40cm，在一盘中加入数百毫升20×SSC，盘上搭一块玻璃，滤纸可从玻璃双侧浸到盘中的溶液。
(6)逐层放置滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜，其上再铺滤纸及吸水纸，并加以重物，胶和硝酸纤维膜之间不可有气泡，转移24～36小时
(7)取出该膜，用圆珠笔标记方向，放入2×SSC中5分钟，用滤纸吸干,80℃烘烤2小时。
(8)将该转移膜放在塑料袋中，加入6～10mL预杂交液，排出气泡，封口，42℃ 3小时或过夜。
(9)将标记的DNA探针煮沸5分钟，立即冷却，加入杂交液中，浓度为5×105 CPM/ML。
(10)倒去预杂交液，加入含探针的杂交液封口，42℃ 6h或过夜。
(11)取出转移膜，按以下条件洗膜
1×SSC，0.1%SDS室温2×15分钟
0.25SSC，0.1%SDS,42℃ 2×15分钟，气中干燥。
(12)将杂交后的膜曝光于X光片，暗盒中放射自显影2～7天，-70℃。
(13)X片显影、定影，然后读片
结果分析：此杂交技术可以对基因结构进行分析。杂交阴性带的大小，分布规律及根据带条信号强度测量其含量。
二、RNA Northern Blot及杂交
此法是将RNA分子在变性琼脂糖凝胶中可相互分离，随后将RNA转移至硝酸纤维素滤膜上，用放射性标记的探针进行DNA-RNA杂交，此法是研究RNA(特别是mRNA)的主要方法之一，可测量RNA的含量和大小。
1、配液：Northern 预杂交液：12.5m 1mol/L K3PO4 pH7.4
125mL 20×SSC
25mL 100×Danhardt's液
5mL 5mg/mL 鱼精DNA
250mL 100%去离子甲酰胺
加H2O 至500mL-20℃贮存
Northern 杂交液：500mL预杂交液加入标记探针及10%磷酸葡聚糖。
2、操作步骤：
(1)RNA变性电泳方法同前
(2)待溴酚兰走至胶的中部时，用水清洗胶数次，放置于500mL 10×SSC中浸泡45分钟，轻轻摇动。
(3)测量胶的大小，按下列顺序，从下向上为①横跨玻璃双侧的滤纸，双边可浸至20×SSC溶液；②胶；③硝酸纤维素滤膜；④亲和层吸纸；⑤吸水纸；⑥重物、转移4～6小时。
(4)取出滤膜80℃烘烤2小时。
(5)用6～10mL Northern预杂交液，42℃预杂交过夜。
(6)将已标记的探针煮沸，立即冷却，加入6～10mL Northern杂交液。
(7)去除预杂交液，加入含探针的杂交液，42℃，杂交过夜。
(8)按下列条件洗膜：1×SSC 0.1%SDS室温2×15分钟
0.25×SSC 0.1%SDS室温2×15分钟
(9)曝光于X光片暗盒中放射自显影1天。显影，定影，根据自显影条带的位置判定特定片断的位置和顺序，也可测含量。
三、蛋白Western Blot及分析
此项技术是一种蛋白质的固定和分析技术，是将已用聚丙烯酰胺凝胶或其它凝胶或电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维滤膜上，固定在滤膜上的蛋白质成分仍保留抗原活性及与其它大分子特异性结合的能力，所以能与特异性抗体或核酸结合，其程序Sonthern Blot相似，故称为Western Blot,第一抗体与膜上特异抗原结合后，再用标记的二抗(同位素或非同位素的酶)来检测，此方法可检测1ng抗原蛋白。
1、配液：
(1)转移电泳缓冲液：20mmol/L Tris HCL pH8.0
150mmol/L 甘氨酸
加14.5g Tris粉 67.08g甘氨酸于4L水中，加入1200mL
甲醇，加水至6L
(2)丽春红S溶液：0.5%丽春红S
1%乙酸
2、操作步骤（如图20-2）：

图20-2 Western Blot装置图

(1)用已制备好的SDS-PAGE分离的蛋白凝胶。
(2)用一张滤纸，剪成与胶同样大小，在转移电泳缓冲液中预湿，放在Scotch-Brit Pad上，在胶的阴性端放上滤纸，胶的表面用该缓冲液浸湿，排出所有气泡。
(3)在胶的阳极面放置同样大小浸湿的硝酸纤维素膜，排出气泡，再在滤膜的阳极端放置一张滤纸，排出气泡，再放一个Scotch-Brit Pad。
(4)将以上“三明治”样装置放入一个塑料支撑物中间，将支撑物放入电转移装置中，加入电转移缓冲液。
(5)接通电源：使胶上的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，电压为14V 4℃转移4小时或过夜。
(6)将滤膜放入丽春红S溶液中5分钟，蛋白染色水中脱色2分钟，照像，用印度墨水将分子量标准染色，在水中完全脱色。
(7)将滤膜放在塑料袋中，每3张加入5mL封闭缓冲液(1克速溶去脂奶粉溶于100ml PBS中)，封闭特异性抗体结合位点，室温1h，摇动，倒出封闭缓冲液。
(8)在封闭缓冲液中稀释第一抗体，加入后室温放置1小时，将滤膜转到塑料盒中，用200mL PBS洗四次，摇动。
(9)在封闭缓冲液中稀释辣根过氧化物酶标记的二抗，重复步骤8。
(10)将滤膜放在100mL新配制的DAB底物溶液中，大约2～3分钟就可显色，用水冲洗终止反应、照像。
结果分析：分析阳性(显色)条带的分子量大小，而且根据信号(颜色)强弱分析蛋白表达量。

第三节 细胞的原位杂交技术

原位杂交(ISH)是一种可在细胞涂片、组织切片以及分裂中期染色体带中检测DNA或RNA的技术，此方法原理是由DNA或RNA的序列与互补的标记单链DNA/RNA探针结合形成标记的双链杂交分子，本技术可对组织细胞原位的待测核酸分子进行定性，定量及定位分析。在细胞分化调节、基因定位、肿瘤遗传学、分子病理学、病毒学等领域得到广泛应用。经典的原位杂交技术包括载玻片处理，组织细胞的固定，探针的制备或选购，原位杂交，洗涤以及检测，其中探针制备技术不属于本章专业技术，故不作具体评叙，略交待制备使用原则。本章节主要介绍培养细胞的原位杂交技术。
一、探针的制备原则和选择
探针为RNA或双链、单链DNA，双链探针较单链探针有很多缺点，探针必须变性、复性，降低了探针杂交效率，双链探针在溶液中形成长的链状结构倾向，限制了它的组织穿透能力。适用于基因组DNA杂交。由于原位杂交的探针将与高密度的细胞融合，因此，需要减短探针的长度或增加探针的浓度，但是过高浓度的探针往往会增加非特异性结合，因此每种探针应选择适当的浓度。
探针的获得常采用随机引物延伸法的PCR合成和扩增，可获大量的DNA探针，或利用带有噬菌体强启动子多克隆位点的质粒载体来合成RMA探针，也可利用质粒菌扩增质粒，经酶切后纯化的基因片断，均可以获得制备探针原料。这些探针可以用同位素标记，也可以用非同位素标记，即光敏生物标记或地高辛配基标记于脱氧脲嘧啶三磷酸核苷(dUTP)上形成的地高辛-dUTP，可通过随机引物或缺口平移法与探针的核酸分子相连，构成地高辛一配基标记的核酸探针。比探针可用抗地高辛抗体偶联酶或荧光素通过松体结合和底物显色或产生荧光来检测。
这些探针基本均有市售，无需自行制备，只要根据说明书使用即可。
二、载玻片和盖玻片预处理
为了防止探针的非特异贴附而保证细胞粘附而需处理：
1、用于检测RNA的载玻片的处理
(1)用0.1mol/L HCL洗载玻片20分钟，再用无水乙醇洗数次使其干燥。
(2)在下列溶液中，65℃处理2小时
3×SSC 0.02%FicoLL400 0.02%聚乙稀吡咯烷酮(PVP)。
(3)固定在乙醇/乙酸(3:1 V/V)20分钟，180℃烘烤2小时。
2、用于检测DNA的载玻片的处理
以TESPA(three-amino-propyl-triethoxy-silane)涂载玻片。
3、对于盖玻片：于0.1mol/L HCL中浸泡20分钟，用无水乙醇洗，干燥后用二甲基氯化硅硅化，180℃烤2小时。
三、组织细胞固定
理想的细胞固定过程应该保护细胞形态，同时确保目的基因DNA或RNA序列暴露。对于RNA-RNA原位杂交有效的固定剂是4%多聚甲醛和PLPD（磷酸缓冲液PBS、赖氨酸、过碘酸盐及重酪酸盐）。
1、涂片细胞原位杂交固定
(1)用含有0.02%EDTA的PBS洗涤细胞，于0.1%胰蛋白酶消化，收获细胞计数，涂载玻片上。
(2)若检测RNA，固定于4%多聚甲醛pH7.0，在4℃下放60分钟，PBS洗5分钟，系列乙醇脱水干燥，-20℃保存。
(3)若检测DNA，固定在4%多聚甲醛16～24小时，0.1mol/L Tris-HCL pH7.4洗2×5分钟，浸泡在下述溶液中2×5分钟：
0.25%(v/v)Tritonx-100；0.25%(v/v)Nonidet P40；0.1mol/L Tris-HCL pH7.4；再用0.1mol/L Tris-HCL pH7.4洗2×5分钟。
(4)在100μg/ml蛋白酶K，50mmol/L Tris-HCL PH8.0，5mmol/L EDTA溶液中，37℃处理10分钟，再用含有甘氨酸的0.1mol/L Tris-HCL PH7.4洗2×5分钟。
(5)在20%(v/v)乙酸中40℃处理15分钟，0.1mol/L Tris-HCL PH7.4洗2×5分钟。
注意：对于DNA-DNA原位杂交多聚甲醛或福尔马林均可，但对于地高辛检测法必须用4%多聚甲醛，固定至少16小时，而且用蛋白酶K处理，这样可明显减少背景染色。
四、原位杂交
原位杂交与盐浓度、温度、甲酰胺浓度、pH等有关，DNA复性的温度是16～32℃，DNA-RNA原位杂交，25℃最佳，RNA-DNA杂交，可用较高温度，在pH5～9范围内复性率基本上与pH无关。最好选用温和的碱性条件。甲酰胺有机溶剂可降低双链核酸的稳定性，可避免杂交过程中处于过高的温度，防止高温破坏组织。
(一)同位素标记DNA探针的原位杂交
同位素标记的DNA探针，敏感性高，但要注意非特异结合，如35S标记探针在杂交前，用未经标记的dUTP预杂交，可减少非特异，可获较好的细胞内定位，此外还常用3H或125I标记探针，但3H放射线弱，自显影需100天曝光，不太理想，方法如下：
(1)取已形成单层的细胞的盖玻片，悬浮细胞可采用离心法，将细胞粘附到涂有明胶的载玻片上。组织印片，冰冻切片等标本。
(2)将标本浸入甲醇固定5分钟，再过3次4℃预冷的10%三氯醋酸。
(3)将细胞片标本浸入70%乙醇脱水，空气干燥，这时培养细胞盖玻片应该用中性树胶固定于载玻片上，注意细胞面向上。
(4)将细胞片放置在金属盘内，并将托盘放入43℃水浴箱中预热。
(5)直接向固定的细胞面滴加5mL含探针杂交液，然后用16mm盖玻片覆盖，其边缘用橡胶液封闭。
(6)43℃恒温水浴箱内培养18小时，此间保持箱内高湿度，防止因盖玻片封闭不严导致杂交缓冲液干涸。
(7)反应结束后，将玻片置于冰块上，用镊子小心剥下盖玻片周边的橡胶，将载玻片浸入垂直2×SSC溶液中，使盖玻片脱落。
(8)将载玻片放入湿盒中，加2×SSC溶液浸没玻片，加盖玻片并用胶带封闭湿盒。然后，将湿盒移入水浴箱中53℃处理30分钟。
(9)在18℃用2×SSC洗玻片4次，每次5分钟。
(10)玻片浸入70%乙醇脱水，空气干燥。
(11)将干燥后的干燥标本浸入新配制的核4乳胶液（核4乳胶液蒸馏水=1:1），垂直取出玻片，用滤纸擦去背面多余胶，室温干燥5小时（在暗室中进行）。
(12)用黑纸包裹标本放在4℃冰箱曝光（3H标记的探针通常需2～4周，有时需长达100天，可造成高背景，而不理想）。
(13)按常规显影、定影、水洗。
(14)对标本进行Giemsa或HE染色、脱水、封片。
结果分析：镜下观察，如需定量，可在镜下计数银颗粒或拍摄显微照片，用图象分析仪进行灰度分析。
(二)同位素标记RNA探针的原位杂交
RNA探针容易制备，合成率较高，成本低，易纯化，可提高检测敏感性。DNA-RNA、RNA-RNA杂交比DNA-DNA杂交稳定，能适应更多的条件。
(1)标本处理同前
(2)将RNA标记探针溶于杂交缓冲液中（5×107CPM/ml放射强度）。
50～70%去离子甲酰胺 2×SSC
0.5×Denhardt's液 1mmol/L EDTA pH7.0
200μg/mL变性鱼精DNA 85℃ 5分钟
(3)每张载玻片上滴加杂交液，使每张载玻片探针总量为2×105CPM，用一硅化的盖玻片盖住，封以不透性矿物油，在利于探针的温度下（常为42℃）杂交7～18小时。
(4)用氯仿洗数次，去除矿物油，室温下使盖玻片在2×SSC液中滑落，再滴加50%～70%去离子甲酰胺，0.1×SSC液，杂交温度下60分钟，室温2×SSC洗5分钟，用50μg/mL RNaseA在2×SSC中消化去除单链RNA，再滴加50%～70%去离子甲酰胺，0.1×SSC,室温15分钟，室温下用0.1×SSC洗5分钟。
(5)将切片脱水，浸入由1%甘油稀释的放射自显影乳剂（1:1）中，放入暗盒中，在有硅胶干燥剂存在下-70℃，存放5天（或者曝光于X光胶片24～48小时），随后浸于液体乳剂。
(6)用HE染色。
(三)地高辛标记的DNA探针原位杂交
放射性同位素标记探针缺点是有放射损伤，易污染环境，需特殊防护和实验条件，有半衰期受限、标记不稳定及曝光时间长。若改用生物素、乙酰氨基、荧光或地高辛标记可避免，其中以地高辛标记探针最敏感，随机引物标记地高辛，其标记率很高，此探针用于原位杂交可获高敏感性，好的细胞定位以及低背景。非同位标记探针还可以通过双标记原位杂交法，同时测多条DNA序列。
(1)配液：①杂交缓冲液：2×SSC
5%（W/V）磷酸葡聚糖
50%去离子甲酰胺
②缓冲液I： 0.1mol/L Tris-HCL pH7.5
0.5mol/L Nacl
③缓冲液II： 0.1mol/L Tris-HCL pH9.5
0.1mol/L Nacl
5mmol/L MgCl2
(2)操作步骤：
①组织标本处理同前。
②将140ng/mL地高辛标记的探针加到杂交缓冲液中，每张滴加50μL杂交缓冲液，用盖玻片盖住，四周封以树胶。
③将目的DNA和DNA探针放入90℃，进行变性10分钟，双链打开，42℃，在潮湿环境中杂交16小时。
④去除盖玻片，按下列条件洗涤：
2×SSC室温10分钟→2×SSC室温10分钟→0.2×SSC室温10分钟→0.2×SSC 42℃ 20分钟。
⑤再按以下方法处理：
1) 在缓冲液I中洗30分钟。
2) 在含有20%羊血清的缓冲液I中洗30分钟。
3) 滴加1:5000标有碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶的地高辛抗体，在装有缓冲液I的湿盒中温育20分钟。
4) 在缓冲液I中洗2×20分钟。
5) 在缓冲液II中洗60分钟。
6) 加入下述溶液：缓冲液II
0.33mg/mL 四唑氮兰
0.17mg/mL 5-bromo-4-Chlora-3-indoly' phosphate
7) 将切片浸于20mmol/L Tris-HCL pH7.5，5mmol/L EDTA终止反应。
⑥ 用底物显色、复染、脱水、封片，按免疫组化常规法进行。
说明：
(1)用不同浓度和不同温度的盐溶液洗涤是为了去除探针与不完全同源序列杂交，减少非特异性显色，其原则盐浓度由高到低，温度由低到高洗涤，洗涤过程中切勿使切片干燥。
(2)应该有阳性和阴性对照，阳性对照：用该探针与已知含互补序列的组织细胞标本进行杂交。阴性对照：①应用RNA酶或DNA酶去除目的序列；②使用未标记探针；③不加核酸探针进行杂交（空白对照）；④用不含探针DNA的无关质粒DNA替代探针进行杂交；⑤同义RNA（Sense probe）进行杂交。