硝酸纤维素膜用之前要用水处理吗

① 电转移后的硝酸纤维素膜如果不能及时进行检测,应如何保存

硝酸纤维素膜的保存方法，可以参考一下以下做法：
储存膜一般要求是避光,密封.过干或过湿都不利.在这种保存条件下,一般可以放置两年. 但是如果膜上做了封闭处理,就要根据具体试验情况来判断了.
有些膜由于生产工艺的问题,使用后灵敏度会在一段时间内发生变化,遇到这种问题,就需要在点膜后放置一段时间,待稳定后方可进入调试生产.

② Western 硝酸纤维素膜有正反面吗如何判断

转发了一个很全的回复：

1. 国外的硝酸纤维素膜一般正反面不明显，均比较光滑，不易区分

2. 国产的硝酸纤维素膜可以看出一面光洁一点，一面毛燥一点。

3. 转膜时无正反面之分，根据有些人的经验，毛燥的一面有时对蛋白的吸附能力更强一点，蛋白载量更大一点。

4. 硝酸纤维素膜转膜之前大多的正规操作方法是使用前要泡一下甲醇，以活化表面的基团，但个人经验是，可以不用泡，有些硝酸纤维素膜很易在甲醇中被消化掉，如果泡的话应该是浸一下就取出，或者在转膜缓冲液中多泡一会。

③ 请问做Western时 硝酸纤维素膜使用前需要用水浸泡吗浸泡多长时间不泡会怎么样

泡一下，湿了就行。 不是用水泡，用转移buffer泡。

④ 硝酸纤维素膜的生产原理

这个虽然看上去属于生产厂商的事情,但是GMP有个观点是强调对过程的控制才会有好的结果.那么只有了解NC膜的大致生产过程和基本原理才能更好的掌握这种材料的特性,最终制作出满意的试纸.你了解吗?
NC膜的过程和普通的造纸过程是非常类似的,我们可以借鉴对造纸的认识来理解.
首先,匀浆配比
购买回的原料硝酸纤维素粒子是一种非常普遍的有机化学物,溶解形成混浆,在该浆体内,会加入一定比例的试剂来调整最后形成的膜的性质,一般是一个试剂配方,主要包含表面活性剂/高分子聚合物/盐离子/成型剂等溶解在一个缓冲体系内. 不同的厂家加入的溶液配方不一样,直接导致了在产品的差异.
其次,滚筒铺膜
配好的匀浆通过滚筒,形成了一张薄膜,平摊在十分光滑的平面载体上.这个和造纸的过程是非常相似的.
最后,成型
在匀浆内的成型剂开始挥发,膜逐步干燥成型.同时在这个过程中由于温度比较高,有些厂家在这个过程采取了在密闭腔体内成型,同时补充配方溶液的形式,来避免一些有效成分的蒸发.
切割出产品
通过以上步骤生产出来的膜是呈一个宽度极大的产品,宽度的大小直接和滚筒的大小相关,滚筒越大生产越方便,但设备的成本也越高.宽膜要经过切割才能成为我们购买到的25mm或18mm(或20mm)宽,而长度上,成品卷膜和宽膜的长度是相同的.理论上可以让厂家切成你需要的任意宽度,但这样会造成原料的浪费和人力成本的增加,后来厂商在和试纸生产厂家的协调过程中,综合用料成本和生产便利性基本确定了上面说的宽度,以次为标准.关于不同宽度的用途差异,稍后详述.
从生产的过程,我们可以得知, NC膜本身是已经添加了表面活性剂来改善亲水能力,而且已经存在有一定的缓冲系统(虽然对纸条测试影响不会很大).对后面谈到的一些问题就比较容易理解.

⑤ 硝酸纤维素膜的质控方式

本节适合用膜量较大的公司用户参考.对于一卷膜可以用上几个月的用户来说, 厂家的质控标准已经完全能满足你的要求,而不需要自己再做相关的质控.
膜的质控虽属于原辅料QC职能, 但由于其专业性强, 一般都由小样调试人员来执行. 膜入原料库后需要进行如下检验工作:
1. 查收COA
在购买时, 供应商会随产品为每个lot的膜提供一张纸质的出厂质量证书, 该证书被称为COA. 如果你已经购买某一批次的膜, 而没有索取相应的证书, 如果有需要可提供批号向厂家要求补发. 其实在很多行业都有厂商为自己的产品附上COA的习惯.
COA一般只提供给大客户, 对小客户是没有意义的.
其内容主要是厂家在产品出厂时做过一些测试的罗列. 作用可以理解为质量凭证和测试数据参考.
2. 检查物理性能
膜的物理性能主要是2个参数, 膜厚度和宽度. 长度不需要检测. 使用中可以关注长度上是否有断面重接现象, 断面多费料则多, 少数发生.
厚度, 由螺旋测微尺,选择几个测量点检测后算平均. 膜生产的必测参数. 主要表现为厚度不均匀影响生物原料在膜上的扩散性能, 点出来的C/T线宽窄不一. 另外也影响爬速.
宽度, 普通直尺测量.
物理性能一般都不会有什么大问题. 毕竟检测标准客观, 易把握. 没有条件执行的厂家可省略.
3. 跑水性能
样本采用含有有色食用色素的水溶液, 目的是容易观测. 需制作一个简易支架.
操作: 注入足够溶液到下部槽内, 将不同批次膜每隔1cm做一次标记(总长大于4cm)并放到倾斜支架, 整个支架下端放入溶液槽, 膜开始吸液, 计时. 记录每个标记处的通过时刻, 并与对照组比较.
跑板时, 理论上溶液呈水平线形式上吸, 观测是否有波浪倾斜或包围润湿等反常现象.
4. 点样测试
C/T线出线时间, 其他试验条件相同情况下, 记录和比较C/T线出现时间是否与对照有差异.
灵敏度, 比较不同样本浓度情况下, T线的变化是否和对照组同. 一般每批次膜取前端一段用来测试即可. 由于制造过程的不均一性, 不同批号的灵敏度会有一定差异, 当大批量使用时, 这种差异影响是非常大的, 那么就要按照灵敏度表现将不同批号的膜进行分类. 在膜的STOCK中要能够轻易的分辨出来. 当进入后期生产调用时, 就能根据这些分类, 按照订单要求取用不同批号的膜, 或者用强灵敏度的原料和差灵敏度的膜来搭配.
关于膜的批内差. 批内差是肯定存在的,只是差距大小的问题,依据一般的测试条件是很困难获得详细的数值,因为你不可能对每一卷膜的每一段都做详细的测试. 减小膜批内差的最有效方法是不购入边缘膜带. 前面说过膜的生产方式,生产出的半成品是宽幅很大的一个膜面,要通过截面裁切才能获得25mm或者20mm的宽度.那么就有中间部分,和边缘部分之分.越靠近中间部分,膜的均匀性越好,边缘部分则相对要差,就造成了批内差. 一般可以通过COA获得具体位置信息,例如MILLIPORE就在切割后用字母A,B,C……来表示切出的窄膜在宽幅膜中的位置.
如果是试用某个型号的膜小样, 还需要在以上检测后加入膜加速老化试验. 包括膜单独的老化试验和点好膜后产品的老化试验, 具体试验方法请参看我以前写的研发思路一文.

⑥ 硝酸纤维素膜的应用技巧

从本节开始,我们开始对膜进行深入讨论和谈一些应用技巧.
1. 蛋白与膜的结合原理
蛋白与膜的结合原理, 已知的结合力包括疏水作用力H键静电作用力等,确切的结合原理并不明确,主要靠假说来支撑.主要有两种假说:
1) 首先两者靠静电作用力结合, 然后靠H键和疏水作用来维持长时间结合.
2) 首先两者靠疏水作用结合, 然后靠静电作用来维持长时间结合.
两条假说, 都表明其结合过程分为两步, 首先结合和后面长时间结合.由于结合原理的不明确性, 导致在这方面的工作非常依赖实践经验.
2. 膜对结合的影响
1)膜孔径
有些技术人员倾向使用膜孔径来区分不同的膜,但是请注意这只仅仅限于同一厂家的产品,如果是不同厂家的产品,这种比较是无意义的. 膜孔径与层析速度的关系,已在上文描述.
随着膜孔径减小,膜的实际可用表面积递增,膜结合蛋白的量也递增. 估量表面积的参数为表面积比率(实际可用表面积与所用膜平面积的比率).
另外, 膜孔径越小,层析速度也越小,那么金标复合物通过T线的时间也就越长,反应也就越充分.
综合以上两点,结论为膜孔径越小灵敏度越高.但是同时也减慢了跑板速度,增加了非特异性结合的机会,也就是假阳性越高.所以要按照试验结果挑选适合实际项目的膜,找到合适的平衡点.
2)不同厂家的膜差异
这个差异主要来源于两点:
1> 生产膜时,使用的聚合物和表面活性剂的来源,类型,数量不同.同理,在膜处理中这两类物质一般会对性能产生较大影响.
2> 处理过程不同.
3. 生物原料,缓冲溶液的试剂和配方
1) 生物原料, 作为CT线的生物原料使用情况各异,所以这里只做略述.
首先,单克隆抗体与膜的结合优于多克隆抗体, 主要时由于多克隆抗体有很多不同的表面位点, 而各位点与膜的最佳结合条件都有细微的差别, 毫无疑问就增加了优化难度.
其次,分子量越大,蛋白越难结合到固相材料上.
2)缓冲液
大家最关心的可能就是希望获得一个性能优良的配方,包括缓冲液,封闭液等等处理溶液配方.
其实我也无法提供给你一个万用配方清单. 因为不同的反应体系需要不同的配方来支持, 而不同机构的反应体系又有差异. 想获”鱼”先学”渔”. 为了不误导大家,我在下面涉及到配方的问题上,仅提供思路,具体配方请自己摸索.
缓冲液的构成一般是: PBS(或其他缓冲体系)+作用物质(针对某一特定问题)+PH调整. 我在参考过以前的各种资料后,个人意见为配方原则为宜简不宜繁,根据自己的需要添加作用物质,原来的很多需要添加的作用物质,由于膜制造技术的改进已经不再需要.
推荐的缓冲体系为0.01M PBS PH7-7.2, 该缓冲体系对多种抗原抗体都有良好的适应性.
作用物质的情况大致罗列如下:
少量NACL,减少信号强度,消假阳.
有机醇(甲醇,异丙醇等),润湿膜,减少膜带有的静电,利于结合包被.个人不推荐,因制膜工艺改进.
表面活性剂(TW20,TX100),增加亲水力,可避免线条中空现象,也可增色.
糖,保护剂,减缓老化速度,也可以增加亲水力同上.
调PH到某个位置,可以消假阳.
4. 点样环境
环境湿度对点膜过程非常重要.最佳湿度一般在45-65%.
湿度过低,膜上容易聚集静电荷,点膜容易出现散点,导致测试会出现疏水斑.
湿度过高,膜上毛细作用加强,点膜容易引起CT线变宽甚至扩散.
为了保证点样时膜湿度的均一性,一般在点样前把膜放到该湿度条件下平衡一段时间.
5. 点样仪器与膜面情况的关系
目前有两种点样方式,划膜式和非接触点膜式.非接触点膜式优于划膜式,进口划膜式优于国产划膜式.
因划膜式为软管将抗体划到膜表面,而膜本身的物理性质为软脆,划管会在其表面留下印痕.进口的划膜机由于使用的材料和控制系统较好,所以留下的划痕较轻,而国产仪器较差,留下的划痕也就比较严重. 划痕容易对层析的金标复合物形成阻力,导致假阳性. 同时容易出现跑板时在T线位置出现若有若无一条细线(鬼线),而跑板结束后鬼线消失的奇怪现象.
6. 膜的宽度与点样位置
膜的宽度一般有18mm(or 20mm)和25mm两种, 分别使用在做测试条和做测试板上.
然而,不同的T线点样位置将带来不同的灵敏度. 点样位置上移,金标复合物通过T线位置时速度变慢,反应时间增加,灵敏度升高. 反之灵敏度降低. 这个方法可以用来改变灵敏度和消除假阳性.
7. 溶液在膜上的扩散
溶液在膜上的点样量一般情况下为1ul/cm.
溶液在膜上的扩散是趋向两端的,喷点上去的是均匀的抗体溶液,但当干燥时线条边缘的干燥速度高于中间,中间的抗体会不断向两边扩散,所以干燥后抗体是向线条的两端聚集的.一般情况下不影响你的试验.如果你发现线条出现两端红,中间淡的现象,就要考虑这个问题了.可以加如上面说的作用物质来解决.
8. 点膜前后的封闭作用
从供应商处购买回的膜基本上都是已经优化处理好的,直接点膜就可使用.然而我们还是经常会遇到关于封闭的讨论.
其实封闭不象大家认为的那样,一封闭什么问题都解决了. 老问题走了新问题又来了,而且更麻烦,我要说的是慎用封闭.
我极其反对点膜前封闭的做法. 原因为厂家在生产膜时候,各种配方是混合加入原浆的.而点膜前封闭时要将膜浸泡在封闭液内,必然扰乱了膜内正常的物质分布.由此引发了许多问题,也降低了工作效率. 也有厂家遇到不封闭就无法包被上膜的问题,其实可以通过其他办法来解决,封闭必然是下测.
我经常使用的封闭手法有两种.
流动封闭,将作用物质处理在样品垫上.
膜上定点封闭,将作用物质配成溶液喷点在膜的特定位置上. 该方法需要使用BIODOT的AIRJET喷头.可以将不合格的半成品大板重新复活.
只要是将封闭做在了膜上,就必然会对产品的稳定性造成影响.具体的影响程度要通过稳定性测试来评判.
9. 膜的储存
刚生产出的膜一般含有5-10%的水分. 关于膜的老化机理,有个理论支持,不过争议比较大. 理论认为:膜的老化是因为膜上的水分蒸发,使膜变得疏水,带电荷并变脆. 储存膜一般要求是避光,密封.过干或过湿都不利.在这种保存条件下,一般可以放置两年. 但是如果膜上做了封闭处理,就要根据具体试验情况来判断了.
有些膜由于生产工艺的问题,使用后灵敏度会在一段时间内发生变化,遇到这种问题,就需要在点膜后放置一段时间,待稳定后方可进入调试生产.

⑦ 硝酸纤维素膜NC膜的应用技巧

从本节开始，我们开始对膜进行深入讨论和谈一些应用技巧。
1. 蛋白与膜的结合原理
蛋白与膜的结合原理， 已知的结合力包括疏水作用力H键静电作用力等，确切的结合原理并不明确，主要靠假说来支撑。主要有两种假说：
1）首先两者靠静电作用力结合，然后靠H键和疏水作用来维持长时间结合。
2）首先两者靠疏水作用结合，然后靠静电作用来维持长时间结合。
两条假说，都表明其结合过程分为两步，首先结合和后面长时间结合。由于结合原理的不明确性，导致在这方面的工作非常依赖实践经验。
2. 膜对结合的影响
1）膜孔径
有些技术人员倾向使用膜孔径来区分不同的膜，但是请注意这只仅仅限于同一厂家的产品，如果是不同厂家的产品，这种比较是无意义的。膜孔径与层析速度的关系，已在上文描述。随着膜孔径减小，膜的实际可用表面积递增，膜结合蛋白的量也递增. 估量表面积的参数为表面积比率（实际可用表面积与所用膜平面积的比率）。
另外，膜孔径越小，层析速度也越小，那么金标复合物通过T线的时间也就越长，反应也就越充分。
综合以上两点，结论为膜孔径越小灵敏度越高。但是同时也减慢了跑板速度，增加了非特异性结合的机会，也就是假阳性越高.所以要按照试验结果挑选适合实际项目的膜，找到合适的平衡点。
2）不同厂家的膜差异
这个差异主要来源于两点：
1> 生产膜时，使用的聚合物和表面活性剂的来源，类型，数量不同。同理，在膜处理中这两类物质一般会对性能产生较大影响。 2> 处理过程不同。
3. 生物原料，缓冲溶液的试剂和配方
1）生物原料， 作为CT线的生物原料使用情况各异，所以这里只做略述。
首先，单克隆抗体与膜的结合优于多克隆抗体，主要时由于多克隆抗体有很多不同的表面位点，而各位点与膜的最佳结合条件都有细微的差别，毫无疑问就增加了优化难度。其次，分子量越大，蛋白越难结合到固相材料上。
2）缓冲液
大家最关心的可能就是希望获得一个性能优良的配方，包括缓冲液，封闭液等等处理溶液配方。
其实我也无法提供给你一个万用配方清单。因为不同的反应体系需要不同的配方来支持， 而不同机构的反应体系又有差异。想获”鱼”先学”渔”.。为了不误导大家，我在下面涉及到配方的问题上，仅提供思路，具体配方请自己摸索。
缓冲液的构成一般是：PBS（或其他缓冲体系）+作用物质（针对某一特定问题）+PH调整. 我在参考过以前的各种资料后，个人意见为配方原则为宜简不宜繁，根据自己的需要添加作用物质，原来的很多需要添加的作用物质，由于膜制造技术的改进已经不再需要。
推荐的缓冲体系为0.01M PBS PH7-7.2， 该缓冲体系对多种抗原抗体都有良好的适应性。
作用物质的情况大致罗列如下：
少量NACL，减少信号强度，消假阳。
有机醇（甲醇，异丙醇等），润湿膜，减少膜带有的静电，利于结合包被。个人不推荐，因制膜工艺改进。
表面活性剂（TW20，TX100），增加亲水力，可避免线条中空现象，也可增色。
糖，保护剂，减缓老化速度，也可以增加亲水力同上。
调PH到某个位置，可以消假阳。
4. 点样环境
环境湿度对点膜过程非常重要。最佳湿度一般在45-65%。湿度过低，膜上容易聚集静电荷，点膜容易出现散点，导致测试会出现疏水斑。湿度过高，膜上毛细作用加强，点膜容易引起CT线变宽甚至扩散。为了保证点样时膜湿度的均一性，一般在点样前把膜放到该湿度条件下平衡一段时间。
5. 点样仪器与膜面情况的关系
目前有两种点样方式，划膜式和非接触点膜式.非接触点膜式优于划膜式，进口划膜式优于国产划膜式。
因划膜式为软管将抗体划到膜表面，而膜本身的物理性质为软脆，划管会在其表面留下印痕.进口的划膜机由于使用的材料和控制系统较好，所以留下的划痕较轻，而国产仪器较差，留下的划痕也就比较严重。 划痕容易对层析的金标复合物形成阻力，导致假阳性。 同时容易出现跑板时在T线位置出现若有若无一条细线（鬼线），而跑板结束后鬼线消失的奇怪现象。
6. 膜的宽度与点样位置
膜的宽度一般有18mm（or 20mm）和25mm两种， 分别使用在做测试条和做测试板上。然而，不同的T线点样位置将带来不同的灵敏度。点样位置上移，金标复合物通过T线位置时速度变慢，反应时间增加，灵敏度升高。反之灵敏度降低。这个方法可以用来改变灵敏度和消除假阳性。
7. 溶液在膜上的扩散
溶液在膜上的点样量一般情况下为1ml/cm。溶液在膜上的扩散是趋向两端的，喷点上去的是均匀的抗体溶液，但当干燥时线条边缘的干燥速度高于中间，中间的抗体会不断向两边扩散，所以干燥后抗体是向线条的两端聚集的。一般情况下不影响你的试验。如果你发现线条出现两端红，中间淡的现象，就要考虑这个问题了。可以加如上面说的作用物质来解决。
8. 点膜前后的封闭作用
从供应商处购买回的膜基本上都是已经优化处理好的，直接点膜就可使用.然而我们还是经常会遇到关于封闭的讨论。其实封闭不象大家认为的那样，一封闭什么问题都解决了. 老问题走了新问题又来了，而且更麻烦，我要说的是慎用封闭。我极其反对点膜前封闭的做法。原因为厂家在生产膜时候，各种配方是混合加入原浆的。而点膜前封闭时要将膜浸泡在封闭液内，必然扰乱了膜内正常的物质分布。由此引发了许多问题，也降低了工作效率。也有厂家遇到不封闭就无法包被上膜的问题，其实可以通过其他办法来解决，封闭必然是下测。
我经常使用的封闭手法有两种：流动封闭，将作用物质处理在样品垫上。膜上定点封闭，将作用物质配成溶液喷点在膜的特定位置上。该方法需要使用BIODOT的AIRJET喷头，可以将不合格的半成品大板重新复活。只要是将封闭做在了膜上，就必然会对产品的稳定性造成影响，具体的影响程度要通过稳定性测试来评判。
9. 膜的储存
刚生产出的膜一般含有5-10%的水分。关于膜的老化机理，有个理论支持，不过争议比较大。理论认为：膜的老化是因为膜上的水分蒸发，使膜变得疏水，带电荷并变脆。储存膜一般要求是避光，密封，过干或过湿都不利。在这种保存条件下，一般可以放置两年。但是如果膜上做了封闭处理，就要根据具体试验情况来判断了。有些膜由于生产工艺的问题，使用后灵敏度会在一段时间内发生变化，遇到这种问题，就需要在点膜后放置一段时间，待稳定后方可进入调试生产。
硝酸纤维素膜NC膜
规格: 15X20cm
孔径: 0.45μm
保存: 5-15℃密封保存,保质期一年
产品简介: 本品外观洁白，膜正面呈光泽，与水接触应立即浸润，不能立即浸润老者视为失活，不能点样，膜面有花斑或有粉性结构皆视为次品。用于转移电泳，宜选孔经0.22或0.45，以保证膜的强度，并减少穿透损失，硝纤膜过份干燥时脆,湿时有弹性，操作时室内应保持中常温度，避免过份干燥，防止发脆，本品静电吸附膜的亲水性好，渗滤时间适中，蛋白吸附力强，转膜的蛋白集中而不扩散，显色的灵敏度和特异性高，背景低。

⑧ 硝酸纤维素膜的介绍

硝酸纤维素膜又称为NC膜， 在胶体金试纸中用做C/T线的承载体，同时也是免疫反应的发生处。所以NC膜成为该试验中最重要的耗材。

⑨ 硝酸纤维素膜的作用

硝酸纤维素膜又称为NC膜, 在胶体金试纸中用做C/T线的承载体,同时也是免疫反应的发生处.

⑩ 为什么western blot 中的硝酸纤维素薄膜用前要用甲醇浸泡

为了活化膜上的正电基团，使之更容易跟带负电的蛋白质结合