① 血清蛋白电泳简介
xuè qīng dàn bái diàn yǒng
serum protein electrophoresis
SPE
SPEP
蛋白质等生物分子在缓冲液中带负电荷或正电碧吵荷，在电场中向阳极或阴极运动，称为电泳（electmphomsis）。由于其等电点不同，分子大小、形状和荷质比的不同，使不同蛋白质分子具有不同的电泳迁移率，在一定的支持介质中可借以分离各种蛋白质。常用的电泳技术有：醋酸纤维素薄膜电泳、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、免疫电泳等。血清蛋白电泳以醋酸纤维素薄膜应用最为普遍。
SPE
血清蛋白电泳
血液生化检查 > 蛋白质测定
血液
血清中各种蛋白质都有其特有的等电点，各种蛋白质在各自的等电点时呈电中性状态，它的分子所带正电荷与所带负电荷量相等。将蛋白质置于pH比值等电点较高的缓冲液中，它们将形成带负电荷的质点，在电场中均向正极泳动。由于血清蛋白质的等电点不同，带电荷的量多少差异，蛋白质分子量大小也不同，所以在同一电场中泳动速度也不同。蛋白质分子越小带电越多，移动速度越快；分子越大而带电越少，移动速度越慢。按其泳动速度可以分出以下的主要区带，从正极端起，依次为白蛋白、α1球蛋白和α2球蛋白，β球蛋白和γ球蛋白5条区带。
（1）巴比妥巴比妥钠缓冲液（pH8.6±0.1、μ＝0.06）：以巴比妥2.21g、巴比妥钠12.36g于500ml蒸馏水中，加热溶解，待冷却至室温后加蒸馏水至1000ml。
（2）染色液：
①丽春红S染色液：丽春红9.04g、三氯醋酸6g，用蒸馏水溶解，并稀释至100ml。
②氨基黑10B染色液：氨基黑10B 0.1g，溶于无水乙醇20ml中，加冰醋酸5ml甘油0.5ml使溶解。然后将磺柳酸2.5 g，溶于少量蒸馏水中，加入前液，再以蒸馏水补足至100ml。
（3）漂洗液：
①30ml/L醋酸溶液：用于丽春红染色的漂洗。
②甲醇45ml，冰醋酸5ml和蒸馏水50ml混匀。用于氨基黑10B染色的漂洗。
（4）透明液：柠檬酸（C6H5Na3O7·2H2O）21g和N甲基吡咯烷酮150g，用蒸馏水溶解，并稀释到500ml。亦可选用氢萘或液体石蜡透明。
（5）0.4mol/L氢氧化钠溶液或0.1mol/L氢氧化钠溶液。
（1）将缓冲液加入电泳槽内，调节两侧槽内的缓冲液，使其处于同一平面。
（2）醋酸纤维素薄膜的准备：取醋酸纤维素薄膜（2cm×8cm）在毛面的一端（负极侧）1.5cm处用铅笔轻划一横线，做点样标记。编号，并标明正、负极后，将薄膜置于巴比妥巴比妥钠缓冲液中浸泡，待充分浸透后（一般为20min）取出，夹于洁净滤纸中间吸去多余的缓冲液。
（3）将醋酸纤维素薄膜毛面向上贴于电泳槽支架上拉直。用微量吸管吸取无溶血血清3～5μl于横线处沿横线加样，样品应与薄膜的边缘保持一定的距离，以免电泳图谱中的蛋白区带变形，待血清渗入薄膜后，反转薄膜，使光面朝上，平直地贴于电泳槽支架上，用双层滤纸或四层纱布将薄膜的两端与缓冲液连通，稍待片刻。
（4）接通电源，注意醋酸纤维素薄膜上的正、负极，悔哗侍切勿接错。电压90～150v，电流0.4～0.6mA/cm（不同的电泳仪所需电压，电流可能不同，应灵活掌握），夏季通电45min，冬季通电时间稍长，约为60min，电泳区带展开约25～35mm即可。
（5）染色：通电完毕，取下薄膜直接浸于丽春红S染液或氨基黑10B染色液中，染色5～10min（以白蛋白区带染透为止），然后在漂洗液中漂去剩余染料，直至背景无色为止。
（6）定量：
①比色法：将漂洗的薄膜吸干，剪下各染色的蛋白区带入相应的试管中，在白蛋白管中加0.4mol/L氢氧化钠6ml（计算时吸光度乘以2），其余各管加3ml，振摇数次，置37℃水箱20min使其色泽浸出。氨基黑10B染色用分光光度计在620nm处读取各管吸光度，然后计算出各管的含量（同时做空白管对照）。
丽春红S染色时浸出液用0.1mol/L氢氧化钠，加入量同上法。10min后，白蛋白管内加400ml/L醋酸0.6ml（计算吸光度时乘以2），其余各管加0.3ml，以中和部分氢氧化钠，使色泽加深，必要时离心，取上清液用分光光度计在520nm处读取各管的吸光度（同时作空白对照），然后计算各自的含量。
②光密度计扫描法：A.透明：吸去薄膜上的漂洗液（为防止透明液被稀释影响透明结果），将薄膜浸入透明液中2～3min，然后取出，以滚动的方式平贴于洁净无划痕的载物玻璃片上（切勿产生气泡），将此玻片竖立片刻，除去多余透明液后，置于恒温90℃至100℃的烘箱内，烘烤10～15min，取出冷却至室温，用此法透明的各蛋白区带鲜明，薄膜平整，可供直接扫描和永久保存（用氢萘或液体石蜡透明，应将漂洗过的薄膜烘干后进行透明，此法透明的薄膜不能存久，且易发生皱折）。B.扫描定量：将已透明的薄膜放入全自动光密度计或其他光密度计暗箱内，进行扫描分析。
醋酸纤维素膜电泳法：白蛋白0.61～0.71（61%～71%）、α1球蛋白0.03～0.04（3%～4%），α2球蛋白0.06～0.10（6%～10%），β球蛋白0.07～0.11（7%～11%），γ球蛋白0.09～0.18（9%～18%）。
（1）白蛋白减少：见于慢性肝炎、肝硬化、肝癌等。
（2）α1球蛋白（糖蛋白）增高：见于原发性肝癌。在重型肝炎、肝硬化、肝昏迷时则减少，与白蛋白呈正相关。肝病时测定α1球蛋白对判断肝炎的严重程度和预后有参考价值。一般情况下，α1球蛋白增加示病情较轻，α1球蛋白减少则提示病情较重，在严重肝功能衰竭时，其血清含量可显著降低。
（3）α2球蛋白：病毒性肝炎初期无明显变化，一周后逐渐增加，亚急性肝炎和急性肝坏死、失代偿期肝硬化则减少。
（4）β球蛋白增高：见于脂肪肝、高脂血症、肾病综合征、糖尿病合并高胆固醇血症、梗阻性黄疸、恶性肿瘤。在胆汁淤积性肝病时其含量升高，与α2球蛋白升高相平行。降低于见于急、慢性肝炎，肝硬化，尤以失代偿期肝硬化和坏死肝硬化下降最为显著。
（5）γ球蛋白增高：见于慢性肝炎、肝硬化、肝胆疾患。典型肝硬化尚可见β和γ带相融合，形成βγ桥。肝病患者γ球蛋白的变化可反映病情的严重程度。随病情好转，其含量可逐渐降至正常，如一直在高水平持续不降，提示病情严重，预后不良，并有向慢性肝炎及肝硬化发展的趋势。此外，感染、血吸虫病、多发性骨髓瘤、结缔组织病等也可升高。降低见于丙种球蛋白缺乏症、部分化疗患者等。
另外，多发性骨髓瘤在β球蛋白区带与γ球蛋白区带之间常出现M球蛋白带；双白蛋白血症可见双条白蛋白区带。
（1）每次电泳时应交换电极，可使两侧电泳槽内缓冲液的正、负离子相互交换，从而使缓冲液保持在一定的pH水平，然而，每次电泳时薄膜数量不同，故缓冲液在使用10次后，最好弃去，重新配制，否则影响电泳效果。
（2）电泳槽内缓冲液高度保持一定，过低会出γ球蛋白的电渗现象（向阴极移动）。同时，电泳槽两侧液面应保持水平一致，否则通过薄膜时有虹吸现象，将会影响蛋白质分子的泳动速度。
（3）电泳失败的原因：
①电泳图谱不整齐：常见于点样不均匀，位置不佳，薄膜尚未干燥或水分蒸发，缓冲液变质，电泳时薄膜位置放置不正确，使电流方向不平行等。
②蛋白组分分离不佳：如点样过多，电流过低，薄膜结构过分细致，透水性差，导电差等。
③白蛋白结果偏低：见于染色时间不足，染色液陈旧，不透明直接扫描等。
④薄膜透明不完全：见于温度未达到90℃以上将标本放入烘箱，透明液时间过长或薄膜的浸泡时间不足等。
⑤透明膜上有气泡：见于玻璃片不干净（油脂、污垢等）使薄膜部分与其脱开，贴膜时操作不慎将气泡裹入等。
（4）点加样本时，一定要注意薄膜的毛面和光面，将样本点在毛面上。
（5）放置薄膜时，要注意其正、负极，切勿接错。
② 常用琼脂扩散试验的琼脂浓度为多少
1．材料和试剂
（1）PH8.6，0.1M巴比妥——巴比妥钠缓冲液
巴比妥钠 10.3 g
巴比妥 1.84 g
硫柳汞 100 mg（防腐剂）
蒸馏水加热溶解并定容至500ml
（2）1%预复琼脂（或琼脂糖）
1g琼脂（或琼脂糖）加蒸馏水100ml溶化即可。
（3）1%琼脂糖凝胶
1g琼脂糖加50ml蒸馏水置水溶中煮沸溶解或用与波炉加热溶解（注意不要溢出且注意加入蒸发的水），然后再加入50ml上述巴比妥缓冲液混匀，置4℃保存备用。
（4）抗原及相应免疫血清。
单向琼脂扩散试验 是一种常用的定量检测抗原的方法。将适量稀释后的抗体与等量琼脂混匀，浇注成板，凝固后，在板上打孔，孔径3mm，孔间距10mm，孔中加入抗原，每孔10μL，放置湿盒中，37℃温箱，抗原就会向孔的四周扩散，边扩散边与琼脂中的抗体结合。24h－48h后观察结果，在两者比例适当处形成白色沉淀环。沉淀环的直径与抗原的浓度成正比。如事先用不同浓度的标准抗原制成标准曲线，则从曲线中可求出标本中抗原的含量。本试验主要用于检测标本中各种免疫球蛋白和血清中各种补体成分的含量，敏感性很高。
双向琼脂扩散试验 测定时将加热溶化的琼脂或扮橘琼脂糖浇至玻片上，等琼脂凝固后，打多个小孔，将袜缺山抗原和抗体分别加入小孔内，使抗原和抗体在琼脂板上相互扩散。当二个扩散圈相遇，如抗原和抗体呈特异性的结合且比例适当时，将会形成抗原抗体复合物的沉淀，该沉淀可在琼脂中呈现一条不透明的白色沉淀线。如果抗原与抗体无关，就不会出现沉淀线，因此可以通过该试验，用特异性抗体鉴定抗原，或反之用已知抗原鉴定抗体。
另外沉淀线告中的特征与位置不仅取决于抗原，抗体的特异性和浓度，而且与其分子的大小及扩散速度有关，当抗原体存在多种成分时，将呈现多条沉淀线以至交叉反应线，因此可用来检查抗原和免疫血清的特异性、纯度或浓度比较抗原之间的异同点，因而应用范围较广。
③ 麝香草酚浊度试验简介
shè xiāng cǎo fēn zhuó dù shì yàn
thymol turbidity test
测定血浆蛋白的水平和分析其成分是肝脏疾病重要试验之一。有关这方面的测定在别外章节中已有详尽讨论，本节中主要叙述一些和蛋白质代谢有关的简单血清胶体稳定试验。
各种血清胶体稳定性试验的原理基本相同，但所用的试剂不同，促进和抑制絮浊的作用有差异，目前临床常用的有TTT试验。
麝香草酚浊度试验
血液生化检查 > 蛋白质测定
血液
肝脏疾病时，血清蛋白的质与量有所改变，当血清和麝香草酚巴比巴比妥液试剂作用时，麝香草酚可减低血清内脂类物质的分散力，而血清经低离子强度的巴比妥缓冲液稀释后，球蛋白的部分溶解度降低而产生沉淀，这种沉淀是球蛋白、脂类和麝香草酚复合体，使溶液变浊，其浑浊程度与沉淀的多少与肝病的严重程度有并野一定的关系。
麝香草酚缓冲液配制有两种常用方法：
（1）麝香草酚巴比妥缓冲液（pH7.55±0.05）精确称取巴比妥3.09g、巴比妥钠1.69g及麝香草酚6g，倒入经煮沸除去二氧化化碳的1000ml热蒸馏水中，继续加热使溶解。室温静置过夜，若显混浊，可加麝香草酚细末少许。并激烈振荡使结晶析出，过滤后得透明溶液。此液pH7.55±0.05，装瓶内塞紧贮室温备用。若发现混浊丢弃不用。
（2）麝香草酚TrisHCl缓冲液的配制：
①0.5mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液（pH7.7）：称取Tris60.6g，加约800ml蒸馏水溶解，用10mol/L HCl（约加35ml）调节至pH7.7。
②100g/L麝香草酚乙醇溶液：重结晶麝香草酚10g，溶于95%乙醇中，并加乙醇至100ml。塞紧置冷处贮存。
③麝香草酚TrisHCl缓冲液：取蒸馏水约800ml，加热至40～50℃，加入0.5mol/L TrisHCl缓冲液20ml，边摇边加入100g/L麝香草酚乙醇溶液10ml，最后加水至1000ml，充分混匀。室温中可至少保存3个月。
取与标准比浊管口径相同的试管，加入新鲜血清0.05ml，再加入麝香草酚巴比巴比妥缓冲液3ml，混合，室温静置30min，再颠倒混合数次。目视比浊时，可背朝光，比浊管下衬有字白纸，辨认字迹清晰程度来判定浊度单位。与测定管浊度相同的标准比浊管的单位数，即为测定血清的单位数。如用分光光度计比浊时，以麝香草酚巴比巴比妥缓冲液校正“0”点，波长650nm，读取测定管的吸光度，查标准曲线求出浊度单位。
0～6u。
各类血清胶体稳定性试验在不同的肝病或同一疾病的不同时期，其阳性率可有差异，各有其一定临床意义。
（1）急性肝炎的诊断：在急性肝炎和急性肝损害时，各类血清絮状、浊度试验均可出现阳性，总阳性率约80%～90%。TTT于发病一周开始升高，二周时达高峰，以后逐渐降至正常。这些改变可在黄疸前期即出现，故对急性肝炎有早期诊断意义，但不如转氨酶敏感，阳性率也比转氨酶低。出现阳性时期较转氨酶为迟，这是因为蛋白质的更新须有一定时间，如白蛋白的半寿期10～36天，因此肝脏疾病引起的蛋白质的变化常需一定时间才能表现出来。在无黄疸绝困喊型肝炎病例，血清胶尺嫌体稳定性试验常可作为诊断的敏感指标。如急性肝炎絮浊试验持续阳性，提示肝病有转入慢性化的趋势。
（2）肝炎与肝硬化病情的判断：在急性肝炎时，TTT的变化和血清脂质升降相平行，但随着病变的迁延化、慢性化、则与血清γ球蛋白呈正相关，故TTT持续阳性是肝病迁延化、慢性化的反映。
（3）阻塞性黄疸与肝炎的鉴别：当阻塞性黄疸患者尚无肝细胞损害时，各类血清絮浊试验多属阴性，与急性肝实质损害时不同，对于鉴别黄疸类型有一定价值。但在长期阻塞性黄疸或合并感染的病人，肝实质亦常有损害，此试验亦能呈阳性，但一般见于病程中、后期。在长期黄疸病例，如血清絮浊试验持续阴性，应考虑先天性黄疸的可能。
（4）严重妊娠恶阻与妊娠合并肝炎的鉴别：妊娠恶阻时可出现中度的高胆红素血症和转氨酶升高，但血清絮浊试验几乎全都正常；相反，妊娠合并肝炎时则在90%以上病例血清絮浊试验均呈阳性反应。
（5）脂肪肝时，TTT常升高。有人测定TTT/ZnTT比值，发现在脂肪肝时较慢性肝炎为高，认为可借此比值变化作为两者鉴别诊断的参考。在转移性肝癌时，TTT值较原发性肝癌时为低，因此对肝癌病例，此试验呈低值者宜先考虑转移性肝癌，呈高值者优先考虑原发性肝癌，但这仅有参考价值，主要还应根据临床。
在血吸虫性肝硬变时，血清絮浊试验常可阳性。
（6）肝外疾病：血清胶体稳定性试验对肝病并不具有特异性，在其他可发生白蛋白减少、球蛋白（γ或β球蛋白）或类脂质增加的疾病如疟疾、结缔组织疾病、黑热病、亚急性细菌性心内膜炎、多发性骨髓瘤等疾患时，亦可呈阳性反应。
TTT是一个很简单的试验，但各试验室间出入往往不小。造成此差异因素很多；首先是虽然同称为TTT试验，但各个实验室在试剂配制，标准曲线绘制或标准管配制方法上并不相同。
（1）国内所报告的TTT单位为Shank（襄克）单位。1944年Maclagen（麦克莱根）首先建立TTT试验，当时以Kingsley（金斯莱）尿蛋白比浊管表示TTT浊度单位（相当于10mg/dl尿蛋白溶液加磺柳酸所显示的浊度为一个Maclagan单位）。后来，Shank和Hoagland改用BaSO4悬液作为浊度标准，由0.0962mol/L BaCl2加H2SO4所产生的浊度相当于Maclagan所应用的Kingsley标准。但在发表文章
时，误印为0.0962N BaCl2，因此测定结果为麦氏单位的二倍（1个麦氏单位＝2个Shank单位）。
（2）血清要新鲜，应早晨空腹抽血。用分光光度计比浊法测定麝浊时，如血内脂质较多，可用生理盐水6ml代替缓冲液稀释血清，作空白管。
（3）麝香草酚巴比妥缓冲液的pH应在7.50～7.60。pH增高，敏感度降低，可出现假阴性；pH降低，敏感度升高，可出现假阳性。
（4）为了简化手续，不少实验室用100g/L麝香草酚乙醇溶液，直接加入巴比妥缓冲液中，省去结晶和过滤步骤，但此配方较原法多含1%乙醇，试验结果表明比原配方的浊度偏离约20%，絮状试验阳性率反而降低。
（5）麝香草酚浊度试浊度试验结果随温度的改变而有所变化。一般是温度高，浊度低；温度低，浊度高。为了克服这一误差，可以从表1上将不同温度下的浊度结果换算成25℃的结果以便于比较。
使用说明：以6u一行为例，在10℃时测定的6u，实际上在25℃时为4.7u。在30℃时测定的6u，在25℃时为7.2u。余类推。
（6）配制硫酸钡标准比浊管时注意以下几点：①硫酸试剂的浓度硫酸在反应中虽然是过量的，但当浓度小于0.1mol/L，形成的硫酸钡浊度低；浓度大于0.1mol/L浊度增高。因此，硫酸试剂须严格校正至0.1mol/L。②反应温度：10℃时形成的硫酸钡颗粒细，浊度较高，结果重复性好。25℃、30℃、37℃时形成的颗粒较粗，浊度较低，重复性不易控制。③操作手法：混和方法不同，形成的硫酸钡颗粒大小不同，结果相差很大。所以，每次按规定操作可提高精密度。
（7）麝香草酚缓冲液易变质，但如保存于冰箱中，可因结晶逐渐析出而降低敏感度，故平时使用时，仍应置室温中，如显混浊，即不能用。
（8）麝香草酚应为洁白晶体，如带黄色，须重结晶处理。可按下法重结晶精制：取麝香草酚100g，溶于100ml 95%乙醇中，以吸滤漏斗过滤。滤液中加入于100ml冷蒸馏水，混匀。静置20min后吸滤，用冷蒸馏水洗结晶两次，可得到洁白的结晶，置干燥器内待完全干燥后使用。
（9）用巴比妥配制的试剂不能久置，超过2周后，TTT结果有增高趋势，一个月后明显偏高。一般认为此试剂不稳定与巴比妥有关，因为久置后，巴比妥试剂的红外线吸收曲线已有明显变化。本文所介绍麝香草酚TrisHCl缓冲液，具有稳定性高，所配TTT试剂放室温至少可保存3个月，且浊度结果受室温变化的影响小。
（10）光电比浊法与光电比色法有所不同，比浊法混浊液除了吸收一部分入射光以外，悬浮的颗粒还能使一部分入射光反射和折射，因此光电池所感受的光除了经过吸收以后的出射光外，还有折射的光，后者不是平行光束，混和液和光电池之间距离越大，则折射光的影响越小。所以在采用72型分光光度计比浊时，比色杯的位置应放在比色杯座的远光电池的一边，可以提高准确度。
（11）麝香草酚缓冲液中麝香草酚含量是影响结果的重要因素之一。浊度单位高低和麝香草酚含量成正比，要求使用25℃的麝香草酚饱和溶液。
缓冲液中麝香草酚含量测定法：麝香草酚标准液（1ml含0.1mg）：准确称取试剂规格麝香草酚100mg，加水溶解后加水至1L。
取待测麝香草酚缓冲液1ml，用水稀释至10ml，以后按表2进行测定。
混匀37℃水浴放置15min，750nm比色，以空白管校正吸光度至零，读取各管吸光度，按下式计算：
④ 液时，所用蒸馏水为什么需预先煮沸
因为蒸馏水和空气中都有二氧化碳。当巴比妥类药物的钠盐或苯妥英钠注射液中溶入二氧化碳时,就会分解成不溶于水的巴比妥类药物和苯妥英,而使溶液变浑浊。所以,配制巴比妥类药物的钠盐或苯妥英钠注射液时,所用蒸馏水需预先煮沸,接触的空气要用氢氧化钠液处理。
⑤ 血清补体C4简介
xuè qīng bǔ tǐ C4
serum plement C4
C4是一种β球蛋白，在肝脏、淋巴组织、骨髓、腹膜巨噬细胞、单核细胞等组织合成。C4参与补体的经典激活途径。
血清补体C4
免疫学检查 > 血清补体测定
血液
抗原在含有一定量的单一抗体琼脂中进行电泳，在电场力的作用下，两者比例合适时形成沉淀峰类似火箭而得名。沉淀峰的高度与抗原浓度成正比，与抗体浓度成反比，因此可以作为抗伏毁原定量试验。
（1）0.025mol/L pH8.6巴比妥缓冲液称巴比妥钠10.3g，巴比妥1.84g，加入蒸馏水500ml，加热助溶，待冷，加蒸馏水至1000ml，即成0.05mol/L pH8.6巴比妥缓冲液。再取0.05mol/L巴比妥缓冲液1份，加等量的蒸馏水即成0.025mol/L pH8.6巴比妥缓冲液。
（2）10.0g/L琼脂糖凝胶（用巴比妥缓冲液配制）。
（3）抗C4血清、C4参考血清及待检血清。
（1）制备抗体琼脂糖板：取已融化的10.0g/L琼脂糖凝胶与适当浓度的抗C4血清混合，浇板（8cm×8.5cm），待冷却凝固后打孔。
（2）在距一边1cm处打孔8个，孔径为3mm，孔间距5mm，挑去孔内琼脂糖。
（3）各孔内分别加入1∶4稀释的待检血清和不同浓度的C4参考血清10μl。以三层滤纸为桥，置0.025mol/L pH8.6巴比妥缓冲液的电泳槽内进行电泳，将有孔的一端连接阴极，端电压3～4V/cm，电泳4～5h后，关闭电源，取下琼脂板测量。
130～370mg/L。
C4含量升高见于风湿热的急性期、结节性动脉周围炎、皮肌炎、心肌梗塞、Reiter综合征和各种类型的关节炎等；降低常见于自身免疫性慢活肝、SLE、多发性硬化、类风湿性关节炎、肾病、亚急性硬化性全脑炎等。在SLE，C4的降低常早于其他补体成分，且较其他成分回升迟。狼疮性肾炎较非狼疮性肾炎C4值显著低下。
（1）抗原、抗体比例要适宜。抗原过浓不能得到圆锥状尖峰，缺慧备而抗体太浓使沉淀峰太低，影响试碧液验的灵敏度。
（2）加样后马上电泳，且标本不要太多，以防止峰形变宽。
（3）C4不很稳定，在4℃贮存2周或―20℃60d均可使C4值增加36%左右。而在1周内还是相对稳定的。
⑥ 戊巴比妥钠可以加热溶解吗
可以。戊巴比妥钠是一种有机物，可以加热溶解。戊巴比妥钠本姿碧碧品为白色结晶性颗粒或粉末，迹举有吸湿性慧差，易溶于水和乙醇。溶液久置易分解，加热分解更快。
⑦ 琼脂糖甲醛变性凝胶电泳
5月25日 09:54 琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖是从琼脂中提纯出来的，主要是由D－半乳糖和3,6脱水L－半乳糖连接而成的一种线性多糖。琼脂糖凝胶的制作是将干的琼脂糖悬浮于缓冲液中，通常使用的浓度是1％－3％，加热煮沸至溶液变为澄清，注入模板后室温下冷却凝聚即成琼脂糖凝胶。琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成较为稳定的交联结构，这种交联的结构使琼脂糖凝胶有较好的抗对流性质。琼脂糖凝胶的孔径可以通过琼脂糖的最初浓度来控制，低浓度的琼脂糖形成较大的孔径，而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径。尽管琼脂糖本身没有电荷，但一些糖基可能会被羧基、甲氧基特别是硫酸根不同程度的取代，使得琼脂糖凝胶表面带有一定的电荷，引起电泳过程中发生电渗以及样品和凝胶间的静电相互作用，影响分离效果。市售的琼脂糖有不同的提纯等级，主要以硫酸根的含量为指标，硫酸根的含量越少，提纯等级越高。
琼脂糖凝胶可以用于蛋白质和核酸的电泳支持介质，尤其适合于核酸的提纯、分析。如浓度为1％的琼脂糖凝胶的孔径对于蛋白质来说是比较大的，对蛋白质的阻碍作用较小，这时蛋白质分子大小对电泳迁移率的影响相对较小，所以适用于一些忽略蛋白质大小而只根据蛋白质天然电荷来进行分离的电泳技术，如免疫电泳、平板等电聚焦电泳等。琼脂糖也适合于DNA、RNA分子的分离、分析，由于DNA、RNA分子通常较大，所以在分离过程中会存在一定的摩擦阻碍作用，这时分子的大小会对电泳迁移率产生明显影响。例如对于双链DNA，电泳迁移率的大小主要与DNA分子大小有关，而与碱基排列及组成无关。另外，一些低熔点的琼脂糖（62 ~ 65 °C）可以在65 °C时熔化，因此其中的样品如DNA可以重新溶解到溶液中而回收。
由于琼脂糖凝胶的弹性较差，难以从小管中取出，所以一般琼脂糖凝胶不适合于管状电泳，管状电泳通常采用聚丙烯酰胺凝胶。琼脂糖凝胶通常是形成水平式板状凝胶，用于等电聚焦、免疫电泳等蛋白质电泳，以及DNA、RNA的分析。垂直式电泳应用得相对较少。
简单介绍一个关于琼脂糖凝胶电泳的实验
CK同工酶的测定
标本采集、处理和贮存
CK同工酶检测血清和血浆均可。在4℃可保存数天，-15℃可保存2周，若用血浆宜用EGTA，而不用EDTA抗凝。冷冻血浆测定时，应在30℃以下融化，需反复冰融者应加还原剂——巯基乙醇以稳定酶活性，速冻及贮存于-20℃或-70℃，在有β-巯基乙醇和EGTA存在时，MM和MB可稳定数年，而BB则仅稳定半年。由于CK同工酶半衰期短，故酶活性的高低受标本采集时间的影响较大。
琼脂糖凝胶电泳法
1.原理
CK分子是由M和B两种亚单位组成的二聚体，在电泳条件下，CK-BB迁移最快，CK-MB居中，CK-MM最慢。电泳后进行酶促反应显色，观察结果。显色原理是：CK催化磷酸肌酸(CrP)及ADP，产生肌酸(Cr)及ATP，在偶联的HK催化下葡萄糖被ATP磷酸化，形成G-6-P；在偶联的G-6-PD催化下G-6-P被NADP+氧化，形成6-P-G，同时NADP+还原为NADPH。在365nm观察NADPH的荧光或用荧光光密度计扫描定量。也可用四氮唑盐显色法，即利用酚嗪二甲酯硫酸盐(PMS)将NADPH的氢传递给氯化碘代硝基四唑(INT)，使其还原成紫红色的甲鐟，显示CK同工酶区带。
2.试剂
① 50mmol／L Tris-巴比妥缓冲液(pH8.0)：称取巴比妥6.716g，Tris 1.905g，溶于蒸馏水中并稀释到1L，电泳用。
② 30mmol／L Tris-巴比妥缓冲液(pH8.6)：称取巴比妥1.21g，Tris 1.15g，以蒸馏水溶解并稀释到500mL。
③ 5g／L琼脂糖[内含14g／L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)]：称取0．5g琼脂糖，1.4gPVP，加试剂“②”100mL隔水煮沸溶解，分装后4℃保存。
④ 400mmol／L Bis-Tris缓冲液(内含20mmol／L醋酸镁、4mmol／L EDTA)，pH7.0：称取Bis-Tris 8.36g，EDTA Na2•2H2O 0.149g，加蒸馏水95ml溶解，用lmol／L醋酸调至pH7.0后，称取醋酸镁(含4分子水)0.429g，加入，用蒸馏水稀释到100mL。4'C保存可用2个月，-20℃保存可用6个月。
⑤ 辅酶溶液(ADP 4mmol／L，AMP10mmol／L，NADP+4mmol／L，葡萄糖40mmol／L)：称取ADP 17.1mg，AMP36.5mg，NADP+29.7mg，葡萄糖72.1mg，加试剂“④”9mL平衡至25℃后，用lmol／L醋酸调pH至6.4(约用lml)，在4℃保存可用半个月。
⑥ 底物显色液甲(按两张载玻片计)：用前于甲管中加试剂“⑤”1.5mL，己糖激酶10.5 U，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶6 U。混合后置37℃水浴5min，加入PMS 0.02mg(2g／LPMS 0.01m1)。PMS须避光。在加PMS前的5min内配好底物显色液乙，加PMS后，立即与乙液混合并覆盖于电泳凝胶板上。
⑦ 底物显色液乙：先配制下列试剂；
A. 450mmol几磷酸肌酸：存4℃可用3个月。
B. 5g／L氯化碘代硝基四唑：置棕色瓶贮存，4℃可用3个月。
C. 12.5g／L琼脂糖(含62.5mmol／L氯化钠及35g／L聚乙烯吡咯烷酮)：称取1.25g琼脂糖，加入100mL蒸馏水，隔水煮沸溶解后，再加入氯化钠262.5mg及聚乙烯毗咯烷酮3.5g，溶解后分装，置4℃保存。
用前于乙管中加入“A”液0.2mL,“B”0.2mL，置37℃水浴2min后，加入N-乙酰半胱氨酸(NAC)20mg，或还原型谷胱甘肽10mg。用预温至37℃的滴管吸人，隔水煮沸融化后，温度降至37～43℃(在37～43℃的水浴箱中平衡)的“C”液1.2mL，滴管吹吸混合，使NAC溶解。
⑧ 混合底物显色液：当乙液配成后，立即吸甲液入乙液中，混合后立即使用。在水浴箱中操作，防止琼脂糖凝固。必要时用0.2mL蒸馏水代磷酸肌酸溶液制备对照显色液。如作荧光法，用不含PMS及INT的甲、乙液，用蒸馏水代INT溶液。
3.操作
(1)隔水煮沸溶解试剂“③”，取1.5mL铺于1～1.2mm厚的载玻片上。于近阴极端并行挖两个槽，作两份标本，或作标本与控制物。
(2)加样5μL，80V电泳50min。
(3)合理安排配制混合底物显色液的时间，使配制完成时电泳结束。
(4)将电泳凝胶板置涂以黑漆的铝盒中，吸底物显色液1.5mL铺于凝胶板上，加盖，待凝后置37 ℃水浴1小时。
(5)置固定液(乙醇：醋酸：水＝150:10:40)中2～4小时，转入蒸馏水中数小时，取出观察结果或用光密度计在500nm波长下扫描定量。需要时可平推至空白卡片纸上，37℃孵箱过夜，干片保存。或用无PMS、INT底物显色液，37℃水箱孵育20min。
(6)再置60℃干燥箱中20min,在紫外灯(365nm)下观察荧光。有条件者用荧光光密度计扫描定量，激发波长360nm，发射波长460nm。
4.结果观察
琼脂糖凝胶电泳法的结果观察如图9-14所示。
5.注意事项
广泛存在于各种组织的腺苷酸激酶(AK)催化ADP产生ATP，干扰同工酶结果的判断。加入AMP可抑制此反应，但过量AMP也抑制CK。NaF抑制AK，不抑制CK，与AMP合用可抑制各种AK同工酶的97％。NaF与CK激活剂Mg2+可逐渐形成MgF2沉淀，所以，NaF与Mg2+分开配制，临时混合，不影响各自的作用。电泳需较高pH，酶反应需较低pH，本法中用低离子强度，pH低于8.6的电泳缓冲液；高离子强度，pH低于6.7的基质缓冲液。当含琼脂糖的基质显色剂覆盖于电泳后的凝胶板，上下凝胶中的成分相互扩散后的pH，恰为酶作用的最适pH。Bis-Tris全名为Bis(2-羟乙基)亚氨基-Tris(羟甲基)甲烷，25℃时pKa＝6.46，是CK同工酶。测定优选的缓冲剂，200mmol/L时，CK活力最大。如无Bis-Tris；亦可用咪唑加EDTA作基质缓冲液。EDTA作Ca2+的络合剂，因Ca2+抑制CK活力。血清CK活力随温度升高而增加，直至45℃；更高温度迅速下降，56℃时很快失活。琼脂糖电泳法测CK同工酶，绝不能象作LDH同工酶用温度较高的琼脂糖基质显色液，否则CK活力丧失。而非脱氢酶反应(Nothingdehydogenase，NDH)显著。NDH是相当于白蛋白及β球蛋白区带处的紫红色区带，与蛋白质的巯基有关，标本用量大，pH高时尤其明显，仅四唑盐及PMS就可与标本产生，用测NADPH荧光法可避免。本法中标本用量少，显色时pH较低，NDH反应不明显。CK是巯基酶，绝对需要巯基试剂活化。但巯基试剂可还原四唑盐，N-乙酰半胱氨酸及谷胱甘肽还原四唑盐能力弱，可使背景清晰。PVP是隋性聚合体，作为酶扩散的障碍物加入，可改善区带分离效果。CK不稳定，对光、热及高pH敏感，最好将及时分出的血清充C02后塞紧管口，置冰室或-30℃保存，至少可稳定半个月，及时测定更好。不主张加巯基活化剂保存。影响CK同工酶电泳与显色的因素很多，必须同时作控制物。
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该回答在5月25日 09:58由回答者修改过
参考文献：仪器信息网，http://www.xbmu.e.cn/k
⑧ 琼脂点扩散交叉拮抗试验法是怎样做的
实验材料：
1．材料和试剂
（1）PH8.6，0.1M巴比妥——巴比妥钠缓冲液
巴比妥钠 10.3 g
巴比妥 1.84 g
硫柳汞 100 mg（防腐剂）
蒸馏水加热溶解并定容至500ml
（2）1%预复琼脂（或琼脂糖）
1g琼脂（或琼脂糖）加蒸馏水100ml溶化即可。
（3）1%琼脂糖凝胶
1g琼脂糖加50ml蒸馏水置水溶中煮沸溶解或用与波炉加热溶解（注意不要溢出且注意加入蒸发的水），然后再加入50ml上述巴比妥缓冲液混匀，置4℃保存备用。
（4）抗原及相应免疫血清。
2．设备和器材
玻璃板、模具，打孔器和挑针、滴管、有盖搪瓷盒（内铺有湿润的滤纸）、温箱（25℃）、三角烧杯、玻璃搅拌、微量加样器、其他常用器材。
四 操作步骤：
1．预复琼脂玻板的制备
将溶化的1%预复琼脂用滴管加玻板上，使之能将表面覆盖即可，放于温箱内干燥（或自然干燥），即可用以制备凝胶板。
2．凝胶板的制备
溶化琼脂糖，在水平桌上将溶化的琼脂糖倒在预复琼脂玻板上，制成厚度约3～4mm厚的琼脂糖凝胶板，待冷却后根据所需形状打孔（注意不宜在室温下放置过久，尽量缩短操作时间，以免干燥）。
梅花型：
3．免疫扩散及结果观察
将抗原加入中心孔，腔或倍比稀释的免疫血清加入周围孔，留1孔加双蒸水，以作空白对照（注意：加样至孔满为止，不可外溢）。待孔内液体渗入凝胶后即可放于温盒中（如需要可重复加样，加样间隔时间应掌握在第一次加样后孔内液体尚未完全扩散完的情况下即加入，以免孔周围形成不透明的白色圈）。湿盒于25℃中，一般保温24～48h，观察抗原抗体产生的白色沉淀线。
免疫血清的滴度以一定抗原浓度下出现白色沉淀线的最高稀释度来表示。
如不知抗原浓度是否与免疫血清相当时，抗原也可倍比稀释，多做几个梅花孔以作比较。
4、标本的保存
为了保存标本，可染色处理，步骤如下：判盯
（1）用生理盐水浸洗待保存的玻板2～3天，每天换水1～2次，洗去多余的抗原抗体及其他蛋白。
（2）浸洗后于玻板的凝掘圆和胶上加5%甘油或用0.5%琼脂填孔防裂，用湿的优质滤纸覆在凝胶上（两者之间不要有空气），37℃过液使其彻底干燥。
（3）打湿滤纸，轻轻揭下，洗净胶面。
（4）用0.05%氨基黑（用5%醋酸配）染色10min，再用5%醋酸脱色至背景无色为止，干燥保存。也可用0.1～0.5%考马斯亮蓝（10～20%醋酸配制）染色5～15min，再用10～20%醋酸脱色至背景无色，干燥保存。
⑨ 以丙二酸二乙酯为原料合成异巴比妥的方法
采用化学合成：
巴比妥中间体二乙基丙余袜二酸二乙酯的合成方法,包括如下步骤:在反应容竖陆激器中加入乙醇胺1.13mol,氯化亚铜0.5mol,控制搅拌速度130—160rpm,待乙醇胺完全溶解之后,滴加丙二酸悉消二乙酯0.65mol,滴加时间控制在2—3h。
⑩ 谁能解释一下这段话，关于麝香草酚浊度试验的
麝香草酚浊度试验（TTT，Thymol Turbity Test）医学检查方法之一
1. 正常参考值
0～6u（浊度试验） －或+（絮状试验)
2. 临床意义
急性肝炎的诊断急性肝炎（病毒性、中毒性）TTT阳性率达60%～80%，发病1周开始升高，2周达高峰，以后逐渐恢复。 肝炎与肝硬化病情诊断慢性肝炎、肝硬化伴进行性肝损害，TTT明显升高。 阻塞性黄疸与肝炎的鉴别无肝细胞损害，TTT正常，急性肝实质损害，TTT升高。 其他疾病疟疾、血吸虫、系统性红斑狼疮及各种亚急性、慢性细菌感染等。
3、实验基本步骤
(一)原理 当血清与麝香草酚巴比妥缓液春冲液作用时，其中麝香草酚可减低血清内类脂质的分散力，而血清经巴比妥缓冲液稀释后，球蛋白部分溶解度减低而发生沉淀，此沉淀为球蛋白、类脂质和麝香草酚的复合体，使溶液变浊，与标准管比较，即得浊度的单位数。 (二)试剂 1．麝香草酚巴比妥缓冲液(pH7．8)。称取巴比妥钠1.03g，巴比妥1．38g,加蒸馏水500m1，加热至沸，放冷后，加入10%麝香草酚酒精溶液5m1，用力摇匀，塞好瓶口，置室温下过夜，过滤后备用。 国内有配制此液的片剂供应，临用时稀释即成，适用于基层单位。 2．硫酸钡人工标准管的制备。称取结晶氮化钡1.175g，或无水氯化钡1.0g，溶于蒸馏水内，使成100m1，即成0.048mol/L氯化钡溶液。另于100m1容量瓶内加入0.1mol/L硫酸液约70m1，滴加上述氯化钡液3ml，边加边摇，再以0.1mol/l硫酸液稀释至刻度处，混匀后，即成乳白色硫酸钡标准混悬液。此液相当于22.2麦氏单位(Maclagan Unit)。 取口径，厚度，颜色相同的小试碧搏管20支，按下表配制标准管，加液后混匀，然后加塞浸蜡密封。如日久变质，应重新配制。 (三)方法 1．浊度试验。取与标准悔埋祥管口径一致的试管1支，加血清0.1ml，再加麝香草酚巴比妥缓冲液6m1，混合，放置30min，以带黑字白纸为背景，与标准管目测比浊，求得浊度单位数。 如用光电比浊时，将测定液置于比色杯中，用520nm或绿色滤光板，以蒸馏水调零点，读取光密度数，查标准曲线，即得浊度单位数。 标准曲线绘制：按上表配制不同浓度的标准液，用520nm或绿色滤光板比浊，以蒸馏水调零点，读取各管光密度数。以光密度为纵座标，以单位数为横座标，绘成标准曲线。 2．絮状试验。血清经麝香草酚浊度试验后，继续将试管放置室温下24h，观察其底部有无絮状沉淀，可按下列标准判断结果： “—”液体呈均匀的乳白色，无颗粒出现， “+”液体呈细颗粒状，管底有极少量沉淀， “++”液体呈较粗的絮状物，管底有沉淀， “+++”管底有较多的絮状沉淀，但上层液体仍有轻度浑浊， “++++”上层液体几乎完全澄清，管底有大量絮状物。 健康家畜血清絮状试验为“—”或“+”，作为阴性反应。 “++”以上判为阳性反应。 (四)注意事项 血清必须新鲜，最好空腹采血，因血脂增高时可使浊度增加。 麝香草酚巴比妥缓冲液的pH值对试验的敏感度影响很大，一般要求pH7．8。