離子交換層析脂肪酶洗脫曲線

Ⅰ 用洗脫曲線說明ASP和lys的出峰次數並解釋

應該是出峰順序吧，先是Asp再Lys。陽離子交換樹脂，Asp在pH5.3中帶負電被排斥先洗出，Lys帶正電與樹脂交換。

Ⅱ 既有分子排阻作用，又有離子交換功能的填料

色譜分析法基本原理
色譜法，又稱層析法。根據其分離原理，有吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜與排阻色譜等方法。

Ⅲ 大學生化重點

第一章 氨基酸和蛋白質
一、組成蛋白質的20種氨基酸的分類
1、非極性氨基酸
包括：甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸
2、極性氨基酸
極性中性氨基酸：色氨酸、酪氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬醯胺、谷氨醯胺、蘇氨酸
酸性氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸
鹼性氨基酸：賴氨酸、精氨酸、組氨酸
其中：屬於芳香族氨基酸的是：色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸
屬於亞氨基酸的是：脯氨酸
含硫氨基酸包括：半胱氨酸、蛋氨酸
注意：在識記時可以只記第一個字，如鹼性氨基酸包括：賴精組
二、氨基酸的理化性質
1、兩性解離及等電點
氨基酸分子中有游離的氨基和游離的羧基，能與酸或鹼類物質結合成鹽，故它是一種兩性電解質。
在某一PH的溶液中，氨基酸解離成陽離子和陰離子的趨勢及程度相等，成為兼性離子，呈電中性，此時溶液的PH稱為該氨基酸的等電點。
2、氨基酸的紫外吸收性質
芳香族氨基酸在280nm波長附近有最大的紫外吸收峰，由於大多數蛋白質含有這些氨基酸殘基，氨基酸殘基數與蛋白質含量成正比，故通過對280nm波長的紫外吸光度的測量可對蛋白質溶液進行定量分析。
3、茚三酮反應
氨基酸的氨基與茚三酮水合物反應可生成藍紫色化合物，此化合物最大吸收峰在570nm波長處。由於此吸收峰值的大小與氨基酸釋放出的氨量成正比
三、肽
兩分子氨基酸可借一分子所含的氨基與另一分子所帶的羧基脫去1分子水縮合成最簡單的二肽。二肽中游離的氨基和羧基繼續借脫水作用縮合連成多肽。10個以內氨基酸連接而成多肽稱為寡肽；39個氨基酸殘基組成的促腎上腺皮質激素稱為多肽；51個氨基酸殘基組成的胰島素歸為蛋白質。
多肽連中的自由氨基末端稱為N端，自由羧基末端稱為C端，命名從N端指向C端。
人體內存在許多具有生物活性的肽，重要的有：
谷胱甘肽（GSH）：是由谷、半胱和甘氨酸組成的三肽。半胱氨酸的巰基是該化合物的主要功能基團。GSH的巰基具有還原性，可作為體內重要的還原劑保護體內蛋白質或酶分子中巰基免被氧化，使蛋白質或酶處於活性狀態。
四、蛋白質的分子結構
1、蛋白質的一級結構：即蛋白質分子中氨基酸的排列順序。
主要化學鍵：肽鍵，有些蛋白質還包含二硫鍵。
2、蛋白質的高級結構：包括二級、三級、四級結構。
1）蛋白質的二級結構：指蛋白質分子中某一段肽鏈的局部空間結構，也就是該段肽鏈骨架原子的相對空間位置，並不涉及氨基酸殘基側鏈的構象。二級結構以一級結構為基礎，多為短距離效應。可分為：
α-螺旋：多肽鏈主鏈圍繞中心軸呈有規律地螺旋式上升，順時鍾走向，即右手螺旋，每隔3.6個氨基酸殘基上升一圈，螺距為0.540nm。α-螺旋的每個肽鍵的N-H和第四個肽鍵的羧基氧形成氫鍵，氫鍵的方向與螺旋長軸基本平形。
β-折疊：多肽鏈充分伸展，各肽鍵平面折疊成鋸齒狀結構，側鏈R基團交錯位於鋸齒狀結構上下方；它們之間靠鏈間肽鍵羧基上的氧和亞氨基上的氫形成氫鍵維系構象穩定．
β-轉角：常發生於肽鏈進行180度回折時的轉角上，常有4個氨基酸殘基組成，第二個殘基常為脯氨酸。
無規捲曲：無確定規律性的那段肽鏈。
主要化學鍵：氫鍵。
2）蛋白質的三級結構：指整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對空間位置，顯示為長距離效應。
主要化學鍵：疏水鍵（最主要）、鹽鍵、二硫鍵、氫鍵、范德華力。
3）蛋白質的四級結構：對蛋白質分子的二、三級結構而言，只涉及一條多肽鏈捲曲而成的蛋白質。【在體內有許多蛋白質分子含有二條或多條肽鏈，每一條多肽鏈都有其完整的三級結構，稱為蛋白質的亞基】，亞基與亞基之間呈特定的三維空間排布，並以非共價鍵相連接。這種蛋白質分子中各個亞基的空間排布及亞基接觸部位的布局和相互作用，為四級結構。由一條肽鏈形成的蛋白質沒有四級結構。
主要化學鍵：疏水鍵、氫鍵、離子鍵
五、蛋白質結構與功能關系
1、蛋白質一級結構是空間構象和特定生物學功能的基礎。一級結構相似的多肽或蛋白質，其空間構象以及功能也相似。
尿素或鹽酸胍可破壞次級鍵
β-巰基乙醇可破壞二硫鍵
2、蛋白質空間結構是蛋白質特有性質和功能的結構基礎。
肌紅蛋白：只有三級結構的單鏈蛋白質，易與氧氣結合，氧解離曲線呈直角雙曲線。
血紅蛋白：具有4個亞基組成的四級結構，可結合4分子氧。成人由兩條α-肽鏈（141個氨基酸殘基）和兩條β-肽鏈（146個氨基酸殘基）組成。在氧分壓較低時，與氧氣結合較難，氧解離曲線呈S狀曲線。因為：第一個亞基與氧氣結合以後，促進第二及第三個亞基與氧氣的結合，當前三個亞基與氧氣結合後，又大大促進第四個亞基與氧氣結合，稱正協同效應。結合氧後由緊張態變為鬆弛態。
六、蛋白質的理化性質
1、蛋白質的兩性電離：蛋白質兩端的氨基和羧基及側鏈中的某些基團，在一定的溶液PH條件下可解離成帶負電荷或正電荷的基團。
2、蛋白質的沉澱：在適當條件下，蛋白質從溶液中析出的現象。包括：
a.丙酮沉澱，破壞水化層。也可用乙醇。
b.鹽析，將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質溶液，破壞在水溶液中的穩定因素電荷而沉澱。
3、蛋白質變性：在某些物理和化學因素作用下，其特定的空間構象被破壞，從而導致其理化性質的改變和生物活性的喪失。主要為二硫鍵和非共價鍵的破壞，不涉及一級結構的改變。變性後，其溶解度降低，粘度增加，結晶能力消失，生物活性喪失，易被蛋白酶水解。常見的導致變性的因素有：加熱、乙醇等有機溶劑、強酸、強鹼、重金屬離子及生物鹼試劑、超聲波、紫外線、震盪等。
4、蛋白質的紫外吸收：由於蛋白質分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm處有特徵性吸收峰，可用蛋白質定量測定。
5、蛋白質的呈色反應
a.茚三酮反應：經水解後產生的氨基酸可發生此反應，詳見二、3
b. 雙縮脲反應：蛋白質和多肽分子中肽鍵在稀鹼溶液中與硫酸酮共熱，呈現紫色或紅色。氨基酸不出現此反應。蛋白質水解加強，氨基酸濃度升高，雙縮脲呈色深度下降，可檢測蛋白質水解程度。
七、蛋白質的分離和純化
1、沉澱，見六、2
2、電泳：蛋白質在高於或低於其等電點的溶液中是帶電的，在電場中能向電場的正極或負極移動。根據支撐物不同，有薄膜電泳、凝膠電泳等。
3、透析：利用透析袋把大分子蛋白質與小分子化合物分開的方法。
4、層析：
a.離子交換層析，利用蛋白質的兩性游離性質，在某一特定PH時，各蛋白質的電荷量及性質不同，故可以通過離子交換層析得以分離。如陰離子交換層析，含負電量小的蛋白質首先被洗脫下來。
b.分子篩，又稱凝膠過濾。小分子蛋白質進入孔內，滯留時間長，大分子蛋白質不能時入孔內而徑直流出。
5、超速離心：既可以用來分離純化蛋白質也可以用作測定蛋白質的分子量。不同蛋白質其密度與形態各不相同而分開。
第二章 核酸的結構與功能
一、核酸的分子組成：基本組成單位是核苷酸，而核苷酸則由鹼基、戊糖和磷酸三種成分連接而成。
兩類核酸：脫氧核糖核酸（DNA），存在於細胞核和線粒體內。
核糖核酸（RNA），存在於細胞質和細胞核內。
1、鹼基：
胞嘧啶 胸腺嘧啶 尿嘧啶 鳥嘌呤 腺嘌呤
嘌呤和嘧啶環中均含有共軛雙鍵，因此對波長260nm左右的紫外光有較強吸收，這一重要的理化性質被用於對核酸、核苷酸、核苷及鹼基進行定性定量分析。
2、戊糖：DNA分子的核苷酸的 糖是β-D-2-脫氧核糖，RNA中為β-D-核糖。
3、磷酸：生物體內多數核苷酸的磷酸基團位於核糖的第五位碳原子上。
二、核酸的一級結構
核苷酸在多肽鏈上的排列順序為核酸的一級結構，核苷酸之間通過3′，5′磷酸二酯鍵連接。
三、DNA的空間結構與功能
1、DNA的二級結構
DNA雙螺旋結構是核酸的二級結構。雙螺旋的骨架由 糖和磷酸基構成，兩股鏈之間的鹼基互補配對，是遺傳信息傳遞者，DNA半保留復制的基礎，結構要點：
a.DNA是一反向平行的互補雙鏈結構 親水的脫氧核糖基和磷酸基骨架位於雙鏈的外側，而鹼基位於內側，鹼基之間以氫鍵相結合，其中，腺嘌呤始終與胸腺嘧啶配對，形成兩個氫鍵，鳥嘌呤始終與胞嘧啶配對，形成三個氫鍵。
b.DNA是右手螺旋結構 螺旋直徑為2nm。每旋轉一周包含了10個鹼基，每個鹼基的旋轉角度為36度。螺距為3.4nm，每個鹼基平面之間的距離為0.34nm。
c.DNA雙螺旋結構穩定的維系 橫向靠互補鹼基的氫鍵維系，縱向則靠鹼基平面間的疏水性堆積力維持，尤以後者為重要。
2、DNA的三級結構
三級結構是在雙螺旋基礎上進一步扭曲形成超螺旋，使體積壓縮。在真核生物細胞核內，DNA三級結構與一組組蛋白共同組成核小體。在核小體的基礎上，DNA鏈經反復折疊形成染色體。
3、功能
DNA的基本功能就是作為生物遺傳信息復制的模板和基因轉錄的模板，它是生命遺傳繁殖的物質基礎，也是個體生命活動的基礎。
DNA中的核糖和磷酸構成的分子骨架是沒有差別的，不同區段的DNA分子只是鹼基的排列順序不同。
四、RNA的空間結構與功能
DNA是遺傳信息的載體，而遺傳作用是由蛋白質功能來體現的，在兩者之間RNA起著中介作用。其種類繁多，分子較小，一般以單鏈存在，可有局部二級結構，各類RNA在遺傳信息表達為氨基酸序列過程中發揮不同作用。如：
【核蛋白體(rRNA) 核蛋白體組成成分】
【信使(mRNA) 蛋白質合成模板 】
【轉運(tRNA) 轉運氨基酸 】
【不均一核RNA (HnRNA)成熟mRNA的前體】
【小核RNA (SnRNA)參與HnRNA的剪接、轉運】
【小核仁RNA (SnoRNA) rRNA的加工和修飾 】
1、信使RNA（半衰期最短）
1）hnRNA為mRNA的初級產物，經過剪接切除內含子，拼接外顯子，成為成熟的mRNA並移位到細胞質
2）大多數的真核mRNA在轉錄後5′末端加上一個7-甲基鳥嘌呤及三磷酸鳥苷帽子，帽子結構在mRNA作為模板翻譯成蛋白質的過程中具有促進核蛋白體與mRNA的結合，加速翻譯起始速度的作用，同時可以增強mRNA的穩定性。3′末端多了一個多聚腺苷酸尾巴，可能與mRNA從核內向胞質的轉位及mRNA的穩定性有關。
3）功能是把核內DNA的鹼基順序，按照鹼基互補的原則，抄錄並轉送至胞質，以決定蛋白質合成的氨基酸排列順序。mRNA分子上每3個核苷酸為一組，決定肽鏈上某一個氨基酸，為三聯體密碼。
2、轉運RNA（分子量最小）
1）tRNA分子中含有10％～20％稀有鹼基，包括雙氫尿嘧啶，假尿嘧啶和甲基化的嘌呤等。
2）二級結構為三葉草形，位於左右兩側的環狀結構分別稱為DHU環和Tψ環，位於下方的環叫作反密碼環。反密碼環中間的3個鹼基為反密碼子，與mRNA上相應的三聯體密碼子形成鹼基互補。所有tRNA3′末端均有相同的CCA-OH結構。
3）三級結構為倒L型。
4）功能是在細胞蛋白質合成過程中作為各種氨基酸的戴本並將其轉呈給mRNA。
3、核蛋白體RNA（含量最多）
1）原核生物的rRNA的小亞基為16S，大亞基為5S、23S；真核生物的rRNA的小亞基為18S，大亞基為5S、5.8S、28S。真核生物的18SrRNA的二級結構呈花狀。
2）rRNA與核糖體蛋白共同構成核糖體，它是蛋白質合成機器－－核蛋白體的組成成分，參與蛋白質的合成。
4、核酶：某些RNA 分子本身具有自我催化能，可以完成rRNA的剪接。這種具有催化作用的RNA稱為核酶。

五、核酸的理化性質
1、DNA的變性
在某些理化因素作用下，如加熱，DNA分子互補鹼基對之間的氫鍵斷裂，使DNA雙螺旋結構鬆散，變成單鏈，即為變性。監測是否發生變性的一個最常用的指標是DNA在紫外區260nm波長處的吸光值變化。解鏈過程中，吸光值增加，並與解鏈程度有一定的比例關系，稱為DNA的增色效應。紫外光吸收值達到最大值的50％時的溫度稱為DNA的解鏈溫度（Tm），一種DNA分子的Tm值大小與其所含鹼基中的G＋C比例相關，G＋C比例越高，Tm值越高。
2、DNA的復性和雜交
變性DNA在適當條件下，兩條互補鏈可重新恢復天然的雙螺旋構象，這一現象稱為復性，其過程為退火，產生減色效應。不同來源的核酸變性後，合並一起復性，只要這些核苷酸序列可以形成鹼基互補配對，就會形成雜化雙鏈，這一過程為雜交。雜交可發生於DNA－DNA之間，RNA－RNA之間以及RNA－DNA之間。

六、核酸酶（注意與核酶區別）
指所有可以水解核酸的酶，在細胞內催化核酸的降解。可分為DNA酶和RNA酶；外切酶和內切酶；其中一部分具有嚴格的序列依賴性，稱為限制性內切酶

Ⅳ 給出一種酶，如何設計其純化方案

發個實驗給你參考參考！！！

酵母蔗糖酶的分離純化和活力測定

實驗簡介：酶的分離制備在酶學以及生物大分子的結構功能研究種具有重要意義。啤酒酵母中蔗糖酶含量豐富。本實驗用新鮮啤酒酵母作為原料，通過破碎細胞，熱處理，乙醇沉澱，柱層析等步驟提取蔗糖酶。並對其活力進行測定。

實驗原理
蔗糖酶主要存在於酵母中，但工業上通常從酵母中製取。酵母蔗糖酶系胞內酶，提取時細胞破碎或菌體自溶。常用的提純方法有鹽析、有機溶劑沉澱、離子交換和凝膠柱層析。以此可得到較高純度的酶。
蔗糖酶催化下蔗糖水解為等量的葡萄糖和果糖。用測定生成還原糖(葡萄糖和果糖)的量來測定蔗糖水解的速度，本實驗中，蔗糖酶的活力單位指在一定條件下反應5min,每產生l毫克葡萄糖所需酶量。 用考馬斯亮藍法測定蛋白質含量，比活力為每毫克蛋白質的活力單位數。

實驗操作
1. 提取
(1) 准備一個冰浴，將研缽穩妥放入冰浴中。
(2) 將10g濕啤酒酵母，和適量（5g）二氧化硅一起放入研缽中。二氧化硅要預先研細。
(3) 緩慢加入預冷的30mL去離子水，每次加2mL左右，邊加邊研磨，至少用30分鍾。以便將蔗糖酶充分轉入水相，至酵母細胞大部分研碎，以便將蔗糖酶充分轉入水相中。
(4) （可選項） 研磨時用顯微鏡檢查研磨的效果。
(5) 將混合物轉入兩個離心管中，平衡後，用高速冷離心機，4℃，10000rpm，離心5min。
(6) 用滴管小心地取出水相，轉入另一個清潔的離心管中，4℃，10000rpm，離心15min。
(7) 將清液轉入量筒，量出體積，用廣泛pH試紙檢查上清液pH，用1mol / L 醋酸將pH調至5.0，稱為「粗級分Ⅰ」。留出1.5mL測定酶活力及蛋白含量，剩餘部分轉入清潔的離心管中。
2. 熱處理和乙醇沉澱
(1) 預先將恆溫水浴調到50℃，將盛有粗級分I的離心管穩妥地放入水浴中，45℃下保溫30分鍾，在保溫過程中不斷輕搖離心管。
(2) 取出離心管，於冰浴中迅速冷卻，用4℃，10000rpm，離心10min。
(3) 將上清液轉入小燒杯中，放入冰鹽浴（沒有水的碎冰撒入少量食鹽），逐滴加入等體積預冷至－20℃的95%乙醇，同時輕輕攪拌，共需30分鍾，再在冰鹽浴中放置10分鍾，以沉澱完全。於4℃，10000rpm，離心10min，傾去上清，並滴干，沉澱保存於離心管中，蓋上蓋子或薄膜封口，然後將其放入冰箱中冷凍保存（稱為「級分Ⅱ」）。廢棄上清液之前，要用尿糖試紙檢查其酶活性（於下一個實驗一起做）。
3. DEAE纖維素柱層析純化酶蛋白
(1) 離子交換劑的處理
稱取1.5克DEAE纖維素(DE-32)乾粉，加入0.5mol／L NaOH溶液(約50m1)，輕輕攪拌，浸泡至少0.5小時(不超過1小時)，用玻璃砂漏斗抽濾，並用去離子水洗至近中性，抽干後，放入小燒杯中，加50mL 0.5mol／L HCl，攪勻，浸泡0.5小時，用去離子水洗至。近中性，再用0.5 mol／L NaOH重復處理一次，用去離子水洗至近中性後，抽干備用(因DEAE纖維素昂貴，用後務必回收)。實際操作時，通常纖維素是已浸泡過並回收的，按「鹼一酸」的順序洗即可，因為酸洗後較容易用水洗至中性。鹼洗時因過濾困難，可以先浮選除去細顆粒，抽干後用0.5 mol／L NaOH-0.5 mol／L NaCl溶液處理，然後水洗至中性。
(2) 裝柱與平衡
先將層析柱垂直裝好，在燒杯內用0.02 mol／L，pH7.3 Tris-HCl緩沖液洗纖維素幾次，用滴管吸取燒杯底部大顆粒的纖維素裝柱，然後用此緩沖液洗柱至流出液的pH與緩沖液相同或接近時即可上樣。
(3) 上樣與洗脫
上樣前先准備好梯度混合器，詳見附錄TH-500梯度混合器使用說明。
用5mL 0.02mol／L，pH7.3的Tris-HCl緩沖液充分溶解醇級分Ⅱ(注意玻璃攪棒頭必須燒圓，攪拌溶解時不可將離心管劃傷)，若溶液混濁，則4 000r／min離心除去不溶物。取1.5mL上清液(即醇級分Ⅱ樣品，留待下一個實驗測酶活力及蛋白含量)，將剩餘的3.5mL上清液小心地加到層析柱上，不要擾動柱床，上樣後用約30mL緩沖液洗去柱中未吸附的蛋白質，至A280降到0.1以下，注意從上樣開始使用部分收集器收集，每管2.5～3.0mL／l0min。然後打開梯度混合器，採用30mL，0.02mol／L，pH7.3的Tris-HCl緩沖液和30mL含0.2mol／L濃度NaCl的0.02mol／L，pH7.3的Tris-HCl.緩沖液，進行線性梯度洗脫，連續收集洗脫液，控制流速2.5～3.0mL／10min。測定每管洗脫液的A280光吸收值。
(4) 各管洗脫液酶活力的定性測定
在點滴板上每一孔內，加一滴0.2mol／L，pH4.6的乙酸緩沖液，一滴0.5mol／L蔗糖和一滴洗脫液，反應5min，在每一孔內同時插入一小條尿糖試紙，10～20min後觀察試紙顏色的變化。用「+」號的數目，表示顏色的深淺，即各管酶活力的大小。合並活性最高的2～3管，量出總體積，並將其分成10份，分別倒人10個小試管，用保鮮膜封口，冰凍保存，使用時取出一管，此即「柱級分Ⅲ」。
4. 各級分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ蔗糖酶活力
用0.02mol／L，pH4.6乙酸緩沖液(也可以用pH5～6的去離子水代替)稀釋各級分酶液，測出酶活合適的稀釋倍數：
Ⅰ： 1 000～10 000倍；
Ⅱ： 1 000～10 000倍；
Ⅲ： 100～1 000倍；
以上稀釋倍數僅供參考。
按「表1」的順序在試管中加入各試劑，進行測定，為簡化操作可取消保鮮膜封口，沸水浴加熱改為用90～95℃水浴加熱 8-10min，以5min生成的還原糖的毫克數為縱坐標，以試管中lmL反應混合物中的酶濃度(mg蛋白／m1)為橫坐標，畫出反應速度與酶濃度的關系曲線。

表1 各級分I、Ⅱ、Ⅲ蔗糖酶活性測定
各管名稱 對照 級分Ⅰ 級分Ⅱ 級分Ⅲ 葡萄糖
管數 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
酶液/mL 0.0 0.05 0.20 0.50 0.05 0.20 0.50 0.05 0.20 0.50 / / /
H2O/mL 0.6 0.55 0.40 0.10 0.55 0.40 0.10 0.55 0.40 0.10 0.8 0.4 0.2
乙酸緩沖液0.2mol/L,pH4.6 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 / / /
葡萄糖2mmol/L / / / / / / / / / / 0.2 0.6 0.8
蔗糖0.25mol/L 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 / / /
加入蔗糖，立即搖勻開始記時，室溫准確反應5min後，立即加1mL 0.1M NaOH中止反應
二硝基水楊酸溶液 mL 1.0
用保鮮膜封口，扎眼，沸水浴加熱5min，立即用水冷卻3分鍾。
H2O/mL 4.0
A520
稀釋後酶活力 /
原始酶活力 /
5. 考馬斯亮蘭法測定各級分蛋白質含量
(1) 蛋白質標准曲線製作
取14支試管，分兩組按下表平行操作。
表2 蛋白質標准曲線製作
試管編號/mL 0 1 2 3 4 5 6
標准蛋白溶液/mL
0.02mol/L Tris-HCl緩沖液/mL
考馬斯亮蘭試劑/mL
搖勻，1h內以0號試管為空白對照，在595nm處比色
A595nm
(2) 各級分蛋白質含量測定
考馬斯亮蘭G-250在酸性溶液時呈茶棕色，最大吸收峰在465nm。當與蛋白質結合後變成深藍色，最大吸收峰轉至595nm，在10~100μg/mL蛋白質濃度范圍內成正比。因此在測定各級分蛋白質含量時應稀釋適當倍數，使其測定值在標准曲線的直線范圍內。根據所測定的A595nm值，在標准曲線上查出相當於標准蛋白的量，從而計算出未知樣品的蛋白質濃度(mg/mL)。
6. 計算各級分的比活力、純化倍數及回收率
為了測定和計算下面表3中的各項數據，對各個級分都必須取樣，每取一次樣，對於下一級分來說會損失一部分量，因而要對下一個級分的體積進行校正，以使回收率的計算不致受到不利的影響。
1活力單位(U)＝酶在室溫，pH＝4.6條件下，每分鍾水解產生1μmol葡萄糖所需酶量。比活力＝活力單位/mg蛋白。
表3 各級分的比活力、純化倍數及回收率

級
分 記錄
體積
(m1) 校正
體積
(m1) 蛋白質
(mg／m1) 總蛋白
(mg) Unit
(s／m1) 總活力
(U) 比活力
(Units
／mg) 純化
倍數 回收率
(％)
Ⅰ 1.0 100
Ⅱ
Ⅲ

下面表4是對假定的各級分記錄體積進行校正計算的方法和結果：
表4 實驗記錄表
級分 記錄體積 (m1) 校正體積計算 取樣體積
(m1) 校正後體積
(m1)
Ⅰ 15 15 1.5 15.00
Ⅱ 5 5×(15／13.5) 1.5 5.5
Ⅲ 6 6×(15／13.5)×(5／3.5) 1.5 9.5
五、 結果
在同一張圖上畫出所有管的酶活力、光吸收值A280的曲線和洗脫梯度線。得出各級分的活力，比活力，提純倍數以及回收率。
六、 注意事項
從上樣開始收集，可能有兩個活性峰，梯度洗脫開始前的第一個峰是未吸附物，本實驗取用梯度洗脫開始後洗下來的活性峰。
七、 作業
1．為什麼酶的提取需要低溫操作？
2．熱處理的根據是什麼？
去除熱敏感蛋白。
參考文獻
1．邵雪玲，毛歆，郭一清．生物化學與分子生物學實驗指導．武漢：武漢大學出版社，2003
2．張龍翔．高級生物化學實驗選編．北京：高等教育出版社，1989
3．許培雅，邱樂泉．離子交換柱層析純化蔗糖酶實驗方法改進研究．實驗室研究與探索，2002，21(3):82~84
編著者——陳彥，李紹飛

Ⅳ 蠍毒的採集分離

蠍子在受到激怒的情況下，出於防禦或攻擊的本能，會從毒囊中排出毒液。蠍毒的採集就是依據這個道理。採集蠍毒的常用方法有剪尾法、機械刺激法和電刺激法三種。剪尾法：夾住蠍的後腹部第五節的兩側，剪下蠍子的尾節，破碎後浸入生理鹽水（0.9%的氯化鈉溶液）中，浸出有毒部分，再將尾節研磨，用離心機離心（5000轉/分）5分鍾，重復3次。集中有毒的液體，放入容器內，再製成干毒粉，置於-5℃下保存備用。這種方法，每條蠍子只能采毒一次，而采毒後的蠍子降低了葯用功能和經濟價值，對蠍子的傷害也大，通常不採用。人工刺激法：用鑷子夾住蠍子的一個螯肢，提起懸於容器中片刻，多數蠍子的尾刺即會排出毒液，但也有少數蠍子不排毒液的，不排毒液的可用比如細木筷子等硬物輕碰蠍子的頭胸部或前腹部，刺激蠍子的尾刺排毒。電激法：該法是用電子脈沖提毒儀器採集蠍毒的方法。此法采毒量大，工效高，一人操作，全年多次采毒而不致於損害蠍子，是使用較多也較科學的采毒方法。三種采毒方法相比，剪尾提毒法簡便、快速、收毒率高，適於大批量採集蠍毒；缺點是活蠍只能供一次采毒，人工刺激法獲取的毒液清澈透明，但采毒量較少，工效低，速度慢，對大規模提取蠍毒不適用。
毒素類型及氨基酸序列圖冊。
電激法獲取的毒量較人工刺激法取得的毒量要多1倍。大約3000隻成蠍可產濕毒6-7g，可凍成干毒1g，即每毫克濕毒可加工成0.14-0.16mg干毒。每隻東亞鉗蠍1次可產0.34mg左右的干毒。雄蠍的個體比雌蠍小，其產毒量也比雌蠍少。在電脈沖刺激下，1隻雌蠍3次可產濕毒2.59mg，1隻雄蠍3次產2.01mg濕毒（按隔7天後采1次毒計算）。但需嚴格注意衛生，確保采毒的純度；個別蠍子在通一次電時不排毒，須再通一次電，但通電時間不得超過2秒鍾，頻率128赫茲，電壓6-10伏。以免燒壞儀器和損傷蠍子。蠍子的排毒量隨溫度的變化高低而各有差異。溫度低時排毒量相對較少，當溫度低於20℃時，蠍子的排毒量相當少，當低於10℃時，蠍子則停止排毒。因此，常溫養殖蠍子要采毒應盡量在6月份氣溫高於25℃以上時進行。孕蠍和種蠍不能用於采毒。懷孕早期的孕蠍可以采毒，但在臨產前不能采毒。用於采毒的蠍子多為商品成蠍和老齡蠍。 蠍毒液成分主要為蛋白質和酶類，容易失去活性。常溫下極易變質，必須加工成干毒粉才能保存較長時間。
蠍毒液除了馬上用於分離純化者外，應盡快進行乾燥。蠍毒乾燥的目的，就是盡量除去毒液中的水分，提高粗毒的穩定性，使之便於保存、分析、出售。常用的乾燥方法有兩種：一，若要保持蠍毒中酶的活力，應選用真空冷凍乾燥；二，若僅為了保持毒性，採用真空乾燥即可。
（1）真空乾燥（即真空減壓乾燥）是在低壓下，使蠍毒液中的水分快速蒸發的方法。真空乾燥裝置包括真空干器、冷凝管和真空泵。乾燥器頂部活塞接通冷凝管，冷凝管的另一端依次連接吸濾瓶、乾燥塔和真空泵。蒸汽在冷凝管中凝集後滴入吸收瓶中。乾燥器中放有乾燥劑（如五氧化二磷等）和蠍毒液樣品。使用前，先在乾燥器活塞四周塗上少許凡士林，然後檢查整個裝置是否漏氣。使用時，先將蠍毒液和乾燥劑分別裝入平皿中，然後置於乾燥器中，啟動真空泵抽氣至蓋子推不動，依次關閉活塞和真空泵。蠍毒乾燥後，應緩緩旋開活塞，以防止空氣沖散蠍毒乾粉。最後在凈化條件下取出乾粉，立即分裝，密封保存。
（2）真空冷凍乾燥先將蠍毒液在低溫冰櫃中預凍成固體（用不銹鋼皿盛裝毒液），然後在低溫和高真空度上使之升華，即可得到純白色蠍毒乾粉。由於冷凍乾燥是在低溫和高真空度下進行的，所以毒液在凍干過程中不起泡、不沾壁、疏鬆、易取出、易溶於水，有利於保存。 蠍毒的分離純化過程一般是先經過按照分子量大小分離的色譜柱，再經過離子交換柱，最後採用反向HPLC技術，獲得單一的組分。程序為：先用CM-Sephadex C-50離子交換層析分離，再用Sephadex G-50過濾，也可採用CM-Sephadex C-50、Sp-Sephadex C-25離子交換柱層析和Sephadex G-50凝膠過濾三步分離程序。如採用CM-Sephadex C-50進行離子交換層析，將毒性較強的組分透析後再用重層析，再用Sephadex G-50凝膠過濾，純化可得毒素。或採用RP-HPLC對東亞鉗蠍的粗毒進行分離，並且用兩種不同的HPLC系統反復分離，用0.1%三氯醋酸-水和0.1%三氯醋酸-70%乙醇-水進行梯度洗脫。或進行二級提取，即用CM-Sephadex C-50離子交換層析提取，再用凝膠過濾，經CM-Sephadex C-10除鹽。
如採用Sepharose FF陽性離子交換凝膠柱，可望獲得較高純度的單一有效成分。而利用HPCE及HPLC可較好顯示蠍毒中小分子多肽的組成及相對含量，其結果基本一致。當下對蠍毒分離純化的研究就主要集中在通過選擇不同柱長、流速和梯度的凝膠層析和高效液相色譜來獲得具有高抗癌活性的單一成分的抗癌多肽，比如用三步色譜法在蠍毒中分離得到了抗癲癇肽並測定了其N端50個氨基酸序列，用離子交換色譜和凝膠排阻色譜從粗毒中分離出鎮痛肽，用一步CM Sephadex C-50超長柱從粗毒中純化了鎮痛肽，用低壓陽離子交換柱和低壓排阻柱及離子交換柱從東亞鉗蠍中分離和提取了抗腫瘤肽。比如東亞鉗蠍鎮痛抗腫瘤纈精甘肽（analgesic antitumoral peptide，AGAP），從東亞鉗蠍蠍毒中分離純化得到的單組分活性肽，為單一肽鏈的單純鹼性多肽,等電點大於10。含有鹼性氨基酸，還富含疏水性氨基酸。活性肽的N末端部分氨基酸序列為：VRDGY IADDKNCAYF CGRNA YCDDE。
為獲得高純度的蛋白質，往往需要反復使用凝膠過濾層析和離子交換層析，但這種分離方法的不足之處在於樣品損失率太高，且勞動量較大。利用基因工程技術制備蠍毒特異蛋白質的研究正在研製之中，但成本較高，數量有限。因此，蠍毒粗毒的分離仍是獲得蠍毒特異性的蛋白質的主要來源。 蠍毒液在普通冰箱（1-4℃）中，只能作短期保存。只有凍干成結晶粉狀，才能保存其生理活性。影響蠍毒乾粉穩定性的主要因素是水分、空氣和溫度。當乾粉含水量低於10%時，能抑制微生物活性；含水量低於3%時，可抑制化學活性。所以，應將蠍毒乾粉分裝在小瓶或小管中，並用熔封或石蠟封口，以隔絕空氣，然後置於低溫冰箱（一30℃）中保存。
從養殖場運送新鮮蠍毒液到收購、加工部門或檢驗部門，必須用廣口瓶保溫冰瓶（瓶中加碎冰塊降溫）攜帶。若運送蠍毒乾粉至遠處，也應採取降溫措施，以防蠍毒蛋白質變性失活。 多數動物類中葯的有效成分尚不明確或不完全明確，其提取純化工藝研究較少，在中成葯生產工藝中動物類中葯基本是生葯粉末直接配料，少數用水、醇提取，水醇法精製。由於動物類中葯的有效成分多數是蛋白質類、多糖類等大分子物質或其水解產物，常規方法很難充分地提出、分離和純化這些大分子物質。
傳統上蠍毒以全蠍原粉入葯效果更好，也是當下臨床常採用的方法。但原粉劑量大、衛生學難合格，同時全蠍多是以產地加工後的產品入葯。而全蠍的產地加工一般以清水煮或鹽水煮居多，但這兩種方法又存在很多不合理的地方，比如有效成分的損失、變性，質量難以控制，鹽水煮又因為加鹽量不同，使得臨床劑量不準確等而使得進一步使用受到限制。 蠍毒素最主要的分類按其分子結構中是否含有二硫鍵，其中含有二硫鍵的一類，依其葯理學特徵，可分為Na+通道、K+通道、Cl-通道和Ca2+通道（主要存在於骨骼肌細胞漿膜上）毒素。這些離子通道是細胞膜表面的一類分子量較大的跨膜糖蛋白，在膜上形成特殊的親水孔道，是細胞內外離子交換的途徑，是神經、肌肉、腺體等許多組織細胞膜上的基本興奮單元，能產生和傳導電信號，具有重要的生理功能。
鈉離子通道
根據作用方式和結合位點的不同，Na+通道毒素又可分為α型毒素和β型毒素。α-毒素以電壓依賴方式作用於Na+通道上的位點3，延緩Na+通道的失活過程，使Na+通道電流衰減減慢，動作電位時間延長，α-毒素可根據其作用對像的不同分為4類：①典型的對哺乳動物高特異性的α-毒素，②作用於昆蟲的昆蟲型α-毒素，③中間型α-毒素，同時作用於哺乳動物和昆蟲的α類似毒素，對哺乳動物和昆蟲都有作用，但對哺乳動物毒性更強。
β毒素則結合在Na+通道的位點4上，影響Na+通道的激活過程，使電壓依賴的Na+通道激活曲線移向較負的電位。根據β型蠍毒素對昆蟲和哺乳動物鈉通道的特異性及其作用於昆蟲時表現的症狀不同又可分為：抗哺乳動物β-毒素，抗昆蟲興奮性β-毒素，抗昆蟲抑制性β-毒素和TsVII或γ型蠍毒素。抗哺乳動物β蠍毒素，表現為對哺乳動物的高毒性，並在膜片鉗下表現出可調節哺乳動物腦中鈉通道電流的作用；抗昆蟲興奮性毒素即使以毫克級別注射到哺乳動物體內（如小鼠腦內）也無毒性表現的；抗昆蟲抑制性毒素，經注射性給葯可誘發昆蟲的遲緩性癱瘓，利用膜片鉗技術，抗昆蟲抑制性毒素使軸突胞膜動作電位向強去極化方向移動；第四類β-毒素是對於昆蟲和哺乳動物的鈉通道都有高活性作用，例如Lqhβ1毒素在注射給葯於青蠅幼蟲時有典型的抑製作用。
鉀離子通道
第一類是以Charybdotoxin（CTX）為代表，分子中有三對二硫鍵，配對方式為C1-C4，C2-C5，C3-C6，但CTX對鉀離子通道亞型的選擇性不高，這反而使得它的用途相當廣泛。，從1990年起，ChTx被開發為實驗室商品。它可阻斷含高電導Ca2+激活的K+通道（BKCa）、電壓依賴性K+通道（如淋巴細胞和果蠅Shaker K+通道）、A型K+通道（卵母細胞）、小電導Ca2+激活的K+通道（Aplysia神經細胞），並且可作用於神經細胞、血液細胞和破骨細胞中的電壓依賴型Kv1.3（Shaker鉀離子通道的一種）鉀離子通道。其特徵是它們的N端為焦谷氨酸殘基，有70%的氨基酸序列相似性，且在分子的第2與第14位上均分別坐落著保守的Phe和Trp殘基。類似的毒素還包括CTX-Lq2、1beriotoxin（1bTX）、BmTX和PBTX等。
第二類是Noxiustoxin（NTX）為代表，最早由墨西哥Centruroides noxius蠍的毒素中分離出，包括從5種蠍毒中分離出來的8種多肽，也是最早報道的蠍鉀離子通道阻斷劑。主要作用於電壓依賴性K+通道，延長動作電位持續時間，並且對Ca2+激活的K+通道（KCa）也有微弱的抑製作用。此類毒素有80%的氨基酸序列相似性，而與第一類蠍毒素僅有40%的相似性。NTx能夠以劑量依賴的方式可逆地阻斷魷魚軸突標本的延遲整流鉀離子通道、大鼠骨骼肌標本中的BKCa和人T淋巴細胞中的電壓依賴型鉀離子通道。類似的毒素還有MgTX、CoTX1、CITX、TsKa和HTX等。
第三類是以Kaliotoxin（KTX）為代表，最早從北非蠍Androctonus martetanicus mauretanicus的粗毒中分離得到，包括從7種蠍毒中純化到的9種多肽，由37-38個氨基酸殘基組成。此類毒素有80%-90%的氨基酸序列相似性，而與第一、二類相比有40%-50%的相似性。可以阻斷電壓依賴性鉀通道，包括高電導Ca2+激活的K+通道（BKCa）。類似的毒素還有Ag-itoxin 2（AgTX 2）、AeTX 3、KTX 2和KTX 3等。
第四類是以LTX1、P05、BmP05為代表的毒素，它們均由31個氨基酸殘基組成，有84%的氨基酸序列相似性。它們對小鼠的毒性很強，腦室注射的半致死量低於2μg/kg鼠，可以與apamin競爭結合鼠腦突觸膜上的apamin受體，能特異性地阻斷不同細胞類型中的低電導、Ca2+激活、apamin敏感的鉀離子通道（low-concta-nce，Ca2+-activated，apamin-sensitive K+channel，SKCa）。
第五類為TSK毒素，由巴西產蠍Tityus serru-latus毒素中分離的一種35肽，在C端含有獨特的-Cys-Asp-Cys-三肽結構。特異性作用於apamin敏感的小電導Ca2+激活的K+通道（SKCa）。且RodriguesAR等學者發現TsTX-Ka可高親和力、可逆性地阻斷爪蟾卵母細胞上Kvl.3通道（Shaker K+通道的一種亞型）。
第六類是以MTX（Mauxotoxin）為代表，由北非蠍Scorpio maurus毒素中分離出，包括3種蠍毒中分離到的5個多肽，大小介於34～37個氨基酸殘基之間，MTX分子中含有與其他毒素位置不同的4對二硫鍵，為：C1-C4，C2-C5，C3-C6和C7-C8。其他幾種的配對方式為：C1-C5，C2-C6，C3-C7，C4-C8。可阻斷電壓依賴性K+通道，如果蠅的ShakerK+通道、Apamin或KTX敏感的K+通道。類似的毒素還有Pi1、HTX1、Pi4等。
第七類為以P01為代表，由28-29個殘基組成，包括從3種蠍毒中分離到的4種多肽，是迄今發現最小分子的蠍毒素組，有76%的氨基酸序列相似性。主要作用於apamin敏感的小電導Ca2+激活K+通道（SKCa），但相對結合能力較弱。對小鼠都毒性很弱（腦室注射至mg水平仍無反應）。因此，盡管將這4個多肽由於結構類似而被歸入鉀離子通道毒素類，但是它們的主要的功能還有待發掘。類似的毒素還有BmP01和LPII等。
第八類是以BmP02為代表，包括從兩種蠍毒中分離到的3個多肽：BmP02、BmP03和LP1，由中國產蠍Buthus martensi Karsch粗毒中分離的28肽，含有3對二硫鍵，氮基酸序列僅有1個殘基差異。微弱作用於apamin敏感的小電導Ca2+激活的K+通道（SKCa），對小鼠沒有致死毒性。進一步研究表明BmP02能夠減弱兔心肌細胞的瞬時外向鉀離子流，因此認為BmP02可以作為研究瞬時外向鉀離子通道的工具。
第九類是以BTK-2為代表，由印度紅蠍Buthus tamulus的粗毒分離所得的一種K+通道阻斷劑，有32個氨基酸通過6個保守的cys交聯組成，分子量為3452Da。BTK-2與其他K+通道阻斷劑有40%-70%的序列相似性。
當然，這種分組並不是絕對的，各類毒素之間不論在結構上，特別是在生物活性方面都有交叉重疊現象，比如CTX除作用於BKCa外，還作用於淋巴細胞中的Kv，果蠅shaker的Kv，爪蟾卵母細胞表達的A型通道（KA）以及來源於Aplysia的SKCa等；NTX除了抑制Kv外，對鈣激活鉀通道（KCa）也有弱抑製作用；MTX除了抑制shaker鉀通道以外，還抑制apamin和KTX與大鼠腦突觸體膜的結合。
鈣離子通道
這類毒素只分離到了兩個：IpTxA和Maurocalcine，從蠍Pandinus imperator和Scorpio maurus palmatus的粗毒中分離得到，均由33個氨基酸殘基組成，分子中有3對二硫鍵，同源性達82%，對小鼠的LD50為20μg/鼠，能夠可逆地作用於肌肉型Ryanodine受體（RyRtype 1），使細胞處於持久的亞通透狀態。
鈣通道毒素富含鹼性殘基，可以與細胞膜上荷負電的脂肪酸分子相結合，破壞脂雙層後進入膜內與胞內Ryanodine受體相作用。與RyRs結合的分子機制同雙羥基嘧啶受體II-III環相同，通過與Rryanodine受體之間的作用，激活內質網中Ca2+的釋放。
氯離子通道
氯通道毒素（chlorotoxin）是從Leiurus quinquestri蠍毒液中經過凝膠過濾，及HPLC分離純化得到的一種多肽，它對神經膠質瘤特有的氯通道（gliomaspecific chloridechannel，GCC，在正常腦組織中則不含有）有特異親和力。分子量為4070，有4個二硫鍵，由36個氨基酸殘基組成。類似的毒素還包括BeI1、BeI5、AmmP2等。氯毒素可抑制原發性腦膠質瘤的侵襲、轉移。 按作用對象可分為哺乳動物毒素（MTx，在粗蠍毒中含量高達10%-50%），脊椎動物毒素，昆蟲毒素，即抗昆蟲蠍毒素（ITx，在粗蠍毒中含量低於1%），甲殼動物神經毒素（CTx）。其劃分的依據是根據把一定劑量的蠍毒多肽注射進不同的實驗動物小鼠、麻蠅或家蠅、等足類甲殼動物，或將葯在不同的離體動物或離體標本所表現的中毒反應，相應地進行分類。其中哺乳動物毒素根據葯理和電生理效應又可分為 α 和 β 兩型，α 型毒素通過抑制細胞膜上鈉離子通道失活而使鈉電流衰減，動作電位時程顯著延長，而 β 型毒素主要影響鈉通道的激活，使電壓依賴性的鈉激活曲線移向較負的膜電位，即去極化引起的興奮效應。不過現有研究表明，對MTx和CTx的定義並不嚴格分明，MTx和CTx對3種動物均有不同程度的毒性，只不過對哺乳動物和甲殼動物的麻痹作用更敏感而已，而ITx的定義相對較為合理些。
1971年，Zlotkin等率先從非洲蠍Androctons australis純化出抗昆蟲蠍毒素Aa IT，並建立了抗昆蟲蠍毒素的鑒定方法，該方法採用麻蠅Sarcophaga foalconta幼蟲為鑒定材料，後來陸續也有採用家蠅、蟑螂、蝗蟲等昆蟲。依據作用效應可將其分為具有快速收縮型麻痹效應的CP型（excitory-constractive paralysis）和引起昆蟲肌肉緩慢鬆弛直到完全麻痹的FP型（flaccid-depressant paralysis）。
如以受體位點及電生理作用為分類依據，ITx可進而分為4類：興奮（exceitory）型、抑制（depressant）型、α›型和β型。當然，在抗昆蟲蠍毒素中，對哺乳動物（或甲殼動物）和昆蟲都有毒性的毒素也有存在，不過其中有些毒素對昆蟲的毒性遠大於對哺乳動物的毒性。

Ⅵ 蛋白質洗脫曲線的分析

從曲線中可以看出，幾個蛋白質的峰值出現在11管、30管、37管、41管、76管，其版中76管的峰值最權大，而這幾個峰值對應的NaCl的濃度在0.6-0.8之間，76管對應的是0.8.所謂出峰，就是蛋白含量相對較高。這個曲線告訴你，在NaCl的濃度在0.6-0.8時，蛋白質的含量較高，你可在對應的試管數收取你的目的蛋白，然後在通道蛋白電泳等手段檢測你的目的蛋白。
我以前做過蛋白的純化，但是對於洗脫曲線的分析不是很在行，但我想原理是差不多的，希望可以幫助到你。

Ⅶ 電泳法分離混合蛋白質的基本原理是什麼

是根據蛋白質的電荷不同即酸鹼性質不同分離蛋白質混合物的方法。
1、電泳：在外電場的作用下，帶點顆粒將向著與其電性相反的電極移動，這種現象稱為電泳。電泳技術可用於氨基酸、肽、蛋白質和核苷酸等生物分子的分析分離和制備。 區帶電泳是由於在支持物上電泳蛋白質混合物被分離為若干區帶。
電泳前用緩沖液浸潤薄膜或濾紙等支持物或用緩沖液直接配置成凝膠，將待分離的蛋白質樣品加在它的一端或中央，支持物的兩端與電極連接，通電電泳。電泳完畢，各個組分分布在不同的區域，用顯色劑（蛋白質可用考馬斯亮藍或氨基黑等染色）顯色後可以顯示出各個組分。
氨基酸混合物特別是寡聚核苷酸混合物一次電泳往往不能完全分開。這種情況可以將第一次電泳分開的斑點通過支持介質間的接觸印跡轉移到第二個支持介質上，旋轉90°，進行第二次電泳。這種方法稱為雙向電泳。
2、聚丙烯醯胺凝膠電泳：以聚丙烯醯胺凝膠為支持物，一般製成凝膠柱或凝膠板，凝膠是由相連的兩部分組成（小的部分是濃縮膠，大的部分為分離膠），這兩部分凝膠的濃度、緩沖液組分和離子強度、pH以及電場強度都是不同的，即不連續性。電泳時樣品首先在不連續的兩相間積聚濃縮而成很薄的起始區帶，然後再進行電泳分離。 電泳有三種物理效應：1、樣品的濃度效應；2、凝膠對被分離分子的篩選效應；3、一般電泳分離的電荷效應。
3、毛細管電泳：高效毛細管電泳、毛細管區帶電泳、自由溶液毛細管電泳、毛細管電泳，可分離氨基酸、肽、蛋白質、DNA片段和核酸以及多種小分子，也可用於手性化合物的分離。
毛細管減少了由於熱效應產生的許多問題，可以提高熱散失，有助於消除由於熱引起的擴散增加而造成的對流和區帶變寬，因此管中不需要加入穩定介質即可進行自由流動電泳。
電泳遷移引起溶液中荷電分子向相反電荷的電極移動，雖然被分析樣品因電泳遷移而分離，然而電滲作用使溶液向負極流動，而且電滲電流很強，其速度一般比樣品的電泳速率答，因此所有的正、負離子和中性分子都被推向負極。對荷正電分子來說，電泳遷移和電滲流效果是一致的，而且移動最快，最先達到負極。隨著被分離的分子接近負極，它們都將通過紫外檢測器並把信號傳遞給記錄儀。所得結果是被分離組分的紫外吸收對時間的峰譜。
4、等點聚焦（IEF）分離蛋白質混合物是在具有pH梯度的介質（如濃蔗糖溶液）中進行。在外電場作用下各種蛋白質將移向並聚焦在等於其等電點的梯度處，並形成一個很窄的區帶。
pH梯度製作一般利用兩性電解質，它是脂肪族多胺和多羧類的同系物，它們具有相近但不相同的解離常數和等電點。在外電場作用下，自然形成pH梯度。
5、層析聚焦：根據蛋白質的等電點差異分離蛋白質混合物的柱層析方法。
原理：當用特種緩沖液滴洗填充在柱中的特種多緩沖交換劑時，就會在層析柱中自上而下自動的建立起連續的pH梯度；同時加在柱上端的蛋白質樣品也隨多緩沖液的展開按各自的等電點聚焦在相應的pH區段。並在展開過程中隨pH梯度下移，蛋白質混合物的各組分先後從柱中流出，達到分離純化的目的。

Ⅷ 分離蛋白質，目標蛋白分子量64KDa,兩種雜蛋白的分子量分別為69KDa和74KDa

用離子交換層析吧 效果應該好
如果想簡單一點 就用聚丙烯醯胺凝膠層析吧 填上30厘米高
找的型號要和分子量匹配 50－100KD間的
用紫外檢測洗脫曲線 最後面出來的就是最小的蛋白

Ⅸ 為什麼用巰基乙醇打開蛋白中的二硫鍵而不是過甲酸

過甲酸是要使蛋白質變性的吧，俺認為，但是巰基乙醇只是反應二硫鍵而已

Ⅹ 酶的提取:固液比1:5,20℃提取30分鍾,共提取三次如何操作

發個實驗給你參考參考！！！

酵母蔗糖酶的分離純化和活力測定

實驗簡介：酶的分離制備在酶學以及生物大分子的結構功能研究種具有重要意義。啤酒酵母中蔗糖酶含量豐富。本實驗用新鮮啤酒酵母作為原料，通過破碎細胞，熱處理，乙醇沉澱，柱層析等步驟提取蔗糖酶。並對其活力進行測定。

實驗原理
蔗糖酶主要存在於酵母中，但工業上通常從酵母中製取。酵母蔗糖酶系胞內酶，提取時細胞破碎或菌體自溶。常用的提純方法有鹽析、有機溶劑沉澱、離子交換和凝膠柱層析。以此可得到較高純度的酶。
蔗糖酶催化下蔗糖水解為等量的葡萄糖和果糖。用測定生成還原糖(葡萄糖和果糖)的量來測定蔗糖水解的速度，本實驗中，蔗糖酶的活力單位指在一定條件下反應5min,每產生l毫克葡萄糖所需酶量。 用考馬斯亮藍法測定蛋白質含量，比活力為每毫克蛋白質的活力單位數。

實驗操作
1. 提取
(1) 准備一個冰浴，將研缽穩妥放入冰浴中。
(2) 將10g濕啤酒酵母，和適量（5g）二氧化硅一起放入研缽中。二氧化硅要預先研細。
(3) 緩慢加入預冷的30mL去離子水，每次加2mL左右，邊加邊研磨，至少用30分鍾。以便將蔗糖酶充分轉入水相，至酵母細胞大部分研碎，以便將蔗糖酶充分轉入水相中。
(4) （可選項） 研磨時用顯微鏡檢查研磨的效果。
(5) 將混合物轉入兩個離心管中，平衡後，用高速冷離心機，4℃，10000rpm，離心5min。
(6) 用滴管小心地取出水相，轉入另一個清潔的離心管中，4℃，10000rpm，離心15min。
(7) 將清液轉入量筒，量出體積，用廣泛pH試紙檢查上清液pH，用1mol / L 醋酸將pH調至5.0，稱為「粗級分Ⅰ」。留出1.5mL測定酶活力及蛋白含量，剩餘部分轉入清潔的離心管中。
2. 熱處理和乙醇沉澱
(1) 預先將恆溫水浴調到50℃，將盛有粗級分I的離心管穩妥地放入水浴中，45℃下保溫30分鍾，在保溫過程中不斷輕搖離心管。
(2) 取出離心管，於冰浴中迅速冷卻，用4℃，10000rpm，離心10min。
(3) 將上清液轉入小燒杯中，放入冰鹽浴（沒有水的碎冰撒入少量食鹽），逐滴加入等體積預冷至－20℃的95%乙醇，同時輕輕攪拌，共需30分鍾，再在冰鹽浴中放置10分鍾，以沉澱完全。於4℃，10000rpm，離心10min，傾去上清，並滴干，沉澱保存於離心管中，蓋上蓋子或薄膜封口，然後將其放入冰箱中冷凍保存（稱為「級分Ⅱ」）。廢棄上清液之前，要用尿糖試紙檢查其酶活性（於下一個實驗一起做）。
3. DEAE纖維素柱層析純化酶蛋白
(1) 離子交換劑的處理
稱取1.5克DEAE纖維素(DE-32)乾粉，加入0.5mol／L NaOH溶液(約50m1)，輕輕攪拌，浸泡至少0.5小時(不超過1小時)，用玻璃砂漏斗抽濾，並用去離子水洗至近中性，抽干後，放入小燒杯中，加50mL 0.5mol／L HCl，攪勻，浸泡0.5小時，用去離子水洗至。近中性，再用0.5 mol／L NaOH重復處理一次，用去離子水洗至近中性後，抽干備用(因DEAE纖維素昂貴，用後務必回收)。實際操作時，通常纖維素是已浸泡過並回收的，按「鹼一酸」的順序洗即可，因為酸洗後較容易用水洗至中性。鹼洗時因過濾困難，可以先浮選除去細顆粒，抽干後用0.5 mol／L NaOH-0.5 mol／L NaCl溶液處理，然後水洗至中性。
(2) 裝柱與平衡
先將層析柱垂直裝好，在燒杯內用0.02 mol／L，pH7.3 Tris-HCl緩沖液洗纖維素幾次，用滴管吸取燒杯底部大顆粒的纖維素裝柱，然後用此緩沖液洗柱至流出液的pH與緩沖液相同或接近時即可上樣。
(3) 上樣與洗脫
上樣前先准備好梯度混合器，詳見附錄TH-500梯度混合器使用說明。
用5mL 0.02mol／L，pH7.3的Tris-HCl緩沖液充分溶解醇級分Ⅱ(注意玻璃攪棒頭必須燒圓，攪拌溶解時不可將離心管劃傷)，若溶液混濁，則4 000r／min離心除去不溶物。取1.5mL上清液(即醇級分Ⅱ樣品，留待下一個實驗測酶活力及蛋白含量)，將剩餘的3.5mL上清液小心地加到層析柱上，不要擾動柱床，上樣後用約30mL緩沖液洗去柱中未吸附的蛋白質，至A280降到0.1以下，注意從上樣開始使用部分收集器收集，每管2.5～3.0mL／l0min。然後打開梯度混合器，採用30mL，0.02mol／L，pH7.3的Tris-HCl緩沖液和30mL含0.2mol／L濃度NaCl的0.02mol／L，pH7.3的Tris-HCl.緩沖液，進行線性梯度洗脫，連續收集洗脫液，控制流速2.5～3.0mL／10min。測定每管洗脫液的A280光吸收值。
(4) 各管洗脫液酶活力的定性測定
在點滴板上每一孔內，加一滴0.2mol／L，pH4.6的乙酸緩沖液，一滴0.5mol／L蔗糖和一滴洗脫液，反應5min，在每一孔內同時插入一小條尿糖試紙，10～20min後觀察試紙顏色的變化。用「 」號的數目，表示顏色的深淺，即各管酶活力的大小。合並活性最高的2～3管，量出總體積，並將其分成10份，分別倒人10個小試管，用保鮮膜封口，冰凍保存，使用時取出一管，此即「柱級分Ⅲ」。
4. 各級分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ蔗糖酶活力
用0.02mol／L，pH4.6乙酸緩沖液(也可以用pH5～6的去離子水代替)稀釋各級分酶液，測出酶活合適的稀釋倍數：
Ⅰ： 1 000～10 000倍；
Ⅱ： 1 000～10 000倍；
Ⅲ： 100～1 000倍；
以上稀釋倍數僅供參考。
按「表1」的順序在試管中加入各試劑，進行測定，為簡化操作可取消保鮮膜封口，沸水浴加熱改為用90～95℃水浴加熱 8-10min，以5min生成的還原糖的毫克數為縱坐標，以試管中lmL反應混合物中的酶濃度(mg蛋白／m1)為橫坐標，畫出反應速度與酶濃度的關系曲線。

表1 各級分I、Ⅱ、Ⅲ蔗糖酶活性測定
各管名稱 對照 級分Ⅰ 級分Ⅱ 級分Ⅲ 葡萄糖
管數 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
酶液/mL 0.0 0.05 0.20 0.50 0.05 0.20 0.50 0.05 0.20 0.50 / / /
H2O/mL 0.6 0.55 0.40 0.10 0.55 0.40 0.10 0.55 0.40 0.10 0.8 0.4 0.2
乙酸緩沖液0.2mol/L,pH4.6 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 / / /
葡萄糖2mmol/L / / / / / / / / / / 0.2 0.6 0.8
蔗糖0.25mol/L 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 / / /
加入蔗糖，立即搖勻開始記時，室溫准確反應5min後，立即加1mL 0.1M NaOH中止反應
二硝基水楊酸溶液 mL 1.0
用保鮮膜封口，扎眼，沸水浴加熱5min，立即用水冷卻3分鍾。
H2O/mL 4.0
A520
稀釋後酶活力 /
原始酶活力 /
5. 考馬斯亮蘭法測定各級分蛋白質含量
(1) 蛋白質標准曲線製作
取14支試管，分兩組按下表平行操作。
表2 蛋白質標准曲線製作
試管編號/mL 0 1 2 3 4 5 6
標准蛋白溶液/mL
0.02mol/L Tris-HCl緩沖液/mL
考馬斯亮蘭試劑/mL
搖勻，1h內以0號試管為空白對照，在595nm處比色
A595nm
(2) 各級分蛋白質含量測定
考馬斯亮蘭G-250在酸性溶液時呈茶棕色，最大吸收峰在465nm。當與蛋白質結合後變成深藍色，最大吸收峰轉至595nm，在10~100μg/mL蛋白質濃度范圍內成正比。因此在測定各級分蛋白質含量時應稀釋適當倍數，使其測定值在標准曲線的直線范圍內。根據所測定的A595nm值，在標准曲線上查出相當於標准蛋白的量，從而計算出未知樣品的蛋白質濃度(mg/mL)。
6. 計算各級分的比活力、純化倍數及回收率
為了測定和計算下面表3中的各項數據，對各個級分都必須取樣，每取一次樣，對於下一級分來說會損失一部分量，因而要對下一個級分的體積進行校正，以使回收率的計算不致受到不利的影響。
1活力單位(U)＝酶在室溫，pH＝4.6條件下，每分鍾水解產生1μmol葡萄糖所需酶量。比活力＝活力單位/mg蛋白。
表3 各級分的比活力、純化倍數及回收率

級
分 記錄
體積
(m1) 校正
體積
(m1) 蛋白質
(mg／m1) 總蛋白
(mg) Unit
(s／m1) 總活力
(U) 比活力
(Units
／mg) 純化
倍數 回收率
(％)
Ⅰ 1.0 100
Ⅱ
Ⅲ

下面表4是對假定的各級分記錄體積進行校正計算的方法和結果：
表4 實驗記錄表
級分 記錄體積 (m1) 校正體積計算 取樣體積
(m1) 校正後體積
(m1)
Ⅰ 15 15 1.5 15.00
Ⅱ 5 5×(15／13.5) 1.5 5.5
Ⅲ 6 6×(15／13.5)×(5／3.5) 1.5 9.5
五、 結果
在同一張圖上畫出所有管的酶活力、光吸收值A280的曲線和洗脫梯度線。得出各級分的活力，比活力，提純倍數以及回收率。
六、 注意事項
從上樣開始收集，可能有兩個活性峰，梯度洗脫開始前的第一個峰是未吸附物，本實驗取用梯度洗脫開始後洗下來的活性峰。
七、 作業
1．為什麼酶的提取需要低溫操作？
2．熱處理的根據是什麼？
去除熱敏感蛋白。
參考文獻
1．邵雪玲，毛歆，郭一清．生物化學與分子生物學實驗指導．武漢：武漢大學出版社，2003
2．張龍翔．高級生物化學實驗選編．北京：高等教育出版社，1989
3．許培雅，邱樂泉．離子交換柱層析純化蔗糖酶實驗方法改進研究．實驗室研究與探索，2002，21(3):82~84
編著者——陳彥，李紹飛