A. 磺酸基陽離子交換鍵合硅膠色譜柱，怎樣維護保養及活化
在使用系統之前，首要任務是檢查色譜柱是否受到微生物污染，否則可能會導致柱子堵塞，使得柱壓升高到無法接受的水平。首先，不連接檢測器，正向安裝色譜柱，使用純甲醇以0.6ml/min流速沖洗大約10倍柱體積。接著，連接檢測器，繼續使用純甲醇以相同流速沖洗約20倍柱體積。隨後，改用去離子水以相同流速沖洗約20倍柱體積。
為確保色譜柱的最佳性能，建議連接保護柱（通常由製造商提供），然後用選定的洗脫液以0.6ml/min流速平衡柱子至少1小時。在用分析洗脫液進行平衡前，如果洗脫液中含有緩沖鹽，應先使用不含緩沖鹽的同比例洗脫液過渡，沖洗約10倍柱體積，以避免緩沖鹽在分析柱內析出。
在進行洗脫液選擇時，需注意陽離子交換柱多使用檸檬酸或酒石酸緩沖液（或其混合溶液）、鄰苯二甲酸緩沖液，pH范圍從2.5到6.5；陰離子交換柱則多使用磷酸緩沖液、硝酸銨溶液（1mMol/L），鄰苯二甲酸緩沖液，pH范圍同樣從2.5到6.5。絕對禁止使用水楊酸緩沖液，因為水楊酸的分解產物會改變固定相的性質。洗脫液在使用前必須通過0.45um濾膜過濾並徹底脫氣，以避免檢測和泵送問題。
為了提高分析的穩定性，建議在室溫條件下使用色譜柱，如果需要，可以將柱溫設置為高於室溫5～10℃。避免在40℃以上使用，以防損壞色譜柱。
在使用過程中，切勿超過色譜柱的耐受最高壓力。調整流速時，應採取小的間隔變化以避免柱床擾動。更換柱子時，務必先將流量降至0，等待洗脫液完全流出柱子，壓力變化到0（約2min）後再進行更換。
防止將來自流動相或樣品中的疏水性或與流動相極性差別很大的化合物進入色譜柱，尤其要避免導入顆粒雜質，以防止操作壓力增高，污染物難以或不能去除。
分析完畢後，採用與C18柱類似的凈化程序，首先用去離子水以0.6ml/min流速沖洗約20倍柱體積，然後用甲醇以相同流速沖洗約10倍柱體積，確保純甲醇飽和後密封保存。
對於長時間保存後的重新使用，重復上述步驟即可。
B. 離子交換層析速問速答
離子交換層析是一種基於樣品的帶電性質進行分離的技術，主要用於蛋白純化。以下為離子交換層析的問答，旨在深入理解該技術。
01、離子交換層析分為哪幾種？
離子交換層析根據配基的不同，主要分為陽離子交換層析和陰離子交換層析。陽離子交換柱可以吸附帶正電荷的蛋白，而陰離子交換柱則吸附帶負電荷的蛋白。
02、如何選擇陽離子還是陰離子？
蛋白是兩性分子，具有等電點（PI）。當緩沖液的PH值低於蛋白的等電點（PI），蛋白帶正電荷時，應選擇陽離子交換柱；反之，當PH值高於等電點（PI），蛋白帶負電荷時，選擇陰離子交換柱。
03、強和弱離子交換劑的區別？
強離子交換劑在PH范圍內載量恆定，弱離子交換劑載量隨PH變化。優先使用強離子交換劑，若選擇性不足，嘗試使用弱離子交換劑。
04、如何選擇緩沖液的PH值？
建議使用PH 6-8的中性緩沖液。通常，選擇與等電點相差1個PH值的緩沖液作為初始嘗試。為了達到最佳分離效果，通常需要進行PH條件的摸索。
05、若不知道蛋白的等電點？
大多數蛋白的等電點低於PH 7，可以使用Q柱進行嘗試，緩沖液使用PH 7。也可以選擇離子交換試劑盒進行摸索。
06、緩沖液的配置？
請參照說明書，注意在添加氯化鈉後調整PH。
07、初次實驗的標准條件？
開始使用緩沖液A：20-50 mM，洗脫緩沖液B：20-50 mM + 1M NaCl。
08、樣品未結合？
可能原因包括：樣品鹽濃度太高、PH優化不足、緩沖液含有帶電物質（如去垢劑）、柱效下降。解決方法包括CIP清洗。
09、結合後無法洗下？
嘗試增加洗脫液鹽濃度、評估蛋白穩定性、優化PH值。
10、純度不足？
解決方法包括：採用線性梯度洗脫、優化緩沖液條件、使用更高解析度產品、增加分子篩、疏水等多步純化。
C. 將四種核苷酸吸附於陰離子交換柱上時，應將溶液調到什麼 ph
① 電泳分離4種核苷酸時應取pH3.5 的緩沖液，在該pH時，這4種單核苷酸之間所帶負電荷版差異較大權，它們都向正極移動，但移動的速度不同，依次為：UMP>GMP>AMP>CMP；
② 應取pH8.0，這樣可使核苷酸帶較多負電荷，利於吸附於陰離子交換樹脂柱。雖然pH 11.4時核苷酸帶有更多的負電荷，但pH過高對分離不利。
③ 當不考慮樹脂的非極性吸附時，根據核苷酸負電荷的多少來決定洗脫速度，則洗脫順序為CMP>AMP> GMP > UMP，但實際上核苷酸和聚苯乙烯陰離子交換樹脂之間存在著非極性吸附，嘌呤鹼基的非極性吸附是嘧啶鹼基的3倍。靜電吸附與非極性吸附共同作用的結果使洗脫順序為：CMP> AMP > UMP >GMP。
D. 離子交換層析具體操作
離子交換層析操作詳解
1. 預處理和裝柱是離子交換層析的關鍵步驟。首先，對於離子交換纖維素，需要流水沖洗去除碎屑，以確保均勻度。若產品已溶脹，可跳過這步，但需確保其成為帶H+或OH-的交換劑型。陰離子交換劑通常採用「鹼-酸-鹼」處理，轉變成-OH-或鹽型，陽離子交換劑則用「酸-鹼-酸」處理，變為-H-型。裝柱前，平衡至所需的pH和離子強度，並減壓排除氣泡。為了防止顆粒分層，裝柱時需適當加壓，確保柱床緊實，以提高解析度。裝好後，需用起始緩沖液淋洗，直至達到平衡狀態方可使用。
2. 加樣與洗脫階段，樣品應與起始緩沖液保持相同的pH和離子強度，選擇的pH值應在交換劑與結合物相反電荷的范圍內，同時離子強度要低，可通過透析、凝膠過濾或稀釋來調整。不溶物需預先除去。合適的上樣量是關鍵，一般不超過柱子的負荷能力，上樣量通常為交換劑總量的1%-5%。洗脫樣品時，可通過改變pH或離子強度，或採用階段洗脫或連續梯度洗脫法，後者通過控制兩個容器中緩沖液濃度的梯度變化來達到最佳分離效果。在洗脫過程中，需確保洗脫液體積充足，梯度上限足夠高且上升速度適中，以防止目的物過早或過晚解吸。
3. 洗脫後的分析，以5-10毫升/管收集洗脫液，通過檢測方法（如生物活性測定或免疫學測定）確定目的物位置，然後進行回收。對於離子交換劑的再生，如纖維素可用NaCl和NaOH溶液處理，脂溶性物質則需非離子型去污劑或乙醇清洗。保存時，需添加防腐劑，陰離子交換劑通常使用氯已定，陽離子交換劑則使用乙基硫柳汞，有些產品可添加疊氮鈉。
離子交換層析操作需嚴格把控各個步驟，確保樣品處理得當，洗脫過程有效，以實現理想的分離效果。
離子交換層析（Ion Exchange Chromatography簡稱為IEC）是以離子交換劑為固定相，依據流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時的結合力大小的差別而進行分離的一種層析方法。1