利用凝膠過濾純化酶的步驟

Ⅰ 怎樣從濾紙中提取纖維素酶

要從濾紙中提取纖維素酶，可以採用一種較為自然的方法。首先，將濾紙埋入土壤中，定期檢查其狀態。待濾紙開始腐爛時，連同附著的土壤一起取出，帶入實驗室。在實驗室中，以新的濾紙作為碳源，分離並純化出纖維素降解菌。獲取這些纖維素降解菌後，進行大量培養，隨後便可以進一步提取和純化纖維素降解酶。

纖維素降解菌在分解纖維素的過程中會產生纖維素酶，這是一種能夠將纖維素分解為更小分子的酶。在實驗室條件下，可以通過一系列步驟來分離和純化這些酶。首先，利用培養基培養纖維素降解菌，然後使用適當的提取方法從培養液或菌體中提取纖維素酶。提取過程中，可以採用酸鹼處理、超聲波處理或酶解等方法，以提高纖維素酶的提取效率。

提取得到的纖維素酶需要進一步純化，以去除其他雜質，確保其純度。純化方法包括凝膠過濾、離子交換層析、親和層析等。通過這些方法，可以將纖維素酶與其他蛋白質和雜質分離，從而得到較為純的酶。

提取和純化纖維素酶的過程，不僅需要具備一定的實驗室操作技能，還需要熟悉各種提取和純化技術。通過對纖維素酶的研究和應用，可以為生物技術、環保等領域帶來新的突破。

纖維素酶具有廣泛的應用前景，例如在紡織、造紙、生物燃料等領域中，都可以發揮重要作用。通過提取和純化纖維素酶，可以為這些領域的技術革新提供支持。此外，纖維素酶的研究還有助於我們更好地了解微生物如何分解復雜的碳水化合物，從而為生物能源和環境治理提供新的思路。

總之，從濾紙中提取纖維素酶是一項既有趣又有意義的工作。通過這一過程，不僅可以獲得具有重要應用價值的酶，還能進一步加深我們對微生物代謝過程的理解。

Ⅱ 凝膠的生物

生物分子下游純化的對象一般包括蛋白、酶、重組蛋白、單抗、抗體及抗原、肽類、病毒、核酸等。純化前首先需要測定生物分子的各物理和化學特性，然後通過實驗選擇出最有效的純化流程。
1.測定——分子量、PI
當目標蛋白的物理特性如分子量、PI等都不清楚時，可用PAGE電泳方法或層析方法加以測定。分離范圍廣闊的Superose HR預裝柱很適合測定未知蛋白的分子量。用少量離子交換介質在多個含不同PH緩沖液的試管中，可簡易地測出PI，並選擇純化用緩沖液的最佳PH。
2.選擇——層析方法
若對目標蛋白的特性或樣品成分不太了解，可嘗試幾種不同的純化方法：
一 使用最通用的凝膠過濾方法，選擇分離范圍廣闊的介質如Superose、Sephacryl HR依據分子量將樣品分成不同組份。
二 用含專一配體或抗體的親和層析介質結合目標蛋白。亦可用各種活化偶聯介質偶聯目標蛋白的底物、受體等自製親和介質，再用以結合目標蛋白。一步即可得到高純度樣品。
三 體積大的樣品，往往使用離子交換層析加以濃縮及粗純化。高鹽洗脫的樣品，可再用疏水層析純化。疏水層析利用高鹽吸附、低鹽洗脫的原理，洗脫樣品又可直接上離子交換等吸附性層析。兩種方法常被交替使用於純化流程中。
3.純化——大量粗品
處理大量原液時，為避免堵塞柱子，一般使用sepharose big beads、sepharoseXL、sepharose fast flow等大顆粒離子交換介質。擴張柱床吸附技術利用多種STREAMLINE介質，直接從含破碎細胞或組織萃取物的發酵液中俘獲蛋白。將離心、超濾、初純化結合為一。提高回收率，縮短純化周期。
4.純化——硫酸氨樣品
硫酸氨沉澱方法常被用來初步凈化樣品，經處理過的樣本處於高鹽狀態下，很適合直接上疏水層析。若作離子交換，需先用Sephadex G-25脫鹽。疏水層析是較新技術，隨著介質種類不斷增多，漸被融入各生產工藝中。利用Hitrap HIC Test Kit 和RESOURCE HIC Test Kit可在八種疏水介質中選擇最適合介質及最佳的純化條件。低鹽洗脫的樣品可稍加稀釋或直接上其它吸附性層析。
5.純化——糖類分子
固化外源凝訂素如刀豆球蛋白、花生、大麥等凝集素，可結合碳水化合物的糖類殘基，很適合用作分離糖化細胞膜組份、細胞、甚至亞細胞細胞器，純化糖蛋白等。兩種附上外源凝集素的Sepharose 6MB親和層析介質，專為俘獲整個細胞或大復合物，如膜囊等。
6.純化——膜蛋白
膜蛋白分離常使用去污劑以保持其活性。離子性去污劑應選用與目標蛋白相反電荷者，避免在作離子交換時和目標蛋白競爭交換介質，藉此除去去污劑。非離子性去污劑可以疏水層析除去。
7.純化——單抗、抗原
單抗多為IgG.來源主要是腹水和融合瘤培養上清液。在培養前除去IgG.重組蛋白A介質Mabselect和rProtein A Sepharose FF對IgG有更高的載量和專一性，基團脫落更少。脫落的rProtein A用離子交換Q Sepharose HP或凝膠過濾Superdex 200，很容易去除。
疏水層析Phenyl Sepharose HP亦很適合純化IgG.宿主抗體和污染IgG可用凝膠過濾Superdex 200在精細純化中去除。
純化IgG抗原最有效的方法是用活化偶聯介質如CNBr、NHs activated Sepharose FF偶聯IgG，再進一步獲取IgG抗原。
HiTrap IgM是用來純化融合瘤細胞培養的單抗IgM，結合量達5mg IgM.HiTrap IgY是專門用來純化IgY，結合量達100mg純IgY.
8.純化——重組蛋白
重組蛋白在設計、構建時應已融入純化構想。樣品多夾雜了破碎細胞或溶解產物，擴張柱床吸附技術STREAMLINE便很適合做粗分離。Amersham biosciences提供三個快速表達、一步純化的融合系統。
一 GST融合載體使要表達的蛋白和谷胱甘肽S轉移酶一起表達，然後利用Glutathione Sepharose 4B作親和層析純化，再利用凝血酶或因子Xa切開。
2. 蛋白A融合載體使要表達的蛋白和蛋白A的IgG結合部位融合在一起表達，以IgG Sepharose 6 FF純化。
二 含組氨酸標記（Histidine-tagged）的融合蛋白可用Chelating Sepharose FF螯合Ni2+金屬，在一般或變性條件（8M尿素）下透過組氨酸螯合融合蛋白。HisTrap試劑盒提供整套His-Tag蛋白的純化方法。
9.純化——包涵體蛋白
包涵體蛋白往往需溶於6M鹽酸胍或8M尿素中。一般包涵體蛋白樣品的純度越高，復性效果越好。SOURCE 30 RPC反相層析介質很適合純化復性前的粗品，並可以1MnaOH重生。此方法純化後的包涵體蛋白，復性回收率明顯提高。
10.包涵體蛋白固相復性
許多文獻報導將包涵體蛋白在變性條件下固定（吸附）在層析介質上，一般用各種Sepharose FF離子交換層析介質。而且無需大量稀釋樣品，並將復性和初純化合二為一，大大節省時間及提高回收率。
固相復性方法也被用於以HiTrap Chelating金屬螯合層析直接復性及純化包涵體形式表達的組氨酸融合蛋白；以HiTrap Heparin肝素親和層析直接復性及純化包涵體形式表達的含多個賴氨酸的融合蛋白。兩種親和層析預裝柱均可反復多次重復使用，比一般試劑盒更方便、耐用。
11.純化——中草葯有效成分
中葯的化學成分極其復雜。例：如用甲醇分離黃酮甙，三糖甙先被洗下來，二糖甙其次，單糖甙隨後，最後是甙元。Sephadex LH-20可使用水、醇、丙酮、氯仿等各種試劑，廣泛用於各種天然產物的分離，包括生物鹼、甙、黃酮、醌類、內脂、萜類、甾類等。
生物鹼在酸性緩沖液中帶正電，成為鹽，HiTrap SP陽離子交換層析柱可以分離許多結構非常近似的生物鹼。相反，黃酮、蒽醌、皂甙、有機酸等可溶於偏鹼的緩沖液中，在HiTrap Q陰離子交換柱上分離效果良好。
一般多糖純化大多使用分子篩如Sephadex，Sephacryl.若分子量在600KD以下，並需更高解析度，可選擇新一代的Superdex.一般植物可能含水溶性、酸溶性、鹼溶性多種多糖。SOURCE5、15、30RPC反相層析也很適合各種中葯有效成分的檢測、分離和放大制備。由於中葯的成分非常復雜，SOURCE反相層析可用范圍為PH1-14 ，並可用1M NaOH，1M HCL清洗、再生。比傳統硅膠反相層析更易於工藝優化及在位清洗，壽命也更長。
12.純化——肽類
肽類的來源有天然萃取，合成肽和重組肽三種。肽容易被酶降解，但可從有機溶劑或促溶劑中復性，所以多以高選擇性的反相層析如SOURCE 30RPC、SOURCE 15RPC、SOURCE 5RPC或離子交換Minibeads、Monobeads作純化。Superdex Peptide HR是專為肽分子純化設計的凝膠過濾預裝柱，能配合反相層析做出更精美的肽圖。肽分子制備可用離子交換配合凝膠過濾Superdex 30 PG。醫學都市多功能
13.純化——核酸、病毒
核酸的純化用於去除影響測序或PCR污染物等研究。核酸可大致上分為質粒DNA、噬菌體DNA和PCR產物等。病毒也可視作核酸大分子，和質粒DNA一樣，可用分離大分子的Sephacry S-1000 SF、Superose或Sepharoce 4FF凝膠過濾介質去除雜蛋白，再配合離子交換如Mono Q、 SOURCE Q分離核酸。
14.純化——寡核苷酸寡酸苷酸
多應用在反義（anti-sense）DNA、RNA測序、PCR和cDNA合成等研究。合成後含三苯甲基的寡核苷酸以陰離子交換的Mono Q或快速低反壓的SOURCE Q在PH12下可除副產物，並避免凝集和保護基的脫落。載量大大高過反相層析，可用做大量制備。不含三苯甲基的失敗序列可用反相柱ProRPC去除。
15.脫鹽、小分子去除
使用凝膠過濾介質Sephadex G10，G15，G25，G50等去除小分子，效率高，處理量可達床體積30%.只需在進樣後收集首1/3-1/2柱體積的洗脫液，HiPrep Desalting（26ml）可在數分鍾為多至10ml樣品脫鹽。
16.疫苗純化
使用凝膠過濾介質Sepharose 4FF純化疫苗，去除培養基中的雜蛋白，處理量可大於床體積10%.柱高一般40-70cm，整個過程約半至一小時。使用此法生產的疫苗品種有乙肝、狂犬、出血熱、流感、肺結核、小兒麻痹疫苗等。分子量較小的疫苗可使用Sephacryl S-500HR，如甲肝疫苗等。
17.抗生素聚合物分析
中國葯典從2000年版起要求抗生素頭孢曲松鈉需要找出聚合物占產品的白分比，規定使用Sephadex G10凝膠過濾法測定。
18.純化-基因治療用病毒載體
SORRCE 15Q
19.純化-基因治療用質粒
Q Sepharose XL，SOURCE 15Q，STREAMLINE Q，Sephacryl S500，Plasmidselect 在下游純化中，可應用不同層析技術在純化生物分子的同時，去除各種污染物。 1.去除——內毒素
內毒素又稱熱原。含脂肪A、糖類和蛋白，是帶負電的復合大分子。
內毒素的脂肪A部份有很強的疏水性。但在高鹽下會凝集，無法上疏水層析。利用疏水層析試驗盒（17-1349-01）可選擇結合目標蛋白的介質而去除內毒素。
內毒素與陰離子交換介質Q或DEAE Sepharose Fast Flow有較強結合。可在洗脫目標蛋白後用高鹽緩沖液或NaOH去除。
利用CNBr或NHS Sepharose FF可偶聯內毒素底物如LAL，PMB，自動成親合層析介質結合內毒素。內毒素經常是多聚體，凝膠過濾層析可有效地將之去除。
2.去除——蛋白中的核酸
大量核酸增加樣本黏度，令區帶擴張，反壓增加，降低解析度和流速。葯審和食檢對核酸含量也有嚴格限制。
胞內表達蛋白的核酸問題尤其嚴重。核酸帶陰電荷，在初步純化時利用陽離子交換介質如STREAMLINESP，SP Sepharose Big Beads，SP或CM Sepharose FF，SP SepharoseXL結合目標蛋白，可除去大量核酸。
核酸在高鹽下會和蛋白解離，疏水層析介質很適合用來結合目標蛋白，在純化蛋白的同時去除核酸。
利用核酸酶將核酸切成小片斷，用凝膠過濾做精細純化時便很容易去除了。
3.去除——病毒和微生物
病毒和微生物可成為病原，應盡量減除。結合不同層析技術，使用注射用水，用NaOH定期進行儀器和凝膠的在位消毒和在位清洗，皆可避免污染物增加。
病毒大都有脂外殼。可用與目標蛋白電荷相反的S/D（solvent/detergent）處理，使病毒失活，如Triton和Tween.再用適當的離子交換介質如CM Sepharose FF結合目標蛋白，去除S/D.
其它污染物可以改變pH和離子強度使其從目標分子中解離或失活，凝膠過濾介質Superdex及多種吸附性介質，SOURCE都是很好的精細純化介質，可去除多種微量污染物。 凝膠是指顆粒大小在1埃到10埃之間的混合物。高分子溶液和某些溶膠，在適當的條件下，整個體系會轉變成一種彈性的半固體狀態的稠厚物質，失去流動性。這種現象稱為膠凝作用,所形成的產物叫做凝膠或凍膠.
「氣凝膠」是指分散系為氣態的，如：雲，霧等，「固凝膠」有煙水晶等，「液凝膠」就是呈液態的膠體，如氫氧化鐵膠體 。