內包材薄膜過濾法如何取樣

A. 生物製品的無菌檢查法的實驗原理，准備工作及操作步驟

文獻資料 - 醫學書籍 - 中國生物製品規程
生物製品無菌試驗規程

生物製品不得含有雜菌（有專門規定者除外），滅活菌苗、疫苗不得含有活的本菌、本毒。在製造過程中應由製造部門按各製品製造及檢定規程規定進行無菌試驗，分裝後的製品須經質量檢定部門做最後檢定。各種生物製品的無菌試驗除有專門規定者外，均應按照本規程的規定進行。

1抽樣

1.1原液及半成品

原液及半成品應每瓶分別進行無菌試驗，其抽樣量應至少為0.1%，但不得少於1.0ml。

1.1.1大罐稀釋的製品抽樣數量不得少於10ml。

1.1.2原液及半成品每開瓶一次，應如上法抽驗。

1.2成品

每亞批均應進行無菌試驗，樣品應隨機抽取，應具有代表性（包括分裝過程的前、中、後樣品）。

1.2.1分裝量在100支（瓶）或以下者抽檢不少於5支，101～500支（瓶）者抽檢不少於10支（瓶），501～10000支（瓶）者抽檢不少於20支（瓶，10001支（瓶）以上者抽檢40支（瓶）。

1.2.2每瓶裝量20ml以上的凍干血液製品，每櫃凍干200瓶以下者抽檢2瓶，200瓶及以上者抽檢4瓶。6～20ml抽檢量加倍。5ml和5ml以下者按1.2.1項抽檢。

1.3凡規定需作支原體檢查的製品，均應在半成品時按亞批進行檢查，成品可不再做。

2無菌試驗用培養基（培養基處方可附錄1）

2.1檢查製品中本菌是否存活應採用適於本菌發育生長的培養基（在半成品時檢查，有專門規定者除外）。

2.2檢查需氧性和厭氧性雜菌應採用硫乙醇酸鹽培養基。檢查不含汞類防腐劑製品中的需氧性和厭氧性雜菌時，該培養基中可不加硫乙醇酸鹽。

檢查黴菌和腐生菌應採用改良馬丁培養基。

檢查混濁製品可採用不含瓊脂的硫乙醇酸鹽培養基。檢查活菌苗時可加大瓊脂含量，做成斜面。

2.3檢查支原體應採用豬胃消化液半固體或牛心消化液半固體培養基。

2.4生物製品無菌試驗用培養基亦可用經檢定合格的乾燥培養基配製。

2.5無菌試驗培養基的靈敏度，乙型溶血性鏈球菌（32210株）應達到10-8，短芽胞桿菌（7316株）和生孢子梭狀芽胞桿菌（64941株）應達到10-7，白色念珠菌（ATCc 10231）和臘葉芽枝霉應達到10-6。

2.6生物製品無菌試驗培養基由質量檢定部門與培養基製造部門會同進行靈敏度試驗。每當更換主要原材料時，應進行靈敏度試驗，合格後方可應用（靈敏度試驗法見附錄2、3）。

2.7各生產單位的質量檢定部門應定期抽檢無菌試驗培養基的靈敏度，檢定所應定期抽檢各所的無菌試驗培養基。

3無菌試驗方法

3.1無菌試驗取樣、移種等全部操作，應在無菌操作室內或無菌條件下進行，無菌操作室應經常保持清潔，在每次操作前，應徹底消毒。

3.2菌苗、疫苗、類毒素、抗毒素類製品及粘稠不易過濾的血液製品應用直接接種法進行無菌試驗。人白蛋白及人丙種球蛋白（包括各種劑型及應用途徑的製品）應用薄膜過濾法進行無菌試驗，其他血液製品亦可用薄膜過濾法或直接接種法進行。

3.3直接接種法

3.3.1菌苗、疫苗、類毒素、抗毒素類製品

3.3.1.1每安瓿裝量5.0ml以上者（不含5.0ml）取樣不應少於1.0ml，裝量在5.0ml以下者（含5.0ml）取樣不得少於0.5ml，裝量不足0.5ml者，全部吸取。

3.3.1.2含防腐劑的製品，接種量與培養基的比例：用苯酚或氯仿作防腐劑者至少為1:20，用汞作防腐劑者或製品內含有甲醛、抗生素者至少為1:50。先按此比例接種於硫乙醇酸鹽培養基內增菌，於20～25℃培育3～4天後移種至硫乙醇酸鹽培養基、適宜的瓊脂斜面、改良馬丁培養基各2管，每管0.5ml。將硫乙醇酸鹽培養基、適宜的瓊脂斜面各1管置30～35℃培育，其餘各管置20～25℃培育，培育時間除有專門規定者外共為8天。

3.3.1.3不含防腐劑製品，裝量在5.0ml以下者（包括5.0ml）每10支安瓿混合，裝量在5.0ml以上者每7支安瓿混合，將混合後的樣品直接接種一組培養基，分別置20～25℃、30～35℃培育，培育時間共為8天。

作者：天使也美麗 2006-2-24 16:39 回復此發言

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2 生物製品無菌試驗規程

3.3.1.4支原體培養基臨用時將半固體煮沸10～15分鍾後，冷卻到56℃左右，加入未滅能馬血清或滅能小牛血清和酵母浸液（培養基、血清、酵母浸液之比為7:2:1），並可酌情加入適量青黴素或醋酸鉈，充分搖勻，等冷至35～37℃時種入待檢樣品0.5～1.0ml，共接種2支培養基，置35～37℃培育14天。

3.3.1.5 混濁和接種後不能判定結果的製品，可取規定量的樣品接種於不含瓊脂的硫乙醇酸鹽培養基（200ml）內進行增菌培養，3～4天後移種。培養基種類和支數、培育溫度同3.3.1.2項，共培育8天後判定結果。

3.3.2血液製品

3.3.2.1取規定抽樣數，按下列規定，從每瓶抽取樣品，並全部接種完。

樣品每瓶裝量不足1.0ml者，抽取全量，1～20ml以下者（不含20ml），抽取1.0ml以上，每支裝量為15ml的培養基，接種1.0ml。

樣品每瓶裝量以下者（不含）抽取5.0ml以上,100ml及以上者按15%抽樣，每支裝量為40ml的培養基，接種5.0ml。

應接種的培養基支數依取樣的總量而定。接種硫乙醇酸鹽培養基與改良馬丁培養基支數之比為2:1。

接種後將硫乙醇酸鹽培養基總支數的1/2置30～35℃培育，其餘置20～25℃培育，改良馬丁培養基置20～25℃培育，培育時間不少於14天。

3.4薄膜過濾法

濾膜孔徑為0.22～0.3μm。

取規定抽檢樣品數，每瓶裝量100ml及100ml以下者取全量，100ml以上者取半量加入滅菌薄膜過濾器內，加壓或減壓過濾。如為含汞防腐劑者，在樣品過濾後，應用滅菌生理鹽水或其他適宜溶劑沖洗濾膜3次，每次100ml。過濾後，無菌取出濾膜，分別放入硫乙醇酸鹽培養基2支及改良馬丁培養基1支（每支裝量不少於40ml，高度不得低於7cm）。如果使用一個過濾裝置，則將該膜剪成三等分，分別放入規定培養基中。將濾膜放入培養基後，一支硫乙醇酸鹽培養基置30～35℃培育，其餘各支培養基置20～25℃培育。培育時間不少於7天。

最好採用全封閉式一次性微孔過濾集菌器，要求每支培養器培養裝量為100ml。

3.5檢查厭氧性雜菌用培養基需加熱驅氧者，必須冷卻到45℃以下再行接種。

3.6凍干製品按使用說明書或瓶簽規定的稀釋量稀釋後進行無菌試驗。

4判定

4.1無雜菌生長判為合格（有專門規定者除外）。

4.2無菌試驗發現雜菌生長，可復試。該製品量應加倍。若復試仍有同樣雜菌生長，該製品判為不合格。如為不同雜菌生長，可第二次復試，復試樣品為第一次復試量的2倍，若仍有雜菌生長該製品判為不合格。支原體陽性者不復試，該批製品判為不合格。

4.3成品無菌試驗不合格的亞批數占整批的30%以上時，由質量檢定部門會同有關部門根據具體情況，全部或部分廢棄。

附錄 1無菌試驗培養基處方

1硫乙醇酸鹽培養基

胰酪蛋白腖（或酪素胰酶消化液，以總氮計2000mg） 15g
酵母浸出粉（或酵母透析液200ml） 5g
葡萄糖
5g

氯化鈉
2.5g

L-胱氨酸（或半胱氨酸鹽酸鹽）
0.5g

硫乙醇酸鈉（或硫乙醇酸0.6ml）
0.5g

瓊脂
0.65～0.75g

新鮮配製的0.1%刃天青溶液（或0.2%美藍溶液0.5ml）
1.0ml

去離子水（或蒸餾水）
加至1000ml

最後pH7.1±0.2

2硫乙醇酸鹽培養基（不含瓊脂）

胰酪蛋白腖（或酪素胰酶消化液，以總氮計2000mg）
15g

酵母浸出粉（或酵母透析液200ml）
5g

葡萄糖
5g

氯化鈉
2.5g

L-胱氨酸（或半胱氨酸鹽酸鹽）
0.5g

硫乙醇酸鈉（或硫乙醇酸0.6ml）
0.5g

去離子水（或蒸餾水）
加至1000ml

最後pH7.1±0.2

3 改良馬丁培養基

葡萄糖
20g

蛋白腖
5g

酵母浸出粉（或酵母透析液100ml） 2g

磷酸氫二鉀
1g

硫酸鎂（含7分子結晶水）
0.5g

去離子水（或蒸餾水）

B. 水質檢測時，我們用薄膜過濾法。但是我有幾個問題向老師請教.

1 生物酶並沒來有你想像的多 不會影響細自菌生長 而且薄膜過濾後會被濾掉只剩下微生物
2 營養瓊脂和玫瑰紅鈉都不是選擇培養基 有時候會有都長的情況 營養瓊脂培養基建議加TTC讓細菌更容易觀察 也可以通過其他方式來判斷~比如細菌菌落大小不一 一般比較小 邊緣光滑 味道臭 真菌酵母菌菌落大 有的會長毛 有酒香或霉味。更准確的方法是用選擇培養基進一步培養 或顯微鏡觀察 最好是增加陽性對照試驗

C. 葯包材的分類有哪些取樣原則又是怎樣的

新版GMP第222條是對物料檢驗取樣操作的規范要求，其中明確規定企業制定的取樣操作規程應規定取樣量，取樣方法應當科學、合理，以保證樣品的代表性。如何保證取樣的代表性？對於葯材和中葯飲片，大多執行葯典通則規定的取樣原則。原輔料的取樣，一般採取的是3件以內，逐件取樣；超過3件，按總件數開根號加1進行取樣。但對於包裝材料，如何取樣比較合理，業內做法不盡一致。不少企業的相關規程規定的取樣件數比例與原輔料相同，但實際操作時卻又未按規程執行。對此，筆者有以下幾點思考。包裝材料與原輔料的本質差異除了與葯品直接接觸的包裝材料和容器外，葯品生產企業使用的絕大多數包裝材料與葯品內在質量並無直接關系。葯典相關指導原則中，對「葯包材」的概念，就是指「直接與葯品接觸的包裝材料與容器」，其它包材並不包含其中。即使與葯品直接接觸的包裝材料，鑒於其在產品研發階段，已經就其安全性、穩定性、功能性、保護性以及與所包裝葯品的相容性等進行了全面、系統的研究，因此，在不改變材質與供應商的情況下，包材總體上不會對產品安全帶來大的影響。因此，對包裝材料的取樣原則不宜套用一般原輔料，既沒有必要，在實際工作中也存在操作性不強的一面。有的企業未按規程規定件數對標簽類包材進行取樣，在認證檢查過程中，被作為缺陷項目提出。因此，作為葯品生產企業，有必要根據具體情況，天和醫塑研究擬訂有別於原輔料的包裝材料取樣原則。包裝材料的合理分類對於企業使用的各類包裝材料，有必要依據其對葯品安全質量可能產生的影響，予以合理分類。筆者認為，對包裝材料，同樣可以根據其對葯品質量及安全性影響程度，劃分為A、B、C三類。A類即是直接接觸葯品的包材與容器，包括輸液袋（瓶、膜及配件）、安瓿、葯用膠塞、葯用滴眼（鼻、耳）劑瓶、葯用硬片、葯用鋁箔、葯用軟膏管（盒）、葯用噴劑泵（閥門、罐、桶等）、葯用乾燥劑、口服制劑灌裝瓶等。B類包材包括各類印刷性包裝材料（如標簽、說明書以及印有產品信息的包裝材料等）。C類包材則主要指非印刷性的不直接接觸產品的包裝材料（如打包膜、膠帶等）。依據包裝材料的分類，再確定取樣原則，既可以體現風險管理要求，又可以提高工作效率，確保實施GMP過程的務實、有效。

D. 微生物限度檢查中用膜過濾法時，是把濾膜上有菌液的那面貼到培養基上，還把反面貼到培養基

微生物限度的方法有多種。如果是用膜過濾法的話，就你提到的問題，可以查詢2010版的《中國葯典》附錄，裡面有提到。應該是把濾膜接觸到供試液的那面貼於培養基上。

E. 純化水的微生物限度里的薄膜過濾法如何計數啊

一次兩毫升水。把過濾完成的薄膜正面貼在R2A平板上，18小時後計數，每天數一次，可以用軟體數，也可以人工數，用記號筆在碟子上打點。細菌三天，黴菌五天。

F. 純化水微生物限度檢查用薄膜過濾法怎麼做

准備工作：

用純化水浸泡濾膜，浸泡完全後放入濾杯中，包好濾杯，連同回量筒、培養基、平皿、答取膜器、三角燒瓶等一起121℃滅菌30min。

滅菌後的物品一並傳入潔凈室中，微生物限度過濾器上連好已經滅好的濾杯，用緩沖液先潤濕濾膜，抽掉緩沖液，然後倒入供試液（10倍稀釋），濾過，再用緩沖液沖洗濾膜。

過濾結束後取下濾膜平貼於R2A瓊脂培養基平板上，32℃倒置培養5天。菌落計數（平皿上長幾個菌結果就報幾個菌）

(6)內包材薄膜過濾法如何取樣擴展閱讀：

薄膜過濾系統主要用於去除小顆粒及溶解鹽，一般可分為微濾、超濾、納濾和薄膜過濾反滲透。

微濾又稱微孔過濾，它屬於精密過濾，截留溶液中的砂礫、淤泥、黏土等顆粒和賈第蟲、隱抱子蟲、藻類和一些細菌等，而大量溶劑、小分子及少量大分子溶質都能透過膜的分離過程。

超濾是一種加壓膜分離技術，即在一定的壓力下，使小分子溶質和溶劑穿過一定孔徑的特製的薄膜，而使大分子溶質不能透過，留在膜的一邊，從而使大分子物質得到了部分的純化

納濾 ( NF，Nanofiltration)是一種介於反滲透和超濾之間的壓力驅動膜分離過程，納濾膜的孔徑范圍在幾個納米左右。

參考資料來源：網路-薄膜過濾

G. 純化水進行微生物限度檢測，使用薄膜過濾法應該取多少

准備工作：用純化水浸泡濾膜，浸泡完全後放入濾杯中，包好濾杯，連同量筒、培養基、專平皿、取膜器、三角屬燒瓶等一起121℃滅菌30min。滅菌後的物品一並傳入潔凈室中，微生物限度過濾器上連好已經滅好的濾杯，用緩沖液先潤濕濾膜，抽掉緩沖液，然後倒入供試液（10倍稀釋），濾過，再用緩沖液沖洗濾膜。過濾結束後取下濾膜平貼於R2A瓊脂培養基平板上，32℃倒置培養5天。菌落計數（平皿上長幾個菌結果就報幾個菌）

H. 微生物薄膜過濾法，夾膜技巧

（1）驗證試驗方法：試驗原理同前述薄膜過濾法。驗證供試品對薄膜過濾法有抑細菌和抑真菌特性時，與實際的無菌檢查相同，在同一型號的每個過濾器或過濾筒內過濾規定定量的供試品（容器數及每容器的過濾體積），用淋洗液淋洗濾膜至少3次，每次淋洗液體積為100ml，在最後一次淋洗液中，接入驗證用菌種（接種量為10—100CFU）；另取一過濾器或濾筒，不過濾供試品，重復以上淋洗操作，作為陽性對照。根據具體情況，可將整張濾膜或半張濾膜轉移至100ml的指定驗證用培養基內，或將培養基加入到裝有濾膜的濾筒內。分別對表中所列菌種及相應的培養基逐一進行驗證，並將容器置於適當的溫度下培養，培養時間不超過14d。如果使用新的濾膜或濾過器（包括不同廠家或批號、型號），則要按上述薄膜過濾法的要求做 , 組試驗，即樣品試驗組、蛋白腖對照組和陽性對照組重新進行驗證確認。
（2）驗證結果評價：如果供試品培養基容器內的培養基內明顯可見微生物生長（混濁），並且與陽性對照容器內的培養結果相似，則在無菌檢查試驗中必須要過濾與驗證試驗相等量的供試品、淋洗液，淋洗相同次數及使用同量的培養基。如果與陽性對照容器內的培養結果相比，供試品容器內微生物生長現象不明顯，則說明該檢驗量在此檢驗條件下有抑菌作用。應增加淋洗次數，重復以上實驗。也可通過更換過濾膜並使用中和劑來消除產品的抑菌作用。USP規定，如果已淋洗了5次，並且每次淋洗液體積達到500ml，仍無法中和膜上的殘余抑菌性物質，那麼在無菌檢查試驗中就採用此淋洗次數與淋洗量作為最終淋洗方法。

I. 什麼叫薄膜過濾法，具體怎麼操作呀

5.7.7 薄膜過濾法：
5.7.7.1 本法適用於有抗菌作用或大容量的供試品。
5.7.7.2 按集菌使內用規程安裝好集菌儀。
5.7.7.3 取供試品擦拭消容毒後，除去塑料蓋，插好導管，進行抽濾，濾液從排液管排出。
5.7.7.4 同法操作將培養基抽到全封閉式集菌培養器中。
5.7.7.5 取需氣菌、厭氣菌培養基和真菌培養基各1管，同法操作加入相應的溶劑作陰性對照。
5.7.7.6 陽性對照管應根據供試品特性在接種櫥內加入相應對照菌液1ml。（抗細菌葯物以金黃色葡萄球菌為對照菌，抗厭氧菌葯物以生孢梭菌為對照菌，抗真菌葯物以白色念珠菌為對照菌）。
5.7.7.7 需氣菌、厭氣菌培養基管置30-35℃培養箱中，真菌培養基管置20-25℃培養箱中各培養7日；陽性對照管細菌應在培養24-48小時，真菌應在培養24-72小時有菌生長。

J. 薄膜過濾法原理

薄膜過濾法

採用薄膜過濾法，濾膜孔徑不大於0.45um，直徑約為50mm。選擇濾膜材質時候應保證供試品及其溶劑不影響微生物的充分被截留。濾器及濾膜使用前應採用適宜的方法滅菌。使用後，應保證濾膜在過濾前後的完整性。水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤洗濾膜，供試液經薄膜過濾後，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量為100ml。每片濾膜的總過濾量不宜過大，以避免濾膜上的微生物受損傷。

取相當於每張濾膜含1克或1ml供試品的供試液，加至適宜的稀釋劑中，混勻過濾。若供試品每1克或1ml所含的菌數比較多時，可取適宜稀釋級的供試液1ml，過濾。用PH無菌氯化鈉——蛋白腖緩沖液或其它適宜的沖洗液沖洗液沖洗濾膜，沖洗方法和沖洗量同「計數方法的驗證」，沖洗後取出濾膜，菌面朝上貼於營養瓊脂培養基或玫瑰紅鈉瓊脂培養基或酵母浸出粉腖葡萄糖瓊脂培養基平板上培養。每種培養基至少制備一張濾膜。

陰性對照實驗

取實驗用的稀釋液1ml，照上述薄膜過濾法操作，作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。

培養和記數：

培養條件和記數方法同平皿法，每片濾膜上的菌數不應超過100個

菌數報告規則

以相當於1克或1ml供試品的菌落數報告菌數；若濾膜上無菌生長以<1報告菌數（每張濾膜過濾1g或1ml供試品），或以<1

乘於稀釋倍數的值報告菌數。