凝膠過濾技術

❶ 影響凝膠過濾分離效果的有哪些因素，為什麼

(1)層析柱的選擇
層析柱大小主要是根據樣品量的多少以及對解析度的要求來進行選擇。一般來講，主要是層析柱的長度對解析度影響較大，長的層析柱解析度要比短的高；但層析柱長度不能過長，否則會引起柱子不均一、流速過慢等實驗上的一些困難。一般柱長度不超過100cm，為得到高解析度，可以將柱子串聯使用。層析柱的直徑和長度比一般在1:25－1:100之間。用於分組分離的凝膠柱，如脫鹽柱由於對解析度要求較低，所以一般比較短。

(2)凝膠柱的鑒定
凝膠柱的填裝情況將直接影響分離效果，關於填裝的方法前面已有介紹，這里主要介紹對填裝好的凝膠柱的鑒定。凝膠柱填裝後用肉眼觀察應均勻、無紋路、無氣泡。另外通常可以採用一種有色的物質，如藍色葡聚糖-2000、血紅蛋白等上柱，觀察有色區帶在柱中的洗脫行為以檢測凝膠柱的均勻程度。如果色帶狹窄、平整、均勻下降，則表明柱中的凝膠填裝情況較好，可以使用；如果色帶彌散、歪曲，則需重新裝柱。另外值得一提的是，有時為了防止新凝膠柱對樣品的吸附，可以用一些物質預先過柱，以消除吸附。

(3)洗脫液的選擇
由於凝膠層析的分離原理是分子篩作用，它不象其它層析分離方式主要依賴於溶劑強度和選擇性的改變來進行分離，在凝膠層析中流動相只是起運載工具的作用，一般不依賴於流動相性質和組成的改變來提高解析度，改變洗脫液的主要目的是為了消除組分與固定相的吸附等相互作用，所以和其它層析方法相比，凝膠層析洗脫液的選擇不那麼嚴格。由於凝膠層析的分離機理簡單以及凝膠穩定工作的pH 范圍較廣，所以洗脫液的選擇主要取決於待分離樣品，一般來說只要能溶解被洗脫物質並不使其變性的緩沖液都可以用於凝膠層析。為了防止凝膠可能有吸附作用，一般洗脫液都含有一定濃度的鹽。

(4)加樣量
關於加樣前面已經有所介紹，要盡量快速、均勻。另外加樣量對實驗結果也可能造成較大的影響，加樣過多，會造成洗脫峰的重疊，影響分離效果；加樣過少，提純後各組分量少、濃度較低，實驗效率低。加樣量的多少要根據具體的實驗要求而定：凝膠柱較大，當然加樣量就可以較大；樣品中各組分分子量差異較大，加樣量也可以較大；一般分級分離時加樣體積約為凝膠柱床體積的1％－5％左右，而分組分離時加樣體積可以較大，一般約為凝膠柱床體積的10％－25％。如果有條件可以首先以較小的加樣量先進行一次分析，根據洗脫峰的情況來選擇合適的加樣量。設要分離的兩個組分的洗脫體積分別為Ve1和Ve2，那麼加樣量不能超過(Ve1－Ve2)。實際由於樣品擴散，所以加樣量應小於這個值。
從洗脫峰上看，如果所要的各個組分的洗脫峰分得很開，為了提高效率，可以適當增加加樣量；如果各個組分的洗脫峰只是剛好分開或沒有完全分開，則不能再加大加樣量，甚至要減小加樣量。另外加樣前要注意，樣品中的不溶物必須在上樣前去掉，以免污染凝膠柱。樣品的粘度不能過大，否則會影響分離效果。

(5)洗脫速度
洗脫速度也會影響凝膠層析的分離效果，一般洗脫速度要恆定而且合適。保持洗脫速度恆定通常有兩種方法，一種是使用恆流泵，另一種是恆壓重力洗脫。洗脫速度取決於很多因素，包括柱長、凝膠種類、顆粒大小等，一般來講，洗脫速度慢一些樣品可以與凝膠基質充分平衡，分離效果好。但洗脫速度過慢會造成樣品擴散加劇、區帶變寬，反而會降低解析度，而且實驗時間會大大延長；所以實驗中應根據實際情況來選擇合適的洗脫速度，可以通過進行預備實驗來選擇洗脫速度。一般凝膠的流速是2－10 cm/hr，市售的凝膠一般會提供一個建議流速，可供參考。總之，凝膠層析的各種條件，包括凝膠類型、層析柱大小、洗脫液、上樣量、洗脫速度等等，都要根據具體的實驗要求來選擇。例如樣品中各個組分差異較小，則實驗要求凝膠層析要有較高的解析度，提高解析度的選擇應主要包括：選擇包括各個待分離組分但分離范圍盡量小一些的凝膠，選擇顆粒小的凝膠，選擇解析度高的凝膠類型，選擇較長、直徑較大的層析柱、減少加樣量、降低洗脫速度等等。

❷ 凝膠過濾方法有什麼局限性

葡聚糖凝膠對蛋白質往往有不可逆的吸附性能，需先用易得到的蛋白質進行預層析，以便消除其影響(雖然吸附的數量較少，但是在製作測定蛋白質分子質量的標准曲線時，或者分離純化極難得到的物質時,需預層析)。

❸ 凝膠過濾層析常用介質有哪些凝膠過濾層析技術有何優點與用途

1.凝膠層析操作簡便，所需設備簡單。有時只要有一根層析柱便可進行工作。分離介質—凝膠完全不需要像離子交換劑那樣復雜的再生過程便可重復使用。
2.分離效果較好，重復性高。最突出的是樣品回收率高，接近100%。
3.分離條件緩和。凝膠骨架親水，分離過程又不涉及化學鍵的變化，所以對分離物的活性沒有不良影響。
4.應用廣泛。適用於各種生化物質，如肽類、激素、蛋白質、多糖、核酸的分離純化、脫鹽、濃縮以及分析測定等。分離的分子量范圍也很寬，如SephadexG類為102～105d；Sepharose類為105～108d。
5.解析度不高，分離操作較慢。由於凝膠層析是以物質分子量的不同作為分離依據的，分子量的差異僅表現在流速的差異上，所以分離時流速必須嚴格把握。因而分離操作一般較慢。而且對於分子量相差不多的物質難以達到很好的分離。此外，凝膠層析要求樣品粘度不宜太高。凝膠顆粒有時還有非特異吸附現象。

❹ 凝膠過濾技術有哪些具體應用

凝膠過濾色譜法：解析度較高，但是上樣量僅為柱體積的1%，而且對流速也有嚴格的限制。內離子交換色譜法：根容據目的蛋白質表面所含有的氨基酸殘基帶有的凈電荷分離蛋白質，但是解析度沒有凝膠過濾高。親和層析法：根據生物分子的特異性分離目的蛋白，特異性很高，但是配件容易丟失適合含有特異性的標簽的或者抗體。疏水色譜：根據疏水性來分離蛋白質,缺點是有的蛋白質在高鹽中溶解度降低，所以應用范圍受到限制，適合蛋白質表面含有較多疏水性氨基酸殘基的疏水性蛋白質。

❺ 凝膠過濾層析的原理是什麼

基本原理：凝膠過濾層析也稱分子篩層析、排阻層析。是利用具有網狀結構的凝膠的分子篩作用，根據被分離物質的分子大小不同來進行分離。

層析柱中的填料是某些惰性的多孔網狀結構物質，多是交聯的聚糖（如葡聚糖或瓊脂糖）類物質，小分子物質能進入其內部，流下時路程較長，而大分子物質卻被排除在外部，下來的路程短，當一混合溶液通過凝膠過濾層析柱時，溶液中的物質就按不同分子量篩分開了。

凝膠層析的特點：

1）凝膠層析操作簡便，所需設備簡單。有時只要有一根層析柱便可進行工作。分離介質——凝膠完全不需要像離子交換劑那樣復雜的再生過程便可重復使用。

2）分離效果較好，重復性高。最突出的是樣品回收率高，接近100%。

3）分離條件緩和。凝膠骨架親水，分離過程又不涉及化學鍵的變化，所以對分離物的活性沒有不良影響。

4）應用廣泛。適用於各種生化物質，如肽類、激素、蛋白質、多糖、核酸的分離純化、脫鹽、濃縮以及分析測定等。分離的分子量范圍也很寬，如Sephadex G類為102-105 D；Sepharose類為105-108 D。

以上內容參考：網路-凝膠過濾層析

❻ 凝膠過濾分離大分子物質的機理是什麼

答案A 用凝膠過濾柱層析分離蛋白質是根據蛋白質分子大小不同進行分離的方法,與蛋白質專分子的帶屬電狀況無關.在進行凝膠過濾柱層析過程中,比凝膠網眼大的分子不能進入網眼內,被排阻在凝膠顆粒之外.比凝膠網眼小的顆粒可以進入網眼內,分子越小進入網眼的機會越多,因此不同大小的分子通過凝膠層析柱時所經的路程距離不同,大分子物質經過的距離短而先被洗出,小分子物質經過的距離長,後被洗脫,從而使蛋白質得到分離.

❼ 凝膠過濾層析和離子交換層析分離蛋白質的原理有何不同

所有的層析在原理上都是相通的,區別在於流動相和層析劑之間的作用力的回不同.
離子交換是利用答蛋白質表面的電荷與層析劑上的離子基團的靜電作用.
凝膠過濾層析利用了凝膠的多孔性,根據溶劑分子的大小進行分離.

❽ 蛋白質分離純化的四種方法

1、鹽析法：

鹽析法的根據是蛋白質在稀鹽溶液中，溶解度會隨鹽濃度的增高而上升，但當鹽濃度增高到一定數值時，使水活度降低，進而導致蛋白質分子表面電荷逐漸被中和，水化膜逐漸被破壞，最終引起蛋白質分子間互相凝聚並從溶液中析出。

2、有機溶劑沉澱法：

有機溶劑能降低蛋白質溶解度的原因有二：其一、與鹽溶液一樣具有脫水作用；其二、有機溶劑的介電常數比水小，導致溶劑的極性減小。

3、蛋白質沉澱劑：

蛋白質沉澱劑僅對一類或一種蛋白質沉澱起作用，常見的有鹼性蛋白質、凝集素和重金屬等。

4、聚乙二醇沉澱作用：

聚乙二醇和右旋糖酐硫酸鈉等水溶性非離子型聚合物可使蛋白質發生沉澱作用。

(8)凝膠過濾技術擴展閱讀：

蛋白質是生命的物質基礎，是有機大分子，是構成細胞的基本有機物，是生命活動的主要承擔者。沒有蛋白質就沒有生命。氨基酸是蛋白質的基本組成單位。它是與生命及與各種形式的生命活動緊密聯系在一起的物質。

機體中的每一個細胞和所有重要組成部分都有蛋白質參與。蛋白質占人體重量的16%~20% ，即一個60kg重的成年人其體內約有蛋白質9.6~12kg。

人體內蛋白質的種類很多，性質、功能各異，但都是由20多種氨基酸（Amino acid）按不同比例組合而成的，並在體內不斷進行代謝與更新。

❾ 蛋白質溶液中的鹽分為何能通過凝膠過濾方法被脫除

使用凝膠過濾介質Sephadex G10，G15，G25，G50等去除小分子，效率高，處理量可達床體積30%。只需在進樣後收集首1/3-1/2柱體積的洗脫液，就可以去除該填料分離范圍上限以下的小分子，簡單直接。由於只是去除小分子，柱高10cm以上即可。整個過程一般可於數分鍾至半小時完成。Sephadex G25系列介質專為蛋白質脫鹽而設計，預裝柱HiTrap Desalting（5ml）可用針筒操作。HiPrep Desalting(26ml)可在數分鍾為多至10ml樣品脫鹽。選擇孔徑很小的凝膠，在過濾時，由於蛋白質分子半徑較大，所以不能進入凝膠的孔隙，很容易被洗脫，而粒子則被孔隙所吸附，較難洗脫，所以先出來的是蛋白質

❿ 在操作方面，凝膠過濾與離子交換層析有何異同處

在原理上都是相通的，區別在於流動相和層析劑之間的作用力的不同。
凝膠過濾又名分子篩層析，利用微孔凝膠，將不同分子量的成分分離。
離子交換是利用被分離物質的電荷與層析劑上的離子基團的靜電作用。