離子交換層析緩沖液最適ph

㈠ 如何選擇離子交換層析的離子交換劑和緩沖液

離子交換層析是根據蛋白質所帶電荷的差異進行分離純化的一種方法。
蛋白質的帶電性是由蛋白質多肽中帶電氨基酸決定的。
由於蛋白質中氨基酸的電性又取決於介質中的pH，所以蛋白質的帶電性也就依賴於介質的pH。

㈡ 離子交換層析法原理是什麼

離子交換層析法 （ion exchange chromatography，簡稱IEC）是從復雜的混合物中，分離性質相似大分子的方法之一，依據的原理是物質的酸鹼性、極性，也就是所帶陰陽離子的不同。電荷不同的物質，對管柱上的離子交換劑有不同的親和力，改變沖洗液的離子強度和pH值，物質就能依次從層析柱中分離出來。
離子交換層析法大致分為5個步驟：
1. 離子擴散到樹脂表面。
2. 離子通過樹脂擴散到交換位置。
3. 在交換位置進行離子交換；被交換的分子所帶電荷愈多，它與樹脂的結合愈緊密，也就愈不容易被其它離子取代。
4. 被交換的離子擴散到樹脂表面。
5. 沖洗液通過，被交換的離子擴散到外部溶液中。
離子交換樹脂的交換反應是可逆的，遵循化學平衡的規律，定量的混合物通過管柱時，離子不斷被交換，濃度逐漸降低，幾乎全部都能被吸附在樹脂上；在沖洗的過程中，由於連續添加新的交換溶液，所以會朝正反應方向移動，因而可以把樹脂上的離子沖洗下來。
如果被純化的物質是氨基酸類的分子，則分子上的凈電荷取決於氨基酸的等電點和溶液的pH值，所以當溶液的pH 值較低，氨基酸分子帶正電荷，它將結合到強酸性的陽離子交換樹脂上；隨著通過的緩沖液pH逐漸增加，氨基酸將逐漸失去正電荷，結合力減弱，最後被洗下來。由於不同的氨基酸等電點不同，這些氨基酸將依次被洗出，最先被洗出的是酸性氨基酸，如apartic acid和glutamic acid（在約pH3~4時），隨後是中性氨基酸，如glycine和alanine。鹼性氨基酸如arginine和lysine在pH值很高的緩沖液中仍帶有正電荷，因此這些在約pH值高達10~11時才出現。

㈢ 將四種核苷酸吸附於陰離子交換柱上時，應將溶液調到什麼 ph

① 電泳分離4種核苷酸時應取pH3.5 的緩沖液，在該pH時，這4種單核苷酸之間所帶負電荷版差異較大權，它們都向正極移動，但移動的速度不同，依次為：UMP>GMP>AMP>CMP；
② 應取pH8.0，這樣可使核苷酸帶較多負電荷，利於吸附於陰離子交換樹脂柱。雖然pH 11.4時核苷酸帶有更多的負電荷，但pH過高對分離不利。
③ 當不考慮樹脂的非極性吸附時，根據核苷酸負電荷的多少來決定洗脫速度，則洗脫順序為CMP>AMP> GMP > UMP，但實際上核苷酸和聚苯乙烯陰離子交換樹脂之間存在著非極性吸附，嘌呤鹼基的非極性吸附是嘧啶鹼基的3倍。靜電吸附與非極性吸附共同作用的結果使洗脫順序為：CMP> AMP > UMP >GMP。

㈣ 蛋白質復性時的ph是指室溫ph還是冷藏後的ph

蛋白質的復性

蛋白質復性的最大問題，是在復性過程中形成中間體和多聚體，中間體阻礙作用大的使蛋白質正確折疊困難，復性就困難；阻礙小或無阻礙的容易復性。降低蛋白濃度可以減少中間體形成提高復性率。減少中間體的形成，可選用添加小分子物質，又叫分子伴侶，如精氨酸、甘油、PEG等小分子物質幫助蛋白質正確折疊。避免多聚體的形成入氧化還原劑（DTT、szlig;－ME、還原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、Cu2＋等），幫助蛋白質復性中二硫鍵的正確配對，減少錯配率。

復性緩沖液的pH要遠離等電點，離子強度不易過高，10－50mmol/L，離子強度太高蛋白質易發生沉澱，也不利於離子交換層析的分離；復性液溫度不易過高在4℃－10℃較合適對於耐熱蛋白也可以室溫復性。復性時間，以天然表達的重組蛋白復性應在6hr以上，需要進行酶切的融和表達重組蛋白，至少要復性1hr以上，方可進行進一步的酶切。

復性方式：常用的有透析復性和稀釋復性。透析復性適用於小樣品制備；對於大樣品制備，採用稀釋復性法簡便、實用。一般包含體蛋白的復性濃度不易過大，不同的蛋白質有所區別，一般掌握在100－200ug/ml較合適，蛋白濃度太稀使純化流程過長，蛋白濃度太濃，蛋白質復性不完全，會直接影響蛋白的回收率。直接稀釋有困難的，也可以試用分段稀釋法。

蛋白質的復性是重組蛋白純化中最關鍵和最復雜的問題。蛋白質的性質不同，所處的環境不同，使其復性條件大不相同。任何一個蛋白質都有一個最佳的復性條件，這個最佳條件的選擇是靠大量的實驗來完成的。只有選擇到了合適的復性緩沖液，使蛋白得以正確折疊，才能使進一步的層析分離得以順利完成。

㈤ 離子交換層析的具體操作

對於離子交換纖維素要用流水洗去少量碎的不易沉澱的顆粒，以保證有較好的均勻度，對於已溶脹好的產品則不必經這一步驟。溶脹的交換劑使用前要用稀酸或稀鹼處理，使之成為帶H+或OH-的交換劑型。陰離子交換劑常用「鹼-酸-鹼」處理，使最終轉為-OH-型或鹽型交換劑；對於陽離子交換劑則用「酸-鹼-酸」處理，使最終轉為-H-型交換劑。
洗滌好的纖維素使用前必須平衡至所需的pH和離子強度。已平衡的交換劑在裝柱前還要減壓除氣泡。為了避免顆粒大小不等的交換劑在自然沉降時分層，要適當加壓裝柱，同時使柱床壓緊，減少死體積，有利於解析度的提高。
柱子裝好後再用起始緩沖液淋洗，直至達到充分平衡方可使用。 加樣：
層析所用的樣品應與起始緩沖液有相同的pH和離子強度，所選定的pH值應落在交換劑與被結合物有相反電荷的范圍，同時要注意離子強度應低，可用透析、凝膠過濾或稀釋法達此目的。樣品中的不溶物應在透析後或凝膠過濾前，以離心法除去。為了達到滿意的分離效果，上樣量要適當，不要超過柱的負荷能力。柱的負荷能力可用交換容量來推算，通常上樣量為交換劑交換總量的1%-5%。 已結合樣品的離子交換前，可通過改變溶液的pH或改變離子強度的方法將結合物洗脫，也可同時改變pH與離子強度。為了使復雜的組份分離完全，往往需要逐步改變pH或離子強度，其中最簡單的方法是階段洗脫法，即分次將不同pH與離子強度的溶液加入，使不同成分逐步洗脫。由於這種洗脫pH與離子強度的變化大，使許多洗脫體積相近的成分同時洗脫，純度較差，不適宜精細的分離。最好的洗脫方法是連續梯度洗脫，洗脫裝置見圖16-6.兩個容器放於同一水平上，第一個容器盛有一定pH的緩沖液，第二個容器含有高鹽濃度或不同pH的緩沖液，兩容器連通，第一個容器與柱相連，當溶液由第一容器流入柱時，第二容器中的溶液就會自動來補充，經攪拌與第一容器的溶液相混合，這樣流入柱中的緩沖液的洗脫能力即成梯度變化。第一容器中任何時間的濃度都可用下式進行計算：
C=C2-(C2-C1)(1-V)A2/A1
式中A1、A2分別代表兩容器的截面積：C1、C2分別表示容器中溶液的濃度；V為流出體積對總體積之比。當A1=A2時為線性梯度，當A1>A2時為凹形梯度，A1>A2時為凸形梯度。
洗脫時應滿足以下要求：
①洗脫液體積應足夠大，一般要幾十倍於床體積，從而使分離的各峰不至於太擁擠。
②梯度的上限要足夠高，使緊密吸附的物質能被洗脫下來。
③梯度不要上升太快，要恰好使移動的區帶在快到柱末端時達到解吸狀態。目的物的過早解吸，會引起區帶擴散；而目的物的過晚解吸會使峰形過寬。
洗脫餾份的分析按一定體積（5-10ml/管）收集的洗脫液可逐管進行測定，得到層析圖譜。依實驗目的的不同，可採用適宜的檢測方法（生物活性測定、免疫學測定等）確定圖譜中目的物的位置，並回收目的物。
離子交換劑的再生與保存離子交換劑可在柱上再生。如離子交換纖維素可用2mol/：NaCl淋洗柱，若有強吸附物則可用0.1mol/LNaOH洗柱；若有脂溶性物質則可用非離子型去污劑洗柱後再生，也可用乙醇洗滌，其順序為：0.5mol/LNaOH-水-乙醇-水-20%NaOH-水。保存離子交換劑時要加防腐劑。對陰離子交換劑宜用0.002%氯已定（洗必泰），陽離子交換劑可用乙基硫柳汞（0.005%）。有些產品建議用0.02%疊氮鈉。

㈥ 建立離子交換法純化蛋白質的方法需要摸索哪些條件

1. pH值，緩沖液的pH值對於蛋白結合離子交換層析有非常大的影響，需要先摸索出合適的版pH值，既能權保證蛋白結合上離子交換層析，又不會出現不穩定沉澱的情況。

2. 鹽濃度，鹽濃度是離子交換層析洗脫的關鍵，需要摸索出蛋白能在什麼樣的鹽濃度下被洗脫，且洗脫後純度能夠達到最初的要求。

3. 柱體積，盡管各種離子交換層析均有理論結合蛋白量，但各種蛋白情況不一樣，需要摸索出能夠完全結合目的蛋白合適的柱體積。既不會太大造成洗脫濃度過稀，也不會太小造成目標蛋白過載。

4. 溫度，溫度可能會造成蛋白變性等等。

㈦ 電泳分離四種核苷酸時，通常將緩沖液調到什麼ph

①
電泳分離4種核苷酸時應取pH3.5
的緩沖液，在該pH時，這4種單核苷酸之間所帶負電荷差異較大，它們都向正極移動，但移動的速度不同，依次為：UMP>GMP>AMP>CMP；
②
應取pH8.0，這樣可使核苷酸帶較多負電荷，利於吸附於陰離子交換樹脂柱。雖然pH
11.4時核苷酸帶有更多的負電荷，但pH過高對分離不利。
③
當不考慮樹脂的非極性吸附時，根據核苷酸負電荷的多少來決定洗脫速度，則洗脫順序為CMP>AMP>
GMP
>
UMP，但實際上核苷酸和聚苯乙烯陰離子交換樹脂之間存在著非極性吸附，嘌呤鹼基的非極性吸附是嘧啶鹼基的3倍。靜電吸附與非極性吸附共同作用的結果使洗脫順序為：CMP>
AMP
>
UMP
>GMP。

㈧ 過離子交換柱時，pH梯度洗脫緩沖液一般用什麼緩沖液

如果不限定純化方法，可以考慮親和層析或離子交換，但根據你問題的意思，是選定離子交內換。
此時就容要考慮你蛋白的等電點了，如果等電點在你穩定pH之上，就用陽離子交換柱：
設計陽離子交換層析：將你的樣品置換到你所指的穩定pH的running buffer。同時裝柱，平衡，然後上樣，平衡，洗脫（因為你的pH不穩定，建議鹽洗脫），收峰。得你的蛋白；
如果你的等電點在穩定pH之下，就用陰離子交換柱，其步驟如上，只是改變柱子類型。

㈨ 如果一個蛋白質只是在PH6-6.5范圍內穩定，請設計一個通過離子交換層析純化該蛋白質的實驗

你是不是說混淆了，到底是等電點在pH6-6.5？還是等電點未知，確在6-6.5穩定？
我就先按等電點來理解，回答你的問題。
如果對蛋白純化的濃度要求不高，或者待純化樣品成分簡單，雜蛋白少，就選一種離子交換層析，即陽離子離子交換層析（running buffer 設pH5.0比較合適）或陰離子交換層析（running buffer 設pH7.5比較合適）。
如果雜蛋白多，就用兩步離子交換層析，即結合陰陽離子交換層析。一般建議先做陽離子交換層析（這樣第一步可去掉核酸之類的）。不知你要多具體的步驟，先寫個大致步驟吧：
1，陽離子交換層析：將你的樣品置換到pH5.0的running buffer（一般醋酸鈉buffer）。同時裝住，平衡啥的，然後上樣，平衡，洗脫（升pH或鹽洗脫），收峰。這步就去掉等電點在6之下的大部分雜蛋白；
2，陰離子交換層析：將所收蛋白置換buffer至pH7.5的running buffer（PB），同時裝住，平衡啥的，然後上樣，平衡，洗脫（降pH或鹽洗脫），收峰。去掉pH6.5之上的大部分雜蛋白。
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如果你確實所指在6-6.5穩定，那就看你蛋白的等電點在多少了，只好選一種離子交換層析，在6.5之上就試試pH6.0的running buffer做陽離子交換層析，在6.0之下，就試試pH6.5的running buffer做陰離子交換層析。
若有疑問，歡迎繼續討論，純屬手打，歡迎採納，祝新年愉快！

㈩ 用離子交換法純化蛋白如何選定緩沖液

也可以用AEC，主要以流穿模式做。sspxiaoji(站內聯系TA)用陽離子交換柱，可以考慮pH6.0-7.0的緩沖液，因內為容大部分蛋白質的等電點在這附近，帶電荷少，這樣容易穿透除去其他雜蛋白。而你的目的蛋白PI在11，掛柱應該比較牢固。但是有個問題需要注意，PH離你的目標蛋白PI太遠，有可能導致掛柱後難以洗脫。