deae陰離子交換層析法

A. DEAE 層析原理是什麼

給你找了以前的文章，你可以看一下。如下。。
層析技術是以離子交換纖維素或以離子交換葡聚糖凝膠為固定相，以蛋白質等樣品為移動相，分離和提純蛋白質、核酸、酶、激素、多糖等的一項技術。
在纖維素與葡聚糖分子上結合有一定的離子基團，當結合陽離子基團時，可換出陰離子，則稱為陰離子交換劑。如二乙氨乙基(Dicthylaminoethyl，DEAE)纖維素。在纖維素上結合了DEAE，含有帶正電荷的陽離子纖維素—O—C6 H14N+H，它的反離子為陰離子(如Cl-等)，可與帶負電荷的蛋白質陰離子進行交換。當結合陰離子基團時，可置換陽離子，稱為陽離子交換劑，如羧甲基(Carboxymethy， CM)纖維素。纖維素分子上帶有負電荷的陰離子(纖維素－O－CH2－COO一)，其反離子為陽離子(如Na+等),可與帶正電荷蛋白質陽離子進行交換。
溶液的pH值與蛋白質等電點相同時，靜電荷為0，當溶液pH值大於蛋白質等電點時，則羧基游離，蛋白質帶負電荷。反之，溶液的pH值小於蛋白質等電點時，則氨基電離，蛋白質帶正電荷。溶液的pH值距蛋白質等電點越遠，蛋白質的電荷越多。反之則越少。血清蛋白質均帶負電荷，但各種蛋白質帶負電荷的程度有所差異，以白蛋白為最多，依次為 球蛋白， 球蛋白和 球蛋白。
在適當的鹽濃度下，溶液的pH值高於等電點時，蛋白質被陰離子交換劑所吸附；當溶液的pH值低於等電點時，蛋白質被陽離子交換劑所吸附。由於各種蛋白質所帶的電荷不同。它們與交換劑的結合程度也不同，只要溶液pH值發生改變，就會直接影響到蛋白質與交換劑的吸附，從而可能把不同的蛋白質逐個分離開來。
交換劑對膠體離子(如蛋白質)和無機鹽離子(如NaCl)都具有交換吸附的能力，當兩者同時存在於一個層析過程中，則產生競爭性的交換吸附。當Cl一的濃度大時，蛋白質不容易被吸附，吸附後也易於被洗脫，當Cl一濃度小時，蛋白質易被吸附，吸附後也不容易被洗脫。因此，在離子交換層析中，一般採用兩種方法達到分離蛋白質的目的。一種是增加洗脫液的離子強度，一種是改變洗脫液的pH值。pH值增高時，抑制蛋白質陽離子化，隨之對陽離子交換劑的吸附力減弱。pH值降低時，抑制蛋白質陰離子化，隨之降低了蛋白質對陰離子交換劑的吸附。當使用陰離子交換劑時，增加鹽離子，則降低pH值。當使用陽離子交換劑時，增加鹽離子濃度，則升高溶液pH值。

B. 有誰用過deae-sephacel層析

deae-sephacel就是DEAE纖維素
和DEAE-Sepharose及DEAE-Sephacryl差不多
是弱的陰離子交換介質
參照一般的陰離子交換介質用法就可以了

C. 離子交換層析法原理是什麼

是以離子交換劑為固定相，依據流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時的結合力大小的差別，而進行分離的一種層析方法

D. 求分離，純化,鑒定γ球蛋白的具體方法（包括原理，步驟，預期結果，注意事項）謝謝

[原理]

血清中蛋白質按電泳法一般可分為五類：清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白，其中γ-球蛋白含量約佔16％，100ml血清中約含1.2g左右。

首先利用清蛋白和球蛋白在高濃度中性鹽溶液中(常用硫酸銨)溶解度的差異而進行沉澱分離，此為鹽析法。半飽和硫酸銨溶液可使球蛋白沉澱析出，清蛋白則仍溶解在溶液中，經離心分離,沉澱部分即為含有γ-球蛋白的粗製品。

用鹽析法分離而得的蛋白質中含有大量的中性鹽，會妨礙蛋白質進一步純化，因此首先必須去除。常用的方法有透析法、凝膠層析法等。本實驗採用凝膠層析法，其目的是利用蛋白質與無機鹽類之間分子量的差異。當溶液通過SephadexG--25凝膠柱時，溶液中分子直徑大的蛋白質不能進入凝膠顆粒的網孔，而分子直徑小的無機鹽能進入凝膠顆粒的網孔之中．因此在洗脫過程中，小分子的鹽會被阻滯而後洗脫出來，從而可達到去鹽的目的。

脫鹽後的蛋白質溶液尚含有各種球蛋白，利用它們等電點的不同可進行分離。α－球蛋白、β-球蛋白的PI<6.0；γ－球蛋白的PI為7.2左右。因此在PH6.3的緩沖溶液中，各類球蛋白所帶電荷不同。經DEAE(二乙基氨基乙基)纖維素陰離子交換層析柱進行層析時，帶負電荷的α－球蛋白和β-球蛋白能與DEAE纖維素進行陰離子交換而被結合；帶正電荷的γ－球蛋白則不能與DEAE纖維素進行交換結合而直接從層析柱流出。因此隨洗脫液流出的只有γ－球蛋白，從而使γ－球蛋白粗製品被純化。其反應式如下：

用上述方法分離得到γ－球蛋白是否純凈，單一？可將純化前後的γ－球蛋白進行電泳比較而鑒定之。

[操作]

(1)鹽析――中性鹽沉澱：取正常人血清2.0ml於小試管中，加0.9％氯化鈉溶液2.0ml，邊攪拌混勻邊緩慢滴加飽和硫酸銨溶液乙4.0ml，混勻後於室溫中放置10min，3000r／min離心10min。小心傾去含有清蛋白的上清液，重復洗滌一次，於沉澱中加入0.0175mol／L磷酸鹽緩沖液(pH6.3)0.5～1.Oml使之溶解。此液即為粗提的γ－球蛋白溶液。

(2)脫鹽――凝膠柱層析

①裝柱

洗凈的層析柱保持垂直位置，關閉出口，柱內留下約2.0ml洗脫液。一次性將疑膠從塑料介面加入層析柱內，打開柱底部出口，調節流速0.3ml/min。凝腔隨柱內溶液慢慢流下而均勻沉降到層析柱底部，最後使凝膠床達20厘米高，床面上保持有洗脫液，操作過程中注意不能讓凝膠床表面露出液面並防止層析床內出現「紋路」。在凝膠表面可蓋一園形濾紙，以免加入液體時沖起膠粒。

②上樣與洗脫：可以在凝膠表面上加圓形尼龍濾布或濾紙使表面平整，小心控制凝膠柱下端活塞，使柱上的緩沖液面剛好下降至凝膠床表面，關緊下端出口，用長滴管吸取鹽析球蛋白溶液，小心緩慢加到凝膠床表面。打開下端出口，將流速控制在0.25ml/min使樣品進入凝膠床內。關閉出口，小心加入少量0.0175mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.3)洗柱內壁。打開下端出口，待緩沖液進入凝膠床後再加少量緩沖液。如此重復三次，以洗凈內壁上的樣品溶液。然後可加入適量緩沖液開始洗脫。

加樣開始應立即收集洗脫液。洗脫時接通蠕動泵，流速為0.5ml/min,用部分收集器收集，每管1ml。

③洗脫液中NH4+與蛋白質的檢查：取比色板兩個(其中一個為黑色背底)，按洗脫液的順序每管取一滴，分別滴入比色板中，前者加20％磺基水楊酸溶液2滴，出現白色混濁或沉澱即示有蛋白質析出，由此可估計蛋白質在洗脫各管中的分布及濃度；於另一比色板中，加人奈氏試劑應用液l滴，以觀察NH4+出現的情況。

合並球蛋白含量高的各管，混勻。除留少量作電泳鑒定外，其餘用DEAE纖維素陰離子交換柱進一步純化。

(3)純化――DEAE纖維素陰離子交換層析：用DEAE纖維素裝柱約8-10cm高度，並用0.0175mol／L磷酸鹽緩沖液(pH6.3)平衡，然後將脫鹽後的球蛋白溶液緩慢加於DEAE纖維素陰離子交換柱上，用同一緩沖液洗脫、分管收集。用20％磺基水楊酸溶液檢查蛋白質分布情況。(裝柱、上樣、洗脫，收集及蛋白質檢查等操作步驟同凝膠層析)。

(4)濃縮――經DEAE纖維素陰離於交換柱純化的γ－球蛋白液往往濃度較低。為便於鑒定，常需濃縮。收集較濃的純化的γ－球蛋白溶液2m1，按每ml加0.2～ 0.25gSephadex G一25干膠，搖動2～3min， 3000r／min 離心5min。上清液即為濃縮的γ-球蛋白溶液。

(5)鑒定――乙酸纖維素薄膜電泳 取乙酸纖維素薄膜2條，分別將血清、脫鹽後的球蛋白、DEAE纖維素陰離子交換柱純化的γ-球蛋白液等樣品點上。然後參閱實驗二十四：乙酸纖維薄膜電泳法進行電泳分離、染色。比較電泳結果。

[注意事項]

(1)凝膠及DEAE纖維處理期間，必須小心用傾瀉法除去細小顆粒。這樣可使凝膠及纖維素顆粒大小均勻，流速穩定，分離效果好。

(2)裝柱是層析操作中最重要的一步。為使柱床裝得均勻，務必做到凝膠懸液或DEAE纖維素混懸液不稀不厚，一般濃度為l：l，進樣及洗脫時切勿使床面暴露在空氣中，不然柱床會出現氣泡或分層現象；加樣時必須均勻，切勿攪動床面，否則均會影響分離效果。

(3)本法是利用γ-球蛋白的等電點與α-、β-球蛋白不同，用離子交換層析法進行分離的。因此層析過程中用的緩沖液pH要求精確。

(4)電泳注意事項見實驗二十四。

(5)凝膠貯存：凝膠使用後如短期不用，為防止凝膠發霉可加防腐劑如0.02％疊氮鈉。保存於4℃冰箱內。若長期不用，應脫水乾燥保存。脫水方法：將膨脹凝膠用水洗凈。用多孔漏斗抽干後，逐次更換由稀到濃的乙醇溶液浸泡若干時間，最後一次用95％乙醇溶液浸泡脫水，然後用多孔漏斗抽干後，於60～80℃烘乾貯存。

(6)離子交換劑的再生和保存；離子交換劑的價格較貴，每次用後只需再生處理便能反復使用多次。處理方法是：交替用酸、鹼處理，最後用水洗至接近中性。陽離子交換劑最後為Na型，陰離子以Cl型是最穩定型，故陰離子交換劑處理順序為鹼一水一酸一水。由於上述交換劑都是糖鏈結構。容易水解破壞，因此須避免強酸、強鹼長時間浸泡和高溫處理，一般纖維素浸泡時間為3-4h。

離子交換劑容易長霉引起變質，不用時，需洗滌干凈，加防腐劑置冰箱內保存。常用0.02％疊氮鈉防腐。疊氮鈉遇酸放出有毒氣體，也是劇毒與易爆的危險品。使用時要加倍小心。

除用凝膠層析法去除無機鹽類外，最常用的去鹽法就是透析。細的透析袋效率高，所需時間短。將透析袋一端折疊，用橡皮筋結扎，試驗是否逸漏，然後倒入待透析的蛋白質溶液。勿裝太滿，將袋的上端也結紮好，即可進行透析。開始可用流動的自來水，待大部分鹽被透析出後，再改為生理鹽水、緩沖液或蒸餾水。透析最好在較低的溫度下，並在磁力攪拌器上進行。此法簡單，易操作，儀器及試劑要求不高，但不如凝膠層析法效率高。

濃縮γ-球蛋白粗提液除上述方法外還可用透析袋濃縮。將待濃縮的蛋白質溶液放入較細的透析袋中，置入搪瓷盤內。透析袋周圍可撒上聚乙二醇6000(PEG6000)，或聚乙烯吡咯酮，或蔗糖。以上物質在使用後(吸了大量水)都可以通過加溫及吹風而回收；將裝有蛋白質溶液的透析袋懸掛起來，用電風扇高速吹風(10℃以下)，也可達到濃縮目的，以上兩法雖不如 SephadexG一25干膠快，但價格較便宜，方法也不煩瑣。

[試劑]

(1)飽和硫酸銨溶液：稱固體硫酸銨(分析純)850g，置於1000ml蒸餾水中，在70一80℃水溫中攪拌溶解。將酸度調節至pH7.2，室溫中放置過夜，瓶底析出白色結晶，上清液即為飽和硫酸銨溶液。

(2)葡聚糖凝膠G一25的處理：按每100ml凝膠床體積需要葡聚糖凝膠G一25干膠 25g。稱取所需量置於錐形瓶中。每克干膠加入蒸餾水約30ml，用玻璃棒輕輕混勻，置於90～100℃水溫中時時攪動，使氣泡逸出。1h後取出，稍靜置，傾去上清液細粒。也可於室溫中浸泡24h，攪拌後稍靜置，傾去上清液細粒，用蒸餾水洗滌2～3次，然後加0.017mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.3)平衡，備用。

(3)DEAE一32(二乙基氨基乙基一32)纖維素的處理：按100ml柱床體積需DEAE纖維素14g稱取，每克加0.5mol／L鹽酸溶液15ml，攪拌。放置30min(鹽酸處理時間不可太長，否則DEAE纖維素變質)。加約l0倍量的蒸餾水攪拌，放置片刻，待纖維素下沉後，傾棄含細微懸浮物的上層液。如此反復數次。靜置30min，虹吸去除上清液(也可用布氏漏斗抽干)，直至上清液pH>4為止。加等體積lmol/L氫氧化鈉溶液，使最終濃度約為0.5mol/L氫氧化鈉，攪拌後放置30min，以虹吸除去上層液體。同上用蒸餾水反復洗至pH<7為止。虹吸去除上層液體，然後加入0.0175mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.3)平衡，備用。

(4)0.0175mol／L磷酸鹽緩沖液(pH6.3)

A液：稱取磷酸二氫鈉(NaH2PO4.2H20)2.730g溶於蒸餾水中，加蒸餾水稀釋至1000ml。

B液：稱取磷酸氫二鈉(Na2HPO4.12H20)6.269g，溶於蒸餾水中，加蒸餾水稀釋至 1000mL。

取A液77.5ml，加於B液22.5ml，混勻後即成。

(5)20%磺基水楊酸溶液

(6)奈氏(Nessler)試劑應用液

①貯存液；稱取碘化鉀(KI)7.58於250ml三角燒瓶中，用蒸餾水5ml溶解，再加入碘（I2） 5.5g溶解，加7～7.5gHg用力振搖10min(此時產生高熱，須冷卻)，直至棕紅色的碘轉變成帶綠色的碘化汞鉀液為止，過濾上清液傾入100ml容量瓶，洗滌沉澱，洗滌液一並倒入容量瓶內，用蒸餾水稀釋至100ml。

②應用液：取貯存液75ml加10％NaOH 350ml，加水至500mL。

(7)0.9％氯化鈉溶液

(8)乙酸纖維素薄膜電泳有關試劑(見實驗二十四)

(四)親和層析

生物體中許多高分子化合物之間具有專—性可逆結合的特徵，例如：酶蛋白和輔酶，抗原和抗體，激素與受體，核糖核酸與互補的脫氧核糖核酸等。生物分子間的這種專一性結合能力稱為親和力，根據生物分子間親和力大小產生吸附和解吸作用而建立的層析方法稱為親和層析。

親和層析的基本過程如下：具有親和力的一對分子，其中一種分子作為配基，固定化結合在不溶性載體上裝入層析柱成親和柱，當含有另—種分子的混合液作為流動相流入親和柱時，能與配基親和結合的分子被吸附，其它雜質直接流出，再改變流動相的溶液，使配基與其親和物解離從而解吸出待分離的分子來。

親和層析中最常用的具有親和力的生物體系有：

酶：底物、抑制劑、輔酶

抗體：抗原、病毒、細胞

外源凝集素：受體、載體蛋白

細胞：細胞表面特異蛋白，外源性凝集素

E. 請問羧甲基纖維素和DEAE纖維素分離蛋白有什麼區別

羧甲基纖維素是弱陽離子交換填料，要求使用時的pH值要低於目的蛋白質等電點起碼0.5個pH值單位，為了達到較好的分離效果，實際使用時最好是低於1個以上pH值單位。在低pH值下，有的不耐酸的雜質蛋白質會變性，屆時離心除去，可首先去除一部分雜質蛋白質。
DEAE纖維素是弱陰離子交換層析填料，要求使用時的pH值要高於目的蛋白質等電點起碼0.5個pH值單位，為了達到較好的分離效果，實際使用時最好是高於1個以上pH值單位。大多數蛋白質的等電點在6.0左右，可以耐受8.0，所以依據pH提高使得某些雜質蛋白質變性的做法多數情況下不可行。
這兩種填料的工作pH值不同，但都可以用氯化鈉來洗脫。交換基團不同，分離效果也不同，可以先用一種來純化，得到初步純化的產物之後再用另一種來純化。因為有些蛋白質不能耐受酸，所以我建議先用羧甲基纖維素弱陰離子交換層析，再用DEAE纖維素弱陽離子交換層析，產物的純度比單用一種時更高。
在對蛋白質的破壞方面，弱交換填料比強交換填料好，有的蛋白質用強離子交換來純化，蛋白質結合再交換之後會損失很多活力，但是弱離子交換則損失的活力較少。但是弱離子交換的解析度比強離子交換差一些。如果純化得不好，又有強離子交換的，就試一下吧。lxj341401(站內聯系TA)一個是陽離子交換填料，一個是陰離子交換填料，用哪個跟蛋白值的等電點pI還有所用緩沖液的pH有關，pH>pI時帶負電荷，蛋白質能吸附到陰離子交換填料，相反的用陽離子交換。所以能不能代替看具體情況了。悅迷008(站內聯系TA)Originally posted by 冼亮澱粉酶 at 2011-07-15 06:00:21:
這兩個填料雖然都是離子交換用的，但一個是弱陰一個是弱陽，效果不同，沒有一個能代替另一個的說法。

F. 用過的sephadex G-25層析柱和DEAE纖維素離子交換柱再生的方法為什麼不一樣

飛秒檢測發現sephadex G-25層析柱填料是葡聚糖交聯的凝膠柱，G-X, X：（1）交聯度。X越小，交聯度越大，網孔越小，適用於分離低分子量產品，反之亦然。（2）吸水量。為凝膠得水值的10倍.例如,G-25為每克凝膠膨脹時吸水2.5克.凝膠柱使用一次後，必須反沖疏鬆一次，平衡後再使用。若使用數次，就需要再生處理。用0.1mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl溶液浸泡，然後用蒸餾水洗至中性備用。若實驗完畢，將再生後的凝膠在布氏漏鬥上用蒸餾水洗滌抽干，再用95%乙醇洗兩次，在60℃烘箱中烘乾，回收保存。
DEAE-纖維素為二乙氨乙基纖維素，是陰離子交換劑。基質是由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。離子交換層析中，基質是由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。帶有正電荷的稱之陰離子交換樹脂；而帶有負電荷的稱之陽離子樹脂。離子交換層析同樣可以用於蛋白質的分離純化。由於蛋白質也有等電點，當蛋白質處於不同的pH條件下，其帶電狀況也不同。陰離子交換基質結合帶有負電荷的蛋白質，所以這類蛋白質被留在柱子上，然後通過提高洗脫液中的鹽濃度等措施，將吸附在柱子上的蛋白質洗脫下來。結合較弱的蛋白質首先被洗脫下來。反之陽離子交換基質結合帶有正電荷的蛋白質，結合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來。離子交換劑的再生與保存離子交換劑可在柱上再生。如離子交換纖維素可用2mol/：NaCl淋洗柱，若有強吸附物則可用0.1mol/LNaOH洗柱；若有脂溶性物質則可用非離子型去污劑洗柱後再生，也可用乙醇洗滌，其順序為：0.5mol/LNaOH-水-乙醇-水-20%NaOH-水。保存離子交換劑時要加防腐劑。對陰離子交換劑宜用0.002%氯已定（洗必泰），陽離子交換劑可用乙基硫柳汞（0.005%）。有些產品建議用0.02%疊氮鈉。
兩種填料的抗酸鹼性和抗腐蝕性能不同。

G. 離子交換層析的原理是什麼 已解決

離子交換層析法是從復雜的混合物中，分離性質相似大分子的方法之一，依據的原理是物內質的酸鹼性容，極性，所帶陰陽離子的不同。電荷不同的物質，對管柱上的離子交換劑有不同的親和力，改變沖洗液的離子強度和pH值，物質就能依次從層析柱中分離出來。

層析開始前，功能基團與反離子穩定結合，就與反離子發生可逆交換，與層析劑結合被固定下來。因為鹽離子可以與底物競爭功能基團，鹽濃度越高樣品與層析劑結合越不緊密，易被洗脫下來。不同物質與層析劑結合程度不同，洗脫下來的時間不同，因此得以分開。

(7)deae陰離子交換層析法擴展閱讀

離子交換劑的選擇首重保持欲分離物質的生物活性，以及在不同pH值環境中，此物質所帶的電荷和電性強弱，陰陽離子交換劑的選擇若被分離物質帶正電荷，這些鹼性蛋白質，它們在酸性溶液中較穩定，親和力強，故採用陽離子交換劑。

在鹼性溶液中較穩定，則使用陰離子交換劑，如果欲分離的物質是兩性離子，一般考慮在它穩定的pH范圍帶有何種電荷，作為交換劑的選擇。離子交換劑的再生與保存離子交換劑可在柱上再生，若有脂溶性物質則可用非離子型去污劑洗柱後再生，也可用乙醇洗滌。

H. DEAE CL-6B 陰離子交換層析柱分離 β葡萄糖苷酶,酶一直洗脫不下來怎麼辦.提高ph有用嗎

可以考慮上升洗脫液離子強度，但保證蛋白質不變性
另外讓目標蛋白與介質結合的力度小一些; 改變環境的酸鹼度，更換介質，更換緩沖液等

I. 蛋白質的分離方法有哪些它們各依據蛋白質的什麼性質或特點

（一）水溶液提取法

稀鹽和緩沖系統的水溶液對蛋白質穩定性好、溶解度大、是提取蛋白質最常用的溶劑，通常用量是原材料體積的1-5倍，提取時需要均勻的攪拌，以利於蛋白質的溶解。提取的溫度要視有效成份性質而定。一方面，多數蛋白質的溶解度隨著溫度的升高而增大，因此，溫度高利於溶解，縮短提取時間。但另一方面，溫度升高會使蛋白質變性失活，因此，基於這一點考慮提取蛋白質和酶時一般採用低溫（5度以下）操作。為了避免蛋白質提以過程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制劑（如二異丙基氟磷酸，碘乙酸等）。
下面著重討論提取液的pH值和鹽濃度的選擇。
1、pH值
蛋白質，酶是具有等電點的兩性電解質，提取液的pH值應選擇在偏離等電點兩側的pH
范圍內。用稀酸或稀鹼提取時，應防止過酸或過鹼而引起蛋白質可解離基團發生變化，從而導致蛋白質構象的不可逆變化，一般來說，鹼性蛋白質用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白質用偏鹼性的提取液。
2、鹽濃度
稀濃度可促進蛋白質的溶，稱為鹽溶作用。同時稀鹽溶液因鹽離子與蛋白質部分結合，具有保護蛋白質不易變性的優點，因此在提取液中加入少量NaCl等中性鹽，一般以0.15摩爾。升濃度為宜。緩沖液常採用0.02-0.05M磷酸鹽和碳酸鹽等滲鹽溶液。
（二）有機溶劑提取法
一些和脂質結合比較牢固或分子中非極性側鏈較多的蛋白質和酶，不溶於水、稀鹽溶液、稀酸或稀鹼中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑，它們具的一定的親水性，還有較強的親脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必須在低溫下操作。丁醇提取法對提取一些與脂質結合緊密的蛋白質和酶特別優越，一是因為丁醇親脂性強，特別是溶解磷脂的能力強；二是丁醇兼具親水性，在溶解度范圍內（度為10%，40度為6.6%）不會引起酶的變性失活。另外，丁醇提取法的pH及溫度選擇范圍較廣，也適用於動植物及微生物材料。
二、蛋白質的分離純化
蛋白質的分離純化方法很多，主要有：
（一）根據蛋白質溶解度不同的分離方法
1、蛋白質的鹽析
中性鹽對蛋白質的溶解度有顯著影響，一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高，蛋白質的溶解度增加，此稱鹽溶；當鹽濃度繼續升高時，蛋白質的溶解度不同程度下降並先後析出，這種現象稱鹽析，將大量鹽加到蛋白質溶液中，高濃度的鹽離子（如硫酸銨的SO4和NH4)有很強的水化力，可奪取蛋白質分子的水化層，使之「失水」，於是蛋白質膠粒凝結並沉澱析出。鹽析時若溶液pH在蛋白質等電點則效果更好。由於各種蛋白質分子顆粒大小、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣，因此調節混合蛋白質溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質分段沉澱。
影響鹽析的因素有：（1）溫度：除對溫度敏感的蛋白質在低溫（4度）操作外，一般可在室溫中進行。一般溫度低蛋白質溶介度降低。但有的蛋白質（如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白）在較高的溫度（25度）比0度時溶解度低，更容易鹽析。（2）pH值：大多數蛋白質在等電點時在濃鹽溶液中的溶介度最低。（3）蛋白質濃度：蛋白質濃度高時，欲分離的蛋白質常常夾雜著其他蛋白質地一起沉澱出來（共沉現象）。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋，使蛋白質含量在2.5-3.0%。
蛋白質鹽析常用的中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。
其中應用最多的硫酸銨，它的優點是溫度系數小而溶解度大（25度時飽和溶液為4.1M，即767克/升；0度時飽和溶解度為3.9M，即676克/升），在這一溶解度范圍內，許多蛋白質和酶都可以鹽析出來；另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好，不易引起蛋白質變性。硫酸銨溶液的pH常在4.5-5.5之間，當用其他pH值進行鹽析時，需用硫酸或氨水調節。
蛋白質在用鹽析沉澱分離後，需要將蛋白質中的鹽除去，常用的辦法是透析，即把蛋白質溶液裝入秀析袋內（常用的是玻璃紙），用緩沖液進行透析，並不斷的更換緩沖液，因透析所需時間較長，所以最好在低溫中進行。此外也可用葡萄糖凝膠G-25或G-50過柱的辦法除鹽，所用的時間就比較短。
2、等電點沉澱法
蛋白質在靜電狀態時顆粒之間的靜電斥力最小，因而溶解度也最小，各種蛋白質的等電點有差別，可利用調節溶液的pH達到某一蛋白質的等電點使之沉澱，但此法很少單獨使用，可與鹽析法結合用。
3、低溫有機溶劑沉澱法
用與水可混溶的有機溶劑，甲醇，乙醇或丙酮，可使多數蛋白質溶解度降低並析出，此法分辨力比鹽析高，但蛋白質較易變性，應在低溫下進行。
（二）根據蛋白質分子大小的差別的分離方法
1、透析與超濾
透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質分開。
超濾法是利用高壓力或離心力，強使水和其他小的溶質分子通過半透膜，而蛋白質留在膜上，可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質。
2、凝膠過濾法
也稱分子排阻層析或分子篩層析，這是根據分子大小分離蛋白質混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠（Sephadex
ged）和瓊脂糖凝膠（agarose gel）。
（三）根據蛋白質帶電性質進行分離
蛋白質在不同pH環境中帶電性質和電荷數量不同，可將其分開。
1、電泳法
各種蛋白質在同一pH條件下，因分子量和電荷數量不同而在電場中的遷移率不同而得以分開。值得重視的是等電聚焦電泳，這是利用一種兩性電解質作為載體，電泳時兩性電解質形成一個由正極到負極逐漸增加的pH梯度，當帶一定電荷的蛋白質在其中泳動時，到達各自等電點的pH位置就停止，此法可用於分析和制備各種蛋白質。
2、離子交換層析法
離子交換劑有陽離子交換劑（如：羧甲基纖維素；CM-纖維素）和陰離子交換劑（二乙氨基乙基纖維素；DEAE?FONT
FACE="宋體"
LANG="ZH-CN">纖維素），當被分離的蛋白質溶液流經離子交換層析柱時，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質被吸附在離子交換劑上，隨後用改變pH或離子強度辦法將吸附的蛋白質洗脫下來。（詳見層析技術章）
（四）根據配體特異性的分離方法－親和色譜法
親和層析法（aflinity
chromatography）是分離蛋白質的一種極為有效的方法，它經常只需經過一步處理即可使某種待提純的蛋白質從很復雜的蛋白質混合物中分離出來，而且純度很高。這種方法是根據某些蛋白質與另一種稱為配體(Ligand）的分子能特異而非共價地結合。其基本原理：蛋白質在組織或細胞中是以復雜的混合物形式存在，每種類型的細胞都含有上千種不同的蛋白質，因此蛋白質的分離（Separation），提純（Purification）
和鑒定（Characterization）是生物化學中的重要的一部分，至今還沒的單獨或一套現成的方法能移把任何一種蛋白質從復雜的混合蛋白質中提取出來，因此往往採取幾種方法聯合使用。
細胞的破碎
1、高速組織搗碎：將材料配成稀糊狀液，放置於筒內約1/3體積，蓋緊筒蓋，將調速器先撥至最慢處，開動開關後，逐步加速至所需速度。此法適用於動物內臟組織、植物肉質種子等。
2、玻璃勻漿器勻漿：先將剪碎的組織置於管中，再套入研桿來回研磨，上下移動，即可將細胞研碎，此法細胞破碎程度比高速組織搗碎機為高，適用於量少和動物臟器組織。
3、超聲波處理法：用一定功率的超聲波處理細胞懸液，使細胞急劇震盪破裂，此法多適用於微生物材料，用大腸桿菌制備各種酶，常選用50-100毫克菌體/毫升濃度，在1KG至10KG頻率下處理10-15分鍾，此法的缺點是在處理過程會產生大量的熱，應採取相應降溫措施。對超聲波敏感和核酸應慎用。
4、反復凍融法：將細胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復幾次，由於細胞內冰粒形成和剩餘細胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細胞結構破碎。
5、化學處理法：有些動物細胞，例如腫瘤細胞可採用十二烷基磺酸鈉（SDS）、去氧膽酸鈉等細胞膜破壞，細菌細胞壁較厚，可採用溶菌酶處理效果更好。

無論用哪一種方法破碎組織細胞，都會使細胞內蛋白質或核酸水解酶釋放到溶液中，使大分子生物降解，導致天然物質量的減少，加入二異丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或減慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺醯氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酥活力，但不是全部，還可通過選擇pH、溫度或離子強度等，使這些條件都要適合於目的物質的提取。
濃縮、乾燥及保存
一、樣品的濃縮
生物大分子在制備過程中由於過柱純化而樣品變得很稀，為了保存和鑒定的目的，往往需要進行濃縮。常用的濃縮方法的：
1、減壓加溫蒸發濃縮
通過降低液面壓力使液體沸點降低，減壓的真空度愈高，液體沸點降得愈低，蒸發愈快，此法適用於一些不耐熱的生物大分子的濃縮。
2、空氣流動蒸發濃縮
空氣的流動可使液體加速蒸發,鋪成薄層的溶液，表面不斷通過空氣流；或將生物大分子溶液裝入透析袋內置於冷室，用電扇對准吹風，使透過膜外的溶劑不沁蒸發，而達到濃縮目的，此法濃縮速度慢，不適於大量溶液的濃縮。
3、冰凍法
生物大分子在低溫結成冰，鹽類及生物大分子不進入冰內而留在液相中，操作時先將待濃縮的溶液冷卻使之變成固體，然後緩慢地融解，利用溶劑與溶質融點介點的差別而達到除去大部分溶劑的目的。如蛋白質和酶的鹽溶液用此法濃縮時，不含蛋白質和酶的純冰結晶浮於液面，蛋白質和酶則集中於下層溶液中，移去上層冰塊，可得蛋白質和酶的濃縮液。
4、吸收法
通過吸收劑直接收除去溶液中溶液分子使之濃縮。所用的吸收劑必需與溶液不起化學反應，對生物大分子不吸附，易與溶液分開。常用的吸收劑有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝膠等，使用聚乙二醇吸收劑時，先將生物大分子溶液裝入半透膜的袋裡，外加聚乙二醇復蓋置於4度下，袋內溶劑滲出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水飽和後要更換新的直至達到所需要的體積。
5、超濾法
超濾法是使用一種特別的薄膜對溶液中各種溶質分子進行選擇性過濾的方法，不液體在一定壓力下（氮氣壓或真空泵壓）通過膜時，溶劑和小分子透過，大分子受阻保留，這是近年來發展起來的新方法，最適於生物大分子尤其是蛋白質和酶的濃縮或脫鹽，並具有成本低，操作方便，條件溫和，能較好地保持生物大分子的活性，回收率高等優點。應用超濾法關鍵在於膜的選擇，不同類型和規格的膜，水的流速，分子量截止值（即大體上能被膜保留分子最小分子量值）等參數均不同，必須根據工作需要來選用。另外，超濾裝置形式，溶質成份及性質、溶液濃度等都對超濾效果的一定影響。Diaflo
超濾膜的分子量截留值：
膜名稱分子量截留值孔的大的平均直徑
XM－300300，000140
XM－200100，00055
XM－5050，00030
PM－30 30，00022
UM－2020，00018
PM－1010，00015
UM－21，00012
UM05500 10

用上面的超濾膜製成空心的纖維管，將很多根這樣的管攏成一束，管的兩端與低離子強度的緩沖液相連，使緩沖液不斷地在管中流動。然後將纖維管浸入待透析的蛋白質溶液中。當緩沖液流過纖維管時，則小分子很易透過膜而擴散，大分子則不能。這就是纖維過濾秀析法，由於透析面積增大，因而使透析時間縮短10倍。
二、乾燥
生物大分子制備得到產品，為防止變質，易於保存，常需要乾燥處理，最常用的方法是冷凍乾燥和真空乾燥。真空乾燥適用於不耐高溫，易於氧化物質的乾燥和保存，整個裝置包括乾燥器、冷凝器及真空乾燥原理外，同時增加了溫度因素。在相同壓力下，水蒸汽壓隨溫度下降而下降，故在低溫低壓下，冰很易升華為氣體。操作時一般先將待乾燥的液體冷凍到冰點以下使之變成固體，然後在低溫低壓下將溶劑變成氣體而除去。此法干後的產品具有疏鬆、溶解度好、保持天然結構等優點，適用於各類生物大分子的乾燥保存。
三、貯存
生物大分子的穩定性與保存方法的很大關系。乾燥的製品一般比較穩定，在低溫情況下其活性可在數日甚至數年無明顯變化，貯藏要求簡單，只要將乾燥的樣品置於乾燥器內（內裝有乾燥劑）密封，保持0－4度冰箱即可，液態貯藏時應注意以下幾點。
1、樣品不能太稀，必須濃縮到一定濃度才能封裝貯藏，樣品太稀易使生物大分子變性。
2、一般需加入防腐劑和穩定劑，常用的防腐劑有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。蛋白質和酶常用的穩定劑有硫酸銨糊、蔗糖、甘油等，如酶也可加入底物和輔酶以提高其穩定性。此外，鈣、鋅、硼酸等溶液對某些酶也有一定保護作用。核酸大分子一般保存在氯化鈉或檸檬酸鈉的標准緩沖液中。
3、貯藏溫度要求低，大多數在0度左右冰箱保存，有的則要求更低，應視不同物質而定。