凝膠過濾層析純化蛋白質

① 請簡述可用於蛋白質分離純化的四種方法及其原理

樓主，方法很多，我就挑幾個比較有代表的吧
1.親和層析：利用分子與其配體間特殊的、可逆性的親和結合作用而進行分離的一種層析技術。
原理：將具有特殊結構的親和分子製成固相吸附劑放置在層析柱中，當要被分離的蛋白混合液通過層析柱時，與吸附劑具有親和能力的蛋白質就會被吸附而滯留在層析柱中。那些沒有親和力的蛋白質由於不被吸附，直接流出，從而與被分離的蛋白質分開，然後選用適當的洗脫液， 改變結合條件將被結合的蛋白質洗脫下來。
http://ke..com/view/81754.htm
2.凝膠過濾：利用一定大小孔隙的具有網狀結構的凝膠作層析介質（如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、聚丙烯醯胺凝膠等），根據被分離物質的分子大小、形狀不同擴散到凝膠孔隙內的速度不同，因而通過層析柱的快慢不同而分離的一種層析法。
原理：凝膠過濾層析(gel filtration chromatography)法又稱排阻層析或分子篩方法，主要是根據蛋白質的大小和形狀，即蛋白質的質量進行分離和純化。層析柱中的填料是某些惰性的多孔網狀結構物質，多是交聯的聚糖(如葡聚糖或瓊脂糖)類物質，使蛋白質混合物中的物質按分子大小的不同進行分離。也叫做分子排阻層析（molecular-exclusion chromatography）。一種利用帶孔凝膠珠作基質，按照分子大小分離蛋白質或其它分子混合物的層析技術。 一般是大分子先流出來，小分子後流出來。
http://ke..com/view/81744.html
3.聚丙烯醯胺凝膠電泳：用於分離蛋白質和寡糖核苷酸。
作用原理 聚丙烯醯胺凝膠電泳是網狀結構，具有分子篩效應。它有兩種形式：（1）非變性聚丙烯醯胺凝膠，在電泳的過程中，蛋白質能夠保持完整狀態，並依據蛋白質的分子量大小、蛋白質的形狀及其所附帶的電荷量而逐漸呈梯度分開。
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4.鹽析：增加中性鹽濃度使蛋白質、氣體、未帶電分子溶解度降低的現象。是蛋白質分離純化中經常使用的方法，最常用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉和氯化鈉等。
http://ke..com/view/210139.htm

② 常用的蛋白質分離純化方法有哪幾種各自的作用原理是什麼

常用的蛋白質純化方法有離子交換色譜、親和色譜、電泳、疏水色譜等等

1. 離子交換色譜：蛋白質和氨基酸一樣會兩性解離，所帶電荷決定於溶液pH。pH小於pI時蛋白質帶正電，pH大於pI時蛋白質帶負電。不同蛋白質等電點的蛋白質在同一個溶液中，表面電荷情況不同。離子交換就是利用不同蛋白質在同一溶液中表面電荷的差異來實現分離的。

2. 親和色譜：生物大分子有一個特性，某些分子或基因對它們有特異性很強的吸附作用。如鎳柱中Ni可以與His標簽的蛋白結合，這種只針對一種或一類物質的吸附就是親和色譜的原理。

3. 電泳：SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳，SDS能斷裂分子內和分子間氫鍵，破壞蛋白質的二級和三級結構，強還原劑能使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂，蛋白質在一定濃度的含有強還原劑的SDS溶液中， 與SDS分子按比例結合，形成帶負電荷的SDS-蛋白質復合物，這種復合物由於結合大量的SDS，使蛋白質喪失了原有的電荷狀態形成僅保持原有分子大小為特徵的負離子團塊，從而降低或消除了各種蛋白質分子之間天然的電荷差異，由於SDS與蛋白質的結合是按重量成比例的，因此在進行電泳時，蛋白質分子的遷移速度取決於分子大小。

4. 疏水色譜：疏水色譜基於蛋白質表面的疏水區與介質疏水配體間的相互作用，在高濃度鹽作用下，蛋白質的疏水區表面上有序排列的水分子通過鹽離子的破壞被釋放，裸露的疏水區與疏水配體相互作用而被吸附。疏水色譜就是利用樣品中各組分在色譜填料上配基相互作用的差異，在洗脫時各組分移動速度不同而達到分離的目的。隨著鹽離子濃度的降低，疏水作用降低，蛋白質的水化層又形成，蛋白質被解吸附。
   

③ 蛋白質分離純化主要方法

分離純化某一特定蛋白質的一般程序可以分為前處理、粗分級、細分級三步。
1.前處理：分離純化某種蛋白質，首先要把蛋白質從原來的組織或細胞中以溶解的狀態釋放出來並保持原來的天然狀態（如果做不到呢？比如蛋白以包涵體形式存在），不丟失生物活性。為此，動物材料應先提出結締組織和脂肪組織，種子材料應先去殼甚至去種皮以免手單寧等物質的污染，油料種子最好先用低沸點（為什麼呢）的有機溶劑如乙醚等脫脂。然後根據不同的情況，選擇適當的方法，將組織和細胞破碎。動物組織和細胞可用電動搗碎機或勻漿機破碎或用超聲波處理破碎。植物組織和細胞由於具有纖維素、半纖維素和果膠等物質組成的細胞壁，一般需要用石英砂或玻璃粉和適當的提取液一起研磨的方法或用纖維素酶處理也能達到目的。細菌細胞的破碎比較麻煩，因為整個細菌細胞壁的骨架實際上是一個借共價鍵連接而成的肽聚糖囊狀大分子，非常堅韌。破碎細菌細胞壁的常用方法有超聲波破碎，與砂研磨、高壓擠壓或溶菌酶處理等。組織和細胞破碎後，選擇適當的緩沖液把所要的蛋白提取出來。細胞碎片等不溶物用離心或過濾的方法除去。
如果所要的蛋白主要集中在某一細胞組分，如細胞核、染色體、核糖體或可溶性細胞質等，則可利用差速離心的方法將它們分開，收集該細胞組分作為下步純化的材料。如果碰上所要蛋白是與細胞膜或膜質細胞器結合的，則必須利用超聲波或去污劑使膜結構解聚，然後用適當介質提取。
2. 粗分級分離：當蛋白質提取液（有時還雜有核酸、多糖之類）獲得後，選用一套適當的方法，將所要的蛋白與其他雜蛋白分離開來。一般這一步的分離用鹽析、等電點沉澱和有機溶劑分級分離等方法。這些方法的特點是簡便、處理量大，既能除去大量雜質，又能濃縮蛋白溶液。有些蛋白提取液體積較大，又不適於用沉澱或鹽析法濃縮，則可採用超過濾、凝膠過濾、冷凍真空乾燥或其他方法進行濃縮。
3.細分級分離：樣品經粗分級分離以後，一般體積較小，雜蛋白大部分已被除去。進一步純化，一般使用層析法包括凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析以及親和層析等。必要時還可選擇電泳法，包括區帶電泳、等電點聚焦等作為最後的純化步驟。用於細分級分離的方法一般規模較小，但解析度很高。
結晶是蛋白質分離純化的最後步驟。盡管結晶過程並不能保證蛋白一定是均一的，但是只有某種蛋白在溶液中數量上佔有優勢時才能形成結晶。結晶過程本身也伴隨著一定程度的純化，而重結晶又可除去少量夾雜的蛋白。由於結晶過程中從未發現過變性蛋白，因此蛋白的結晶不僅是純度的一個標志，也是斷定製品處於天然狀態的有力指標。
蛋白質分離純化的方法：
一、根據分子大小不同的純化方法
1、透析和超過濾
2、密度梯度離心
3、凝膠過濾
二、利用溶解度差別的純化方法
1、等電點沉澱和pH控制
2、蛋白質的鹽析和鹽溶
3、有機溶劑分級分離法
4、溫度對蛋白質濃度的影響
三、根據電荷不同的純化方法
1、電泳
2、聚丙烯醯胺凝膠電泳
3、毛細管電泳
4、等電聚焦
5、層析聚焦
6、離子交換層析
四、利用選擇性吸附的純化方法
1、羥磷石灰層析
2、疏水作用層析
五、利用配體的特異生物學親和力的純化方法
親和層析（affinity chromatography）：
a.凝集素親和層析
b.免疫親和層析
c.金屬螯合層析
d.染料配體層析
e.共價層析
六、高效液相層析合快速蛋白質液相層析

④ 凝膠過濾層析的原理是什麼

凝膠過濾層析的原理是利用具有多孔網狀結構的顆粒的分子篩作用，根據被分離樣品中各組分相對分子質量大小的差異進行洗脫分離，主要是根據蛋白質的大小和形狀，即蛋白質的質量進行分離和純化。
凝膠過濾層析也稱分子篩層析、排阻層析，小分子物質能進入其內部，流下時路程較長，而大分子物質卻被排除在外部，下來的路程短，當一混合溶液通過凝膠過濾層析柱時，溶液中的物質就按不同分子量篩分開了。

⑤ 蛋白質純化，凝膠過濾層析填料

首先瓊脂糖凝膠可來以排源除，這是大孔凝膠，用於分子量較大的成分。
我做分子篩用的比較多的柱子都是葡聚糖凝膠凝膠，我的蛋白比你的大，用G50和G100的填料，做的結果都沒什麼問題。
你的蛋白7kD，如果沒有什麼特別的性質（高級結構是球形還是其他的，有無多聚），G50應該可以。如果你不放心，也可以考慮聚丙烯醯胺凝膠，它和葡聚糖凝膠相比更適合於分子量稍小的蛋白，可能更實用於你的實驗。
聚苯乙烯凝膠沒用過，不發表意見。

⑥ 蛋白質的純化方法有那些呢具體步驟是什麼

蛋白質分離純化的一般程序可分為以下幾個步驟：

（一）材料的預處理及細胞破碎

分離提純某一種蛋白質時，首先要把蛋白質從組織或細胞中釋放出來並保持原來的天然狀態，不喪失活性。所以要採用適當的方法將組織和細胞破碎。常用的破碎組織細胞的方法有：

1. 機械破碎法

這種方法是利用機械力的剪切作用，使細胞破碎。常用設備有，高速組織搗碎機、勻漿器、研缽等。

2. 滲透破碎法

這種方法是在低滲條件使細胞溶脹而破碎。

3. 反復凍融法

生物組織經凍結後，細胞內液結冰膨脹而使細胞脹破。這種方法簡單方便，但要注意那些對溫度變化敏感的蛋白質不宜採用此法。

4. 超聲波法

使用超聲波震盪器使細胞膜上所受張力不均而使細胞破碎。

5. 酶法

如用溶菌酶破壞微生物細胞等。

(二) 蛋白質的抽提

通常選擇適當的緩沖液溶劑把蛋白質提取出來。抽提所用緩沖液的pH、離子強度、組成成分等條件的選擇應根據欲制備的蛋白質的性質而定。如膜蛋白的抽提，抽提緩沖液中一般要加入表面活性劑（十二烷基磺酸鈉、tritonX-100等），使膜結構破壞，利於蛋白質與膜分離。在抽提過程中，應注意溫度，避免劇烈攪拌等，以防止蛋白質的變性。

（三）蛋白質粗製品的獲得

選用適當的方法將所要的蛋白質與其它雜蛋白分離開來。比較方便的有效方法是根據蛋白質溶解度的差異進行的分離。常用的有下列幾種方法：

1. 等電點沉澱法

不同蛋白質的等電點不同，可用等電點沉澱法使它們相互分離。

2. 鹽析法

不同蛋白質鹽析所需要的鹽飽和度不同，所以可通過調節鹽濃度將目的蛋白沉澱析出。被鹽析沉澱下來的蛋白質仍保持其天然性質，並能再度溶解而不變性。

3. 有機溶劑沉澱法

中性有機溶劑如乙醇、丙酮，它們的介電常數比水低。能使大多數球狀蛋白質在水溶液中的溶解度降低，進而從溶液中沉澱出來，因此可用來沉澱蛋白質。此外，有機溶劑會破壞蛋白質表面的水化層，促使蛋白質分子變得不穩定而析出。由於有機溶劑會使蛋白質變性，使用該法時，要注意在低溫下操作，選擇合適的有機溶劑濃度。

（四）樣品的進一步分離純化

用等電點沉澱法、鹽析法所得到的蛋白質一般含有其他蛋白質雜質，須進一步分離提純才能得到有一定純度的樣品。常用的純化方法有：凝膠過濾層析、離子交換纖維素層析、親和層析等等。有時還需要這幾種方法聯合使用才能得到較高純度的蛋白質樣品。

⑦ 蛋白質分離純化的四種方法

1、鹽析法：

鹽析法的根據是蛋白質在稀鹽溶液中，溶解度會隨鹽濃度的增高而上升，但當鹽濃度增高到一定數值時，使水活度降低，進而導致蛋白質分子表面電荷逐漸被中和，水化膜逐漸被破壞，最終引起蛋白質分子間互相凝聚並從溶液中析出。

2、有機溶劑沉澱法：

有機溶劑能降低蛋白質溶解度的原因有二：其一、與鹽溶液一樣具有脫水作用；其二、有機溶劑的介電常數比水小，導致溶劑的極性減小。

3、蛋白質沉澱劑：

蛋白質沉澱劑僅對一類或一種蛋白質沉澱起作用，常見的有鹼性蛋白質、凝集素和重金屬等。

4、聚乙二醇沉澱作用：

聚乙二醇和右旋糖酐硫酸鈉等水溶性非離子型聚合物可使蛋白質發生沉澱作用。

(7)凝膠過濾層析純化蛋白質擴展閱讀：

蛋白質是生命的物質基礎，是有機大分子，是構成細胞的基本有機物，是生命活動的主要承擔者。沒有蛋白質就沒有生命。氨基酸是蛋白質的基本組成單位。它是與生命及與各種形式的生命活動緊密聯系在一起的物質。

機體中的每一個細胞和所有重要組成部分都有蛋白質參與。蛋白質占人體重量的16%~20% ，即一個60kg重的成年人其體內約有蛋白質9.6~12kg。

人體內蛋白質的種類很多，性質、功能各異，但都是由20多種氨基酸（Amino acid）按不同比例組合而成的，並在體內不斷進行代謝與更新。

⑧ 凝膠過濾層析和離子交換層析分離蛋白質的原理有何不同

所有的層析在原理上都是相通的,區別在於流動相和層析劑之間的作用力的回不同.
離子交換是利用答蛋白質表面的電荷與層析劑上的離子基團的靜電作用.
凝膠過濾層析利用了凝膠的多孔性,根據溶劑分子的大小進行分離.

⑨ 分離和提純蛋白質的基本原理

分離純化蛋白質的方法及原理 （一）利用分子大小 
1、透析：將待提純蛋白質放在透析袋中放在蒸餾水中進行 。原理：利用蛋白質分子不能透過半透膜的性質，使蛋白質和其他小分子物質如無機鹽、單糖、水等分開。 
2、超過濾：利用壓力和離心力，強行使其他小分子和水通過半透膜，而蛋白質留在膜上。
3、凝膠過濾層析。原理：當不同分子大小的蛋白質混合物流進凝膠層析柱時，比凝膠網孔大的分子不能進入珠內網狀結構，排阻在凝膠珠以外，在凝膠珠縫隙間隙中向下移動。而比孔小的分子不同程度地進入凝膠珠內，這樣由於不同大小分子所經歷的路徑不同而到分離。
（二）利用溶解度差別 
4、等電點沉澱。原理：不同蛋白質具有不同的等電點，當蛋白質混合物調到其中一種蛋白質的等電點時，這種蛋白質大部分和全部被沉澱下來.。 
5、鹽析與鹽溶 。原理：低濃度時，中性鹽可以增加蛋白質溶解度這種現象稱為鹽溶.當離子強度增加，足夠高時，例如飽和或半飽和程度，很多蛋白質可以從水中沉澱出來，這種現象稱為鹽析。
（三）根據電荷不同 
6、SDS-PAGE 全稱 十二烷基硫酸鈉—聚丙烯醯胺凝膠電泳。原理：通過加熱和SDS可以使蛋白質變性，多亞基的蛋白質也解離為單亞基，處理後的樣品中肽鏈是處於無二硫鍵連接的，分離的狀態。電泳時SDS-蛋白質復合物在凝膠中的遷移率不再受蛋白質原有電荷和形狀的影響，而主要取決於蛋白質分子量。所以SDS-PAGE常用來分析蛋白質的純度和大致測定蛋白質的分子量。 
7、離子交換層析。原理：氨基酸分離常用陽離子交換樹脂，樹脂被處理成鈉型，將混合氨基酸上柱，氨基酸主要以陽離子形式存在，在樹脂上與鈉離子發生交換，而被掛在樹脂上。

⑩ 凝膠過濾層析和離子交換層析分離蛋白質的原理有何不同

所有的層析在原理上都是相通的，區別在於流動相和層析劑之間的作用力的不同。
離子交換是利用蛋白質表面的電荷與層析劑上的離子基團的靜電作用。
凝膠過濾層析利用了凝膠的多孔性，根據溶劑分子的大小進行分離。