氨基酸分析儀陽離子交換柱

A. 什麼是氨基酸的離子交換

離子交換層析 (ion exchange chromatography，簡稱ICE)是分析和制備樣品混合物的液-固相層析方法，是基於待測物質的陽離子或陰離子和相對應的離子交換劑間的靜電結合，即根據物質的酸鹼性、極性等差異，通過離子間的吸附和脫吸附原理將電解質溶液各組分分開。它是從復雜混合物體系中分離性質極為相似的生物分子的有效手段之一。由於帶電荷不同的各種物質對離子交換劑有不同親和力，通過改變洗脫液的離子強度和pH值，控制這種親和力，即可使這些物質依據親和力大小順序依次從層析柱中洗脫下來。

氨基酸是兩性電解質，分子 上的凈電荷取決於氨基酸的等電點和溶液的pH值，各種氨基酸分子結構不同，在同一pH值時所帶電荷的性質(正、負)和多少不同，與離子交換樹脂的親和力有差異，因此可根據親和力從小到大的順序被洗脫液分別洗脫下來，達到分離的效果。

三、儀器與試劑

(一)實驗器材

(1)玻璃層析柱

(2)試管

(3)移液管

(4)恆壓洗脫瓶

(5)部分收集器

(6)水浴鍋

(7)分光光度計

(8)電爐

(二)材料與試劑

(1)苯乙烯磺酸鈉型樹脂(100~200目)

(2)2mol/L鹽酸溶液

(3)2mol/L氫氧化鈉溶液

(4)標准氨基酸溶液：將天門冬氨酸和賴氨酸分別配成2mg/mL的0.1mol/L鹽酸溶液。

(5)混合氨基酸溶液：將上述天門冬氨酸和賴氨酸溶液按1：4比例混合。

(6)檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸溶液(pH5.8，鈉離子濃度0.45mol/L)：取檸檬酸14.25克、氫氧化鈉9.30克分別溶於水後混合，加入濃鹽酸5.25毫升，定容至500毫升;4℃冰箱保存。

(7)顯色劑：2克水合茚三酮溶於95%乙醇中，加水至100毫升。

B. 全自動氨基酸分析儀的操作方法

測定樣品中各種游離氨基酸含量，可以除去脂肪雜質後，直接上柱進行分析。
測定蛋白質的氨基酸組成時樣品必須經酸水解，使蛋白質完全變成氨基酸後才上柱進行分析。 經過處理後的樣品上柱進行分析。上柱的樣品量根據所用自動分析儀的靈敏度來確定。一般為每種氨基酸0.1μmol 左右（水解樣品乾重為0.3mg 左右）。測定必須在pH5～5.5、100℃下進行，反應進行時間為10～15min，生成的紫色物質在570nm 波長下進行比色測定。而生成的黃色化合物在440nm 波長下進行比色測定。做一個氨基酸全分析一般只需1h 左右，同時可將幾十個樣品一起裝入儀器，自動按序分析，最後自動計算給出精確的數據。儀器精確度在±1～3%。用陽離子交換柱分離及測定氨基酸所的如下圖

C. 氨基酸分析儀的優缺點

採用經典的陽離子交換色譜分離、茚三酮柱後衍生法，對蛋白質水解液及各種游離氨基酸的組分含量進行分析。儀器基本結構同普通hplc相似，但針對氨基酸分析進行了細節優化（例如氮氣保護、惰性管路、在線脫氣、洗脫梯度及柱溫梯度控制等等）
通常細分為兩種系統：蛋白水解分析系統（鈉鹽系統）和游離氨基酸分析系統（鋰鹽系統），利用不同濃度和ph值的檸檬酸鈉或檸檬酸鋰進行梯度洗脫。其中鈉鹽系統一次最多分析約25種氨基酸，速度較快，基線平直度好；鋰鹽系統一次最多分析約50種氨基酸，速度較慢，基線一般不如鈉鹽系統好。
分析效果：從目前已知的氨基酸分析方法比較來看，除靈敏度（即最低檢測限）比hplc柱前衍生方法稍低以外（hplc：<0.5pmol；氨基酸分析儀：<10pmol)，其他如分離度、重現性、操作簡便性、運行成本等方面，都優於其他分析方法。

D. 在強酸型陽離子交換柱上天冬氨酸，組氨酸，亮氨酸等幾種氨基酸的洗脫順序及原因。

洗脫順序先後依次是：天冬氨酸、亮氨酸、組氨酸。
原因：氨基酸與陽離子交換樹回脂的靜電引力大小答依次是 鹼性氨基酸＞中性氨基酸＞酸性氨基酸，所以洗脫的順序就先是酸性氨基酸，然後是中性氨基酸，最後是鹼性氨基酸。
天冬氨酸屬於酸性氨基酸，組氨酸屬於鹼性氨基酸，亮氨酸屬於中性氨基酸。
詳見《生物化學》王鏡岩 第三版 上冊 153頁

E. 離子交換柱層析法分離氨基酸實驗裝柱有哪些注意事項

氨基酸的分離鑒定——紙層析法
一,實驗目的
掌握氨基酸紙層析的方法和原理,學會分析待
測樣品的氨基酸成分.
二,實驗原理
紙層析是以濾紙為惰性支持物的分配層析.濾紙纖維上的羥基具有親水性,吸附一層水作為固定相,有機溶劑為流動相.當有機相流經固定相時,物質在兩相間不斷分配而得到分離.
溶質在濾紙上的移動速度用Rf值表示:
Rf=原點到層析斑點中心的距離/原點到溶劑前沿的距離
在一定的條件下某種物質的Rf值是常數.Rf值的大小與物質的結構,性質,溶劑系統,層析濾紙的質量和層析溫度等因素有關.本實驗利用紙層析法分離氨基酸.
三,實驗器材
(1)大燒杯(5000mL):1隻/組
(2)微量注射器(100 L):1隻/ 組.
(3)噴霧器:公用.
(4)培養皿:1隻/組.
(5)層析濾紙(長22cm,寬14cm的新華一號濾紙):1張/組.
(6)直尺,鉛筆:自備.
(7)電吹風:1隻/組.
(8)托盤,針,白線:1套/組.
(9)手套:1雙/組.
(10)塑料薄膜:公用.
(11)小燒杯:50mL,1隻/組.
四,實驗試劑
(1)擴展劑:將4體積正丁醇和1體積冰醋酸放入分液漏斗中,與5體積水混合,充分振盪,靜置後分層,棄去下層水層.
(2)氨基酸溶液:0.5%的已知氨基酸溶液3種(賴氨酸,苯丙氨酸,纈氨酸),0.5%的待測氨基酸液1種.
(3)顯色劑:0.1%水合茚三酮正丁醇溶液.
實驗試劑
五,實驗操作
檢查培養皿是否乾燥,潔凈;若否,將其洗凈並置於乾燥箱內120℃烘乾.
(1)平衡:剪一大塊塑料薄膜鋪在桌面上,將層析缸或大燒杯到置於塑料薄膜上,再把盛有約20mL展層溶液的小燒杯置於倒置的層析缸或大燒杯中,用塑料薄膜密封起來,平衡20min.
(2)規劃:帶上手套,取寬約14cm,高約22cm的層析濾紙一張.在紙的下端距邊緣2cm處輕輕用鉛筆劃一條平行於底邊的直線A,在直線上做4個記號,記號之間間隔2cm,這就是原點的位置.另在距左邊緣1cm處畫一條平行於左邊緣的直線B,在B線上以A,B兩線的交點為原點標明刻度(以厘米為單位),參見左圖.
(3)點樣:用微量注射器分別取10mL左右的氨基酸樣品(每取一個樣之前都要用蒸餾水洗滌微量注射器,以免交叉污染),點在這四個位置上.擠一滴點一次,同一位置上需點2～3次,2～3mL/次,每點完一點,立刻用電吹風熱風吹乾後再點,以保證每點在紙上擴散的直徑最大不超過3mm.每人須點4個樣,其中3個是已知樣,1個是待測樣品.
(4)層析:用針,線將濾紙縫成筒狀,紙的兩側
邊緣不能接觸且要保持平行,參見圖3-3.向培養皿中加入擴展劑,使其液面高度達到1cm左右,將點好樣的濾紙筒直立於培養皿中(點樣的一端在下,擴展劑的液面在A線下約1cm),罩上大燒杯,仍用塑料薄膜密封.當擴展劑上升到A線時開始計時,每隔一定時間測定一下擴展劑上升的高度,填入表3-1中.當上升到15～18cm,取出濾紙,剪斷連線,立即用鉛筆描出溶劑前沿線,迅速用電吹風熱風吹乾.
(5)顯色:用噴霧器在通風廚中向濾紙上均勻噴上0.1%茚三酮正丁醇溶液,然後立即用熱風吹乾,即可顯出各層析斑點,參見左圖.
(6)計算各種氨基酸的Rf值,並判斷混合樣品中都有哪些氨基酸,各人將自己的實驗結果貼在實驗報告上,見表3-2.
(7)以層析時間為橫坐標,擴展劑上升高度為縱坐標畫圖,求出擴展劑上升到18cm時所需要的時間.
(8)將微量注射器內外用蒸餾水清洗干凈,倒掉用過的展層液和平衡液,將培養皿洗凈,整理好桌面上的儀器和試劑

F. 氨基酸分析儀的介紹

氨基酸分析儀是一種分析儀器，採用經典的陽離子交換色譜分離、茚三酮柱後衍生法，對蛋白質水解液及各種游離氨基酸的組分含量進行分析。

G. 在強酸性陽離子交換柱上asp，his及leu等幾種氨基酸的洗脫順序如何為什麼

依次是：精氨酸Asp，賴氨酸Leu，組氨酸His
因為他們的鹼性，也就是攜帶正電荷的能力，或者說電離成陽離子的能力，由強到弱是這個順序。

H. 氨基酸用離子交換柱，色譜柱為什麼需要平衡啊

如果你用的是一般的液相色譜儀，需要很長的時間平衡柱子和系統，因為離子交換柱對流動相中的離子很敏感，一般的液相色譜儀內壁是金屬的，多會產生離子或靜電荷，對分析造成干擾。推薦用離子色譜儀，或氨基酸分析儀，不過也要平衡一定的時間

I. 氨基酸分析儀的色譜柱是什麼填料的壽命大概能有多久能自己裝填嗎

您好來，我是德國曼默博爾公司自的工程師。
氨基酸分析的色譜柱填料主要是苯乙烯-二乙烯苯聚合後磺化成的磺酸型強酸性陽離子交換樹脂。
其實，色譜柱壽命主要看自己使用時候保護的怎麼樣：包括樣品前處理是否規范，維護保養是否充分等。一般注意點使用的話，保證柱效的情況下，壽命能保證在1萬-2萬針左右，多的話也有可能，看你怎麼用了。有的廠家會吹噓能到6萬針，簡單計算下氨基酸分析一個樣大概得1小時左右，除去維護時間，一天最多跑個20針，一年也就6000針左右，10年才能跑完6萬針，到時候儀器報廢沒報廢都不知道，別說色譜柱了。
色譜柱的裝填是非常需要經驗和技巧的活兒，而且裝色譜柱得需要非常專業的色譜柱裝柱機。比如裝色譜柱的時候得用恆壓泵裝，一般實驗室儀器都配置的是恆流泵，恆流泵裝出來的柱子填料很容易就塌了。而且前期的填料清洗、勻漿等都非常需要經驗，要是自己裝估計很難，一般得找專業的色譜柱工程師裝填最好。
希望對您有幫助，記得給分

J. 全自動氨基酸分析儀的工作原理

測定原理是利用樣品各種氨基酸組分的結構不同、酸鹼性、極性及分子大小不同，在陽離子交換柱上將它們分離，採用不同pH值離子濃度的緩沖液將各氨基酸組分依次洗脫下來，再逐個以另一流路的茚三酮試劑混合，然後共同流至螺旋反應管中，於一定溫度下（通常為115～120℃）進行顯色反應，形成在570nm有最大吸收的藍紫色產物。其中的羥脯氨酸與茚三酮反應生成黃色產物，其最大吸收在440nm。