核酸檢測水處理工藝方法

1. 檢測核酸純度方法

紫外吸收檢測DNA濃度與純度2007年11月13日 星期二 11:40目的： 了解紫外吸收檢測DNA濃度與純度的原理，掌握測定方法。

原理： 核酸的最大吸收波長為260nm，蛋白質為280nm，在波長260nm時，1OD值相當於雙鏈DNA濃度為50μg/ml，單鏈

寡核苷酸的含量為30μg/ml，可以據此來計算核酸樣品的濃度,還可通過測定在260nm和280nm的OD值的比值

（OD260/OD280），估計核酸的純度。純凈DNA的比值為1.8, RNA為2.0。若比值高於1.8說明DNA樣品中的RNA尚未除

盡，若樣品中含有酚和蛋白質將導致比值降低。270nm存在高吸收表明有酚的干擾。 紫外分光光度法只能用於測定濃度

大於0.25μg/ml的核酸溶液，對濃度更小的樣品，可採用熒光分光光度法。

試劑與儀器： 提取的質粒DNA，紫外分光光度儀。

操作步驟：
1) 分光光度計先用水在260nm和280nm兩個波長下校零。
2) 取質粒DNA樣品2μl，用水稀釋100倍，轉入分光光度計的石英比色杯中。
3) 在260nm和280nm分別讀出樣品光密度值。如果樣品濃度單位為μg/μl，則樣品DNA濃度為OD 值的10倍，即如

OD<SUB>260</SUB>=0.1，則樣品濃度即為1μg/μl。
4) 若OD<SUB>260</SUB>/OD<SUB>280</SUB>大於1.8，說明仍有RNA，可以考慮用RNA酶處理樣品，若小於1.8，說

明樣品中含有蛋白質或酚，應再用酚/氯仿抽提，以乙醇沉澱純化DNA。

2. 核酸pcr步驟

一、個人三級防護穿戴

帶一次性帽子、佩戴醫用N95、一次性防護服、一次性鞋套、一次性防水靴套、一層乳膠手套、外層一次性隔離衣、防護目鏡、第二層乳膠手套、穿戴完畢後應盡快通過專用緩沖間或者走廊，進入核酸提取區（專業核酸提取實驗室）。


二、樣本滅活處理

核酸檢測須有兩名工作人員快速通過進入實驗室，進行滅活實驗操作。生物安全櫃內需配備吸水棉與消毒酒精、有條件可配備吸水檯布，對樣本溢灑時進行緊急處理；打開二級容器，用75%酒精消毒物體表面，檢測樣本管密閉性後進行滅活處理，滅活條件（56℃，30min，恆溫樣本滅菌儀等多種方式），取出酒精滅活管用酒精擦拭外表，將樣本放入到生物安全櫃內。

三、手工核酸提取

操作人員進入試劑配置區或者單獨的潔凈實驗室。

一、試劑區准備

根據說明說要求，在AW1中加入無水乙醇130mL，在AW2中加入無水乙醇160mL，計入無水乙醇後及時做好標記，在310μg的Carrier RNA中加入310μL AVE，並顛倒混勻使Carrier RNA充分溶解，就此完成洗液AW1、洗液AW2和Carrier RNA配置，而後通過傳遞窗傳送到樣本處理區，或者由專人送到核酸提取實驗室中。

二、樣本的裂解

用1.5ml的無菌EP管，移液器移取560μl AVL裂解液，加入5.6μl Carrier RNA，加入140μl的已滅活的待提取核酸的待測樣本，渦旋振盪15s，室溫靜止10min。將上述EP管放入離心機內瞬時離心以去除可能殘留在EP管蓋上的裂解產物，防止污染。裂解完成後，加入560μl無水乙醇，振盪混勻15s，將上述EP管放入離心機內瞬時離心以去除可能殘留在EP管蓋上的裂解產物，防止污染。

向離心柱加入裂解產物630μl，8000轉離心1min，若離心機在生物安全櫃之外，每次使用都需進行外表面消毒。更換新廢液收集管，要從離心機中小心取出離心柱，將上層離心柱轉移到新收集管中，繼續將剩餘裂解產物630μl加入離心柱中，若樣本體積大於140μl時需重復此步驟，直到全部裂解產物都過柱離心，8000轉離心1min，小心將離心柱轉移到新的收集管中。

取500μl AW1加入離心柱中（注意，此處加樣操作時務必將移液器吸頭接觸離心柱內壁緩慢加樣），8000轉離心1min。小心取出離心柱，更換新的收集管。

取500μl AW2加入離心柱中，14000轉離心3min，小心取出離心柱，更換新的離心柱上端收集管，置於離心機中使用最大轉速離心1min，以確保將AW2中的殘液完全離心干凈。

取無菌1.5mlEP管收集核酸，將離心柱上端小心放入1.5mlEP管中，取40-60μl的洗脫液AVE加入到離心柱中（注意：洗脫液應盡量全部覆蓋住離心柱膜），用EP管管蓋蓋住離心柱，使用無菌剪刀剪去原離心柱管蓋。

室溫靜止1min，將其放入離心機中8000轉離心1min，回收核酸。丟棄離心柱，EP管中即為獲取的提取核酸，做好標記與登記。

四、用儀器提取核酸

首先按照說明說准備核酸提取試劑，將200μl滅活樣本添加到核酸提取試劑中，根據核酸提取儀的設置程序上機提取核酸，等儀器操作結束，提取核酸完成，回收核酸。

五、PCR體系配置

根據檢測樣本數量配製體系，將配製好的PCR體系充分混勻並離心後，將其通過傳遞窗送至樣本處理核酸加樣區，或單獨的樣本加樣實驗室。按照每孔分裝20μL反應體系，進行分裝，在各孔分別加入5μL待測樣本核酸或陰陽對照物（請注意每次檢測器包含1個陽性對照和3個陰性對照且陰性對照需隨機分布），密封PCR管，有條件時模板加樣盡量在單獨的生物安全櫃進行。

工作人員將配好的PCR管通過傳送窗口送至PCR擴增區，或由專人送至PCR擴增實驗室，上機檢測。

六、上機檢測及結果分析

工作人員進入基因擴增分析實驗室，從傳遞窗取出PCR反應管，上機前需混勻並離心反應體系，按試劑盒說明說設置擴增參數並分析判讀結果。分析結果時，嚴格閱讀說明說充分了解試劑盒靈敏度、方法學局限性等綜合判讀實驗結果。

為防止擴增污染，反應結束後的PCR擴增管嚴禁開蓋並裝入密封帶中裝入指定的垃圾桶中。

七、檢測後的消毒處理

樣本處理完成後，工作人員應用75%的酒精消毒處理外層手套並脫下外層手套，放入生物安全櫃中的生物垃圾桶中。檢測完成後，生物安全櫃檯面和地面應用0.5-1%的有效氯消毒劑或75%乙醇進行擦拭。將安全櫃內產生的醫療垃圾用三層垃圾袋密封，並將其放入指定垃圾桶中，垃圾袋上需標記醫療垃圾信息。實驗結束後，生物安全櫃以及實驗室均要進行紫外燈照射消毒，時間至少30min。

實驗操作人員，應有他人用0.5-1%的有效氯消毒劑或75%乙醇對一次性隔離衣均勻噴霧消毒處理，而後脫去隔離衣將檢測醫用垃圾放入制定垃圾桶中，工作人員在離開二級實驗室後，應在緩沖區或走廊按順序摘脫個人三級防護用品，首先應帶新的外層手套，摘掉護目鏡並置於75%乙醇中消毒，自上而下、自內向外翻轉脫掉一次性防護服，脫去外層手套，摘除、一次性帽子、脫一次性鞋套。脫掉手套，病毒防護服均需進行高壓滅菌處理。高壓前後醫療垃圾嚴格區分。

病毒相關垃圾需在120度，30min條件進行濕熱高壓處理，以高壓試紙條變色為有效，而後作為普通醫療垃圾處理。

3. 西安啟用多套氣膜實驗室測核酸，這種檢測核酸的原理是什麼

它的原理是氣膜實驗室是一個整體可以固定安裝也可以隨時移動，工作員提取到樣本之後可以直接在實驗室裡面提取樣本檢測這樣更加快速有效。氣膜實驗室是第一次投入到使用當中，在此之間已經經過了多次試驗，無論是在安全上還是效率上都是有保障的。

一、這種實驗室有什麼好處？

這種實驗室的好處在於可以快速有效的檢測提取到的樣本，不同於常規實驗室。常規的實驗室提取到樣本之後還要送到專門的研究室進行病毒檢測，氣膜實驗室有專門的擴增室提取到樣本之後，可以直接在擴增室裡面進行檢測。一方面這種實驗室可以增加效率，另一方面也可以防止病毒從實驗室當中傳播出去既有效率又安全。

4. 核酸檢測方法

核酸檢測採用咽拭子檢測，有口咽拭子采樣和鼻咽拭子采樣兩種方式。

口咽拭子采樣就是在咽喉部位用棉簽塗擦，刷取咽喉部位上皮細胞的檢測。受檢測者只要放鬆心情，張口發出「啊——」的聲音就可以了，檢測過程並沒有創傷風險，是非常安全的檢測。

檢測時可能會有惡心、想要嘔吐的不適感覺，不過這些不適症狀通常只需要半分鍾到兩分鍾左右就可以完全緩解了。鼻咽拭子采樣是將一根細棉簽深入鼻孔，從下鼻道深入抵達鼻咽後壁，然後捻轉棉簽取樣。棉簽進入鼻腔的深度約為鼻尖到耳垂的距離。

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核酸檢測相關知識：

核酸檢測是檢測病毒的方法，它可以更早發現感染。現在臨床中對乙肝、丙肝、艾滋病都開展了核酸檢測，可以在抗體產生前檢測到血液中是否存在病毒。而一些呼吸道疾病可以通過咽拭子或者呼吸道分泌物的核酸檢測來判斷是否感染，以及推測是否具有傳染性。

季節性流感、禽流感、冠狀病毒感染等通過咽拭子檢測可以方便地判斷出上呼吸道是否存在病毒成份，從而判斷被檢測者是否屬於感染者。

新冠病毒的核酸檢測已經是比較成熟的檢測方法了，只要在咽喉部位擦拭幾秒鍾就可以採集到標本。通過分析判斷是否有新冠病毒的核酸成分，可以盡早發現感染者，甚至在感染者出現症狀前就可以檢測到陽性。

感染者經過隔離治療後咽拭子檢測陰性說明病毒已經清除，不具有傳染性了。目前兩次咽拭子核酸檢測陰性是確診病例和無症狀感染者解除隔離的標准之一。

5. 食品怎麼核酸檢測

核酸檢測的 常規步驟是 醫護人員穿具防護服 雙手用酒精消毒 佩戴無菌手套 然後打開檢測盒的包裝 一手拿壓舌板 按壓舌頭 另一隻手拿無菌的棉簽 以靈敏而輕柔的動作 沾取受檢查者 咽喉部扁桃體部位的分泌物 取樣完畢