鏈霉親和素瓊脂糖樹脂

㈠ 生物素-親合素系統的原理

生物素（biotin，B）廣泛分布於動、植物組織中，常從含量較高的卵黃和肝組織中提取，分子量244．31Da．生物素分子有兩個環狀結構（如圖），其中Ⅰ環為咪唑酮環，是與親和素結合的主要部位；II環為噻吩環，C2上有一戊酸側鏈，其末端羧基是結合抗體和其他生物大分子的惟一結構，經化學修飾後，生物素可成為帶有多種活性基團的衍生物——活化生物素。活化生物素可以在蛋白質交聯劑的介導下，與已知的幾乎所有生物大分子偶聯，包括蛋白質，核酸，多糖，脂類等。
親和素（avidin，AV）亦稱抗生物素蛋白、卵白素，是從卵白蛋白中提取的一種由4個相同亞基組成的鹼性糖蛋白，分子量為68kD，等電點pI=10.5；洞畝咐耐熱並耐受多種蛋白水解酶的作用．尤其是與生物素結合後，穩定性更好。生物素與親和素間的作用是目前已知強度最高的非共價作用，親和常數（K）為1015mol/L，比抗原與抗體間的親和耐返力（K=10.5～11L/mol）至少高1萬倍。並且，二者的結合穩定性好專一性強，不受試劑濃度，PH環境，抑或蛋白變性劑等有機溶劑影響。由於每個親和素能結合4個分子的生物素，這一特點可以用於構建一個多層次信號放大系統。因此，BAS即可用於微量抗原、抗體及受體的定量、定性檢測及定位觀察研究，亦可製成親和介質用於上述各類反應體系中反應物的分離、純化。
親和素由於帶有一個糖鏈側鏈，導致容易和細胞表面的多糖發生非特異性親和。因此，鏈霉親和素被開發出來。
鏈霉親和素（streptavidin，SA）是由鏈黴菌streptomyces avidinii分泌的一種蛋白質，分子量為65kD。鏈霉親和素分子由4條相同的肽鏈組成，其中每條肽鏈都能結合一個生物素，並且不帶任何糖基，因此與親和素一樣，一個鏈霉親和素分子也能結合4個生物素分子，二者親和常數（納純K）亦為1015mol/L。鏈霉親和素的適用范圍比親和素更為廣泛。

㈡ pcr擴增產物分析的方法有免疫印跡嗎

PCR擴增產物的分析方法微孔板夾心雜交法顏色互補分析法PCR-ELISA法PCR-OLA法PCR-打點雜交法微孔板夾心雜交法：該法是通過一固定於微孔板的捕獲探針與PCR產物的某一區域特 異雜交使產物的間接地固定於微孔板上，然後，再用一生物素 等非放射性標記物標記的檢測探針與產物的另一特異性較一次 雜交，漂洗後顯色即可判斷結果。該法需要兩個雜交過程來檢測 一個產物，因此，其特異性較一次雜交的檢測法高。該法已用於HBV 的檢測，其敏感度可達5個HBVDNA分子。此法的敏感性和特異性與 PCR32P探針的Southern雜交法相當。但PCR微孔板夾心雜交法操作簡 便、快速、避免了同位素標記探針的危害，顯色反應類似於臨床常 規應用的ELISA，適於臨床實驗室常規應用。另一種微孔板雜交法不 是採用夾心法，而是直接將特異探針固定微孔板上，然後用生物素 標記的PCR產物雜交。微孔板雜交與膜印跡雜交相比，有如下優點： ①前者易操作；②固相微孔板漂洗時間短，節省了檢測時間，因為 膜雜交過程中，反應劑要浸透膜中，漂洗時，使反應劑全部浸出需 要時間較長；③本底低，微孔板雜交不需Dehatdt液和預雜交以及封 閉過程。另外，微孔板固定的DNA不需再加熱或UV照射。微孔板雜交的基本過程包括L：DNA的固定，探針的雜交和酶聯顯色。DNA的固定在一定鹽濃度條件下，DNA單鏈的一端可固定在微孔板上。不同來源 的微孔板固定DNA時所需鹽濃度不同。因此，必須用一系列的鹽濃度 （0.15mol/L至3.0mol/LNaCl）來固定加熱變性的核酸，然後，用固 定濃度的標記探針雜交。顯色後，判斷合適的固定鹽濃度。固定方 法的選擇必須使DNA最大量的固定，且不影響雜交。用合適濃度的 NaCl或(NH4)2SO4可達到此目的。硫氰酸鈉則無固定作用。鹽濃度合 適時，DNA應為一端固定到微孔板上，而太低或太高濃度的鹽可能使 DNA「平躺」固定在孔內而影響雜交。Mg2+雖有促進DNA固定的作 用，但它可激活Dnase，所以，一般不用。被固定的DNA應大於毀兄300bp， 否則影響雜交結果。每孔可固定高達200ng(624bp)的DNA。合適的鹽 濃和固定量一經確定，可按下法固定DNA。
待固定DNA100℃加熱5min變性並立即冷卻。與合適的固定液混合後，加入微孔板的孔內。固定液：10mmol/L磷 酸鈉-10mmol/LEDTA，pH7.0，合適濃度的NaCl（與DNA變性混合後， 終濃度為最適固定濃度）。用膠布封好，浸於37℃水浴2h。用PBS-0.05%Tween20漂洗3次。立即用於雜交，搜段或封閉於塑料袋內保存。雜交可採用標準的雜交系統雜交。夾心世余譽雜交時，是將變性的PCR產物與檢 測探針一並加。雜交與漂洗時間均較一般膜雜交短。顯色根據不同酶標檢測分子的不同選擇不同的底物、終止劑和測定波 長。顏色互補分析法(A)顏色互補分析法是利用三原色原理，當不同DNA片段（A和B）同時擴增時，用引 物5』端修飾技術將不同引物用不同顏色熒光素標記（A片段引物標記綠色的熒 光素，B標記紅色的羅丹明）。如果僅有一條片段被擴增，擴增產物激發後，只有 一種顏色（紅色或綠色）。如果兩條不同大小的片段均被擴增，可通過電泳分離，紫 外激發後可觀察到不同顏色的兩條帶。如果兩條被擴增片段大小相同，電泳後可見一 條紅綠互補色-黃色帶。如果不用電泳法分離擴增片段，通過一定手段除未摻入引 物，亦可觀察到擴增產物的顏色。此時，擴增產物無論大小，只要均被擴增，就可見 一條紅綠互補的黃色條帶。該法簡便、易於自動化，可用於檢測基因，缺失、染色體轉位和病原微生物。這種情 況下，只需判斷產物的有無。另外，在檢測多種基因實變、多種病原菌和HLA分型 時，可用復合PCR。此時，不同引物可用不同熒光素標記（如綠色的ROX；藍色的COUM 等）。PCR-ELISA法：(A)本法避免了電泳和雜交的步驟，適於常規ELISA記數儀檢測。因為5』端修飾後仍 可進行常規PCR擴增特異靶序列，因此，可以通過修飾其中一個引物的5』端使其攜帶 便於PCR產物固定的功能基團，而通過另一引物5』端的修飾使產物便於檢測。鏈霉親和素的包被：不同廠家的聚丙乙烯微孔板的包被效果差異並不顯著。親和層析純化的鏈霉親和素（13U/mg，Sigma公司）用PBS-Tween液140mmol/LNaCl， 2.7mmol/LKCl，4.3mmol/LNa2HPO4，1.4mmol/LK2HPO4，0.05%(w/v)Tween20，Ph7.2 配成1μg/ml。向微孔板的每孔內加入100μl，封好，室溫過夜。 用PBS液漂洗。
擴增產物與包被板的結合：PCR產物1μl用50μ1PBS-Tween液稀釋後加入包被孔內。室溫下作用30min。 用PBS-Tween液漂洗6次，去除未摻入的熒光引物。 ELISA：向結合有PCR產物的孔內加入50μlPBS-Tween液稀釋的HRP-抗FITC抗體，室溫下作用 30min。用PBS-Tween漂洗6次。將1mgTMB溶於1ml二甲基亞碸中，用50mmol/L醋酸鈉-檸檬酸液（Ph4.9）稀釋10倍， 向每孔內加入30%（v/v）H2O23μl，再加入80μlTMB液，使反應在室溫下進行2～5min ，再加入80μl2mol/L硫酸終止反應。於ELISA計數儀上450nm測定OD值。另外，引物的修飾除用圖2-3所示的生物素和FITC外，還可用DNA結合蛋白質的結合位 點和生物素修飾，將DNA結合蛋白質（GCN5或TyrR）包被在微孔板內，與PCR產物結合 後，可加入酶標親和素進行ELISA檢測。PCR-ELISA法可用於PCR產物定量分析。需注 意的是，定量分析時，PCR要在對數期內終止，並需設立已知標准對照。PCR-OLA法(A)研究表明、不同個體中同源DNA片段序列間的差異大部分是限定於單個核苷酸的位 置。已弄清的人遺傳病的40個基因結構變異中，絕大部分屬鹼基替換，同樣，作為遺 傳連鎖分析標記的大部分序列變異主要是位於基因組的非編碼區的點突變。所以，一 般基因檢測技術的一個重要要求是能很容易地檢出單一核苷酸變異。寡核苷酸連接試 驗（OLA）就是為此目的而設計的。它可以單獨或結合PCR快速確定緊密相關的DNA序 列。OLA是通過設計兩種能與靶序列DNA精確並列雜交的寡核苷酸完成的。寡核酸雜交 後，DNA連接酶可使其正常配對的相鄰鹼基共價連接，而錯配的相鄰鹼基可通過調節 連接酶和NaCl濃度防止其連接，連接產物可通過凝膠電泳觀察其大小，或通過5』端 修飾技術使一個寡核苷酸5』端帶有一個配基。連接後，通過固相化的親和配基使其 固定，漂洗後，檢測另一寡核苷酸3』端攜帶的適當標記分子。這一過程如重復進行 多個循環，則連接產物會呈線性增加，故稱這循環進行的OLA為連接檢測反應（LDR）。 此反應中若再加入兩種與上述寡核苷酸互補的寡核苷酸互補的寡核苷酸進行循環的連 接反應，則稱之為連接酶鏈反應。兩寡核苷酸在無靶序列的情況下，在非常接近的位 置發生雜交的可能性極小，因此，OLA技術的假陽性極少。另外，連接酶所形成的鍵 是連接產物。該法適於簡單、標准化的基因組樣品處理法，或直接用表面活性劑和蛋 白酶初步處理有核細胞作為檢測樣品。需指出的是，這里是以放射性標記檢測分子為 例的。如圖2-6中的地高辛標記分子可避免放射性同位素的缺點，且敏感性相當，更 易於自動化。
寡核苷酸的設計與標記：用於OLA的寡核苷酸一般為20mer，使被檢變異核苷酸位於 即將連接的兩個寡核苷酸接頭的5』端。即位於圖2-6中第2步左側寡核苷酸的3』端。 左側寡核苷酸是5』標記生物素。右側寡核苷酸5』端需磷酸化才能與左側寡核苷酸的 3』-OH相連接。用PNK酶處理很易使其5』或3』標記可以選擇其它標記物（如熒光素 等）。OLA反應：向一軟質圓底微滴定板內依次加入：3μlPCR擴增DNA產物；1μl剪切的鮭精DNA(10μg /μl);1μl0.5mol/LNaCl混勻室溫作用10min。加入1μl0.5mol/LHCl，混勻。加入1μl生物素標記探針水溶液（140fmol）和1μl32P探針（1.4fmol），2μlT4連 接(約0.1WeiSS單位，用5×連接緩沖液稀釋)。5X連接緩沖液：250mmol/LTris-HCl， Ph7.5;500mmol/LNaCl;500mmol/LMgCl2;25mmol./LDTT;5mmol/LATTP;500μg/μlBSA。 不同寡核苷酸與底物反應的連接所需酶液度不同，OLA試驗時，一定要小心滴定最適 酶濃度，提高連接溫度（50℃）可擴加OLA的特異性。混勻，在100%濕度下於37℃作用1h。加入1μl1mol/LNaOH，混勻，室溫下作用10min。加入1μl1mol/LHCl中和。加入2μl10%SDS，3μl15%（w/v）鏈霉親和素包被的瓊脂糖懸液，混勻後室溫作用 10min。將一事先用0.5%奶粉-0.1%SDS-100μg/ml蛙精DNA煮過的Whatman4號濾膜置於點樣器 上，然後，將微孔板內混合液加入點樣孔內，真空抽濾點膜。再用數毫升1%SDS和 0.1mol/LNaOH分別依次抽洗膜。取下膜，用塑料保鮮包好進行放射自顯影。打點雜交當擴增產物是多條帶時，用點雜交更合適。這種方法的基本過 程是，首先將擴增的DNA固定到尼龍膜或硝酸纖維素濾膜上，再 用放射性或非放射性標記的探針雜交。點雜交還有助於檢測突變 DNA的突變類型，用於人類遺傳病診斷和某些基因的分型。放射性同 位素32P標記的寡核苷酸探針檢測的敏感性、特異性和方法的可靠性 均不容懷疑，對人們認識某些疾病與基因變異的關系起了很大的作 用。但是，由於同位素不穩定和放射性危害，不能常規用於臨床或 法醫檢驗。因而用非放射性物質（生物素、和地高辛等）標記的寡 核苷酸探針分析PCR產物以確定核酸序列變異則是一種簡便而安全的 方法。非放射性標記物質穩定性高、使用方便、安全、檢測速度 快。因此，本節僅敘述非放射性標記探針的點雜交與檢測情況。
膜的制備：點雜交膜的制備有兩種方法，一是將擴增產物直接固定於膜上，每 一個探針制備1張膜。然後，用不同的等位基因特異或某一微生物特 異探針在嚴格條件下雜交來檢測擴增產物的突變類型或鑒定病原 菌；另一種方法是將不同的探針固定到尼龍膜上，然後，用標記的 PCR產物作探針去雜交。這樣，根據雜交點的位置即可判斷產物序列 變異的種類。顯然，前一方法較後一方法繁瑣，費時，費力；而後 一方法僅需一次雜交即可判斷結果。產物的固定：⑴取1張帶正電荷的尼龍膜，按點樣器的 大小裁剪膜，並做好標記。⑵將膜浸入水中濕透至少 1min。⑶變性PCR產物：此步可在圓底微孔板或微量離 心管內操作。每點的變性方法為；5～20μl(50～100ng)PCR 產物與100μl變性液（0.4mol/LNaOH-25mmol/LEDAT） 混勻，室溫作用5min即可。⑷小心將預濕的膜裝在點 樣器上，注意膜與點樣器接觸表面不能有任何氣泡。 因氣泡會使點樣點呈環形或月牙形或樣品間彌散融 合。膜固定後，每孔內加100μl變性混合液，打開真空泵。⑸抽干變性液後，每孔內再加100μlTE緩沖 液，真空抽濾「洗滌」樣品。⑹取下膜，置於厚3mm濾 紙上漬干。重復制備用於其它基因探針的膜時，一定要認真清洗點樣器，以免樣品間的交叉污染。⑺漬干 的膜於80℃真空干烤1h或於254nmUV光源下以60～120mJ/cm2 的強度下照射使DNA固定在膜上。此時，的膜可直接用 於雜交，也可以用濾紙包好存於塑料袋或乾燥缸內。探針的固定：因寡核苷酸的探針太短，在膜上固定較 困難，即使固定上，也會影響雜交。這就是需要將寡 核苷酸探針用末端轉移酶加polydT尾後，UV線照射固 定。因為UV可激活胸腺嘧啶，使其與尼龍膜上的氨基共價結合，使探針間接地牢固地固定在尼龍膜上。這 種加尾固定的探針不影響雜交。但這種雜交對固定探針的要求是，在同一條件下與PCR產物的雜交必須是特 異的。通過選擇探針的合適長度，G+C含量或通過改變 探針的固定可達到特異性的要求。這種固定的探針可 用於檢測人類基因的突變，也可用來檢測病原微生 物。
(1)加尾反應是用脫氧核糖核酸末端轉移酶（TDT）催化，它可將dT依次加在寡核苷酸的3』端，在四種脫氧 核苷中，以dT加尾效果最好。通過改變dT濃度和TdT量 可調節加尾長度，在下述反應條件下，加尾長度可達 400個dT。①向一微量離心管中依次加入：寡核苷酸探 針，100～200pmol;10×TdT緩沖液(1mol/L二甲胂酸鉀; 250mmol/LTris-HCl，Ph7.6;10mmol/LCoCl2;2mmol/LDTT) 10μl;dTTP80～110nmol；TdT，60～80U；補水至100μl。 ②混勻後，稍加離心，置37℃水浴60～90min。③加入 100μl10mmol/LEDTA終止反應。加尾長度可通過10%聚 丙烯醯胺凝膠電泳監測。(2)點膜：①加尾探針6pmol，用0.3mol/LNaOH室溫處理5min，然後，用2.5mol/LNH4Oac中和。②加入等體 積6×SSC(1×SSC:0.15mol/LNaCl，0.015mol/L檸檬酸三 鈉pH7.0)。③將6×SSC預濕的尼龍膜（zeta-probe）或 hybond-N固定在點樣器上。④點樣方法同上。(3)固定：①小心取下膜，置於TE緩沖液飽和的4～6 濾紙上，DNA面朝上。②將濾紙和膜一起置於254nmUV 燈下照射固定，poly(dT)400尾的探針在40mJ/cm2r的 劑下固定效果最好。輻射劑與給定光源對給定面積的 能量釋放率（輻照度）和輻照時間有關。一般對一個 固定光源而言，輻照劑量為：輻照劑量（J/cm2）=輻照度（w/m2）×輻照時間(s)其中，J為輻照能量單位；w為輻照通量單位。輻照度 與照射角度有關，與入射角度θ的餘弦（cosθ）呈正 相關。③固定後，在100ml6×SSC-0.5%SDS液中於42～55℃ 漂洗30min左右。漂洗後可立即用於雜交，也可以在蒸溜水中浸洗，晾乾後室溫保存。
探針的固定量與加尾長度均影響雜交結果。如用poly (dT)400尾的不同固定量的探針與等PCR產物（2.33fmol） 雜交，固定6pmol苷酸雜交時，有29.2%的PCR產物與 1.1%的寡核而固定的探針600fmol雜交時，僅有2.2%的產 物與0.8%。用不同加尾長度的等量產物6pmol固定寡核苷酸與（時，僅0.33%233fmol）雜交結果表明， poly(dT)300探針與產物雜交；而有1.3%的探針poly (dT)400時，則與產物雜交。因此，固定的探針加最好 在400個以dT尾上，固定量也至少6pmol。雜交寡核苷酸探針的雜交：每一寡核苷酸探針均有自己的雜交溫度和漂 洗條件，主要取決於探針的Tm值。Tm值則受探針長度，G+C含量和雜 交液的鹽渡影響。一般要由如下公式：Tm=4(G+C)+2(A+T)來計算Tm 值。在1mol/L鹽濃時，雜交溫度可比預測的寡核苷酸Tm值低5～20℃。 提高雜交溫度和降低鹽濃度可提高雜交的嚴格性。漂洗液一般不含 鹽，漂洗溫度比雜交溫度低5℃。一旦確定了探針的雜交與漂洗條 件，可按下述方法進行雜交。⑴在（2×SSPE3.6mol/LNaCl：; 200mmol/LNaH2PO4;20mmol/LEDTA，Ph7.4）液中預濕點樣膜。⑵置 膜於塑料封口袋中，並加入適量雜交液（SSPE，5×Denhardt液， 0.5%TritonX-100），封口。袋內不要有氣泡。⑶置於水浴加熱搖 動，在雜交溫度下預雜交5min。⑷取出塑料袋，剪開一角。加入非 放射性標記物（如生物素-補骨脂素）標記的探針。每毫升雜交中加 入1pmol探針。封口後搖育20～60min。雜交時間不能太長，否則會 引起探針與膜的不可逆結合。⑸從袋中取出膜，室溫下在漂洗液 （SSPE-0.1%TritonX-100）中洗1～2次。⑹漂洗溫度下預熱的漂洗 液在合適溫度下洗10min。漂洗後的膜可用於顯色檢測。
反向點雜交：反向點雜交即擴增產物作為相中的探針與固定到膜上 的寡核苷酸雜交。如前述，這種雜交最基本的要求就是在同一條件 下，所有固定探針均與擴增產物特異雜較。為此，主要是認真選擇 與設計寡核苷酸探針，使各探針在同一條件下Tm值相近。在同一雜 交特異。一旦確定了合適的雜交和漂洗條件，即可按上述基本程度雜交。只是雜交探針（產物）在加入前應加熱變性或用等體積的 400mmol/LNaOH-10mmol/LEDTA變性。雜交時間（2～4h）要長些。PCR 產物的標記可以用標記引物擴增或在擴增時摻入標記物。雜交的檢測不同非放射性標記物的檢測原則上基本相同。若為酶標探針則可直接進行顯色檢測。下面以生物素標記物為例加以說明。酶標親和素的結合 ⑴漂洗後的膜在緩沖液A（PBS，100mmol/LNaCl，5%TritonX-100） 中與一定濃度的HRP-標記鏈霉親和素在室溫作用10min，並輕輕振 盪。⑵用緩沖液B（液A，1mol/L尿素，1%硫酸葡聚糖）在室溫下漂 洗5min，並輕輕振盪，將膜上非特異吸附的HRP-鏈霉親和素洗掉。顯色不同酶標親和素的顯色條件與底物均不同，下面以HRP的顯色加以說 明。⑴將上述膜於緩沖液C（100mmol/L檸檬酸鈉，pH5.0）中在室溫下作 用5min，並輕輕振盪。⑵在緩沖液D中室溫下，輕輕振盪10min。此步應避強光。緩沖液D： 1份底物（TMB：2mg/ml，用無水乙醇配製）和19份緩沖液C。⑶在緩沖液E中顯色，該液應現用現配。應避強光。緩沖液E：2000 份緩沖液D和1份3%H2O2。顯色時間取決於雜交體中含標記物的量； 一般為1～15min即可。雜交陽性呈深藍紫色。⑷當膜色（信/噪比）合適時，在液C中洗膜1h終止反應，在此過程 中應更換2～3次液體。⑸雜交膜可拍照記錄結果，也可封於緩沖液C避光條件下貯存。膜的再利用⑴脫色：將膜置於0.18%Na2SO4液中即可脫掉膜上的顏色。 ⑵去雜交的探針：將膜置於水-0.5%SDS中，65℃加熱1h。 ⑶這種處理的膜可再與另一種探針雜交。
問題與對策信號弱：①點膜的產物少-增加點膜量；②雜交時探針濃度低-加大 探針濃度；③雜交漂洗過於嚴格-增加鹽濃度或降低雜交溫度；④TMB 液貯存時間過長（TMB液4℃可存2個月）-重新配製。本底信號強：①雜交時探針濃度高-降低探針濃度；②雜交時間長- 縮短雜交時間；③雜交漂洗不嚴格-降低鹽濃度和提高雜交溫度；④ 顯色時間長-縮短顯色時間。雜交膜的高本底著色：①同②；②在緩沖液C中洗膜時間短-延長漂 洗時間（過多的硫酸葡聚糖也能增加膜的本底著色；③同2④；④避 光不嚴格-顯色過程中及顯色後要確保雜交膜的避光。陰性對照出現陽性信號：①點樣混淆，即把陽性標本點於陰性對照 的位置，重復實驗即可糾正；②PCR較物的殘留污染，用新配的試劑 重復全部擴增反應。（我自己加進的：Hybond—N+：Hybond-N+是帶正電尼龍膜，對在鹼性條件下雜交和普通的Southern雜交均有很好的靈敏性，故核酸樣品可通過簡單的鹼處理固定在膜上，而不必在紫外燈下固定，盡管紫外固定的重復性最好。）
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PCR擴增產物的分析方法
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PCR擴增產物的分析方法
微孔板夾心雜交法
顏色互補分析法
PCR-ELISA法
PCR-OLA法
PCR-打點雜交法
微孔板夾心雜交法：
該法是通過一固定於微孔板的捕獲探針與PCR產物的某一區域特 異雜交使產物的間接地固定於微孔板上，然後，再用一生物素 等非放射性標記物標記的檢測探針與產物的另一特異性較一次 雜交，漂洗後顯色即可判斷結果。該法需要兩個雜交過程來檢測 一個產物，因此，其特異性較一次雜交的檢測法高。該法已用於HBV 的檢測，其敏感度可達5個HBVDNA分子。此法的敏感性和特異性與 PCR32P探針的

㈢ 鏈霉親和素的介紹

鏈霉親和素(streptavidin下稱SA)是與親和素(avidin下稱AV)有相似生物扮扮學特性的一種蛋白質，是好缺顫streptomyces avidinii菌的分泌物，其分子量及結合生物素的能力與雞蛋友敗清中的親和素相似，等電點6.0，非特異性結合遠比親和素低。

㈣ 單細胞測序能弄成二維嗎

用於單細胞測序的細胞條碼化的製作方法
admin 2022-06-16 06:16:13 8次
該技術已申請專利。僅供學習研究，如用於商業用途，請聯系技術所有人。
用於單細胞測序的細胞條碼化
1.相關申請的交叉引用
2.本技術要求2019年11月4日提交的，題為「用於單細胞測序的細胞條碼化」的第62/930,288號美國臨時專利申請的優先權，其全文通過引用納入本文，用於所有目的。
3.發明背景
4.目前的液滴微流體方法實現了數千細胞的通量。然而，更大的數量可能難以實現。使用微流體技術，至少有三個導致細胞懸浮液死體積和因此用於分析的細胞丟失的因素：1)微流體裝置的入口處的剩餘液體2)微流體通道肢培預劃分中的剩餘液體和3)未從微流體裝置的出口處收集的材料。此外，非常大的液滴乳化體積，對應於高細胞通量實驗，很難以及時的方式產生，由於所需的體積。這可能對於細胞活力和細胞內含有的不穩定的核酸底物(如rna)有不利影響。最後，當產生較大的液滴乳液時，其增加的體積使其難以將單個乳液裝載入與熱循環儀兼容的單管中，從而進一步限制了大乳液體積的實施。
5.單細胞條碼化平台需要昂貴的微流體技術(晶元、油和儀器)和條形碼珠。儀器還需要昂貴的現場服務工程師來維護和解決硬體問題。
6.雖然液滴微流體技術改進了可擴展性，除非使用更復雜的晶元上(on-chip)液滴合並和皮注射(picoinjection)功能，否則只支持添加一種溶液。
7.用寡核苷酸直接標記細胞是使用寡聚物-偶聯珠的選擇。然而，在不破壞細胞生理的情況下，裝載到細胞上的寡核苷酸的最大數量約為100-1000萬。在nl大小的液滴中，寡核苷酸的終濃度往往將不足以驅動分子生物學反應，因此阻止液滴亮圓與直接寡核苷酸標記的細胞兼容。
8.發明概述
9.高密度寡核苷酸，范圍達到106至107個分子，可以通過各種方法附接至細胞。例如，可以通過細胞特異性寡核苷酸偶聯抗體(stoeckius等2018，genome biology)或通過脂質修飾的寡核苷酸(mcginnis等2019，nature methods)標記細胞。寡核苷酸細胞附接創造了直接在細胞上構建細胞條形碼的可能性，例如，通過拆分匯集條形碼構建(fan等2015，science)。這些細胞條形碼反過來可以用於條碼化靶向的細胞的核酸底物。
10.以前，這種形式的細胞條碼化的一個要求是，在寡核苷酸裂解或從細胞釋放之前，細胞與附接細胞條形碼寡核苷酸的互補物必須被共同限制在分區中，此時可以發生與細胞核酸底物的附接。雖然液滴提供劃分格式用於這種類型的反應，但是存在一些缺點。首先，單個乳液中液滴的數量上限是約100-200萬。為了盡量減少多個細胞共同定位於單個液滴中，可以以大約0.05-0.1的λ裝載細胞。基於每個乳液的液滴數量，封裝的細胞的數量被限制在最大50,000至100,000。這種細胞通量對於某些類型的實驗可能是不足夠的，且受到向上可擴展性的限制。第二，由於入口處、微流體和液滴中剩餘的細胞懸浮液不能從出口處收獲，使用液滴微流體技術的細胞損失很難消除，導致細胞利用率為約60-85％。對於珍貴的細胞，這種水平的細胞利用率可能是不足夠的。第三，液滴微流體技術需要晶元、油和儀器，都昂貴且難以支持。第四，在已經形成的液滴中加入試劑並在保持液滴的同時洗滌產物，雖然通過皮注射、液滴合並和磁珠捕獲方法是可行的，但不容易工程化。這敬飢塌種限制使得單細胞
dna分析困難，因為簡單的液滴微流體技術不支持蛋白酶k消化、隨後失活然後加入生物化學品。第五，因為只有100-1000萬寡核苷酸可以在不破壞膜的情況下被裝載到細胞上，液滴必須有幾十pl的體積，以提供足夠的寡聚物濃度以驅動分子生物學反應。這些小液滴可能很難通過兩個水性入口的微流體技術實現。第六，在進行條碼化反應之前，細胞通常必須被清洗以除去其培養基。這明顯增加了細胞損失。
11.本方法用液滴解決了上述限制，如下：在細胞上建立細胞條形碼後，用與細胞密度匹配的水凝膠溶液重懸細胞，使得細胞不沉降。這可以通過用於保持細胞懸浮的常用試劑實現，例如蔗糖緩沖、percoll(西格瑪(sigma))和/或optiprep(西格瑪)。然後接著發生水凝膠的固化(solidification)。固化背後的機製取決於用於水凝膠的材料。例如，瓊脂糖的固化會由溫度下降引起。或者，藻酸鹽可以使用鈣交聯。或者，temed啟動了聚丙烯醯胺單體的交聯。因此，細胞被分散在整個固化的水凝膠基質中。
12.水凝膠可以經或不經修飾以結合細胞條形碼寡核苷酸。例如，細胞條形碼寡核苷酸可以在5』端用生物素修飾，親和素類似物(例如鏈霉親和素)可以被偶聯至水凝膠材料。因此，當在溶液中時，帶有結合的寡核苷酸的細胞將自由移動，然而，一旦水凝膠固化，任何釋放的寡核苷酸將在細胞膜的直接的附近結合至基質，在細胞膜存在的地方形成殼或皮。例如，0.01至10％重量/體積(wt/vol)的水凝膠對離子和非離子去污劑、以及低分子量蛋白質、酶和輔因子是多孔的。因此，在將細胞捕獲在水凝膠基質中之後，細胞裂解劑(例如0.1％np-40)可以被應用於細胞。裂解劑將通過基質擴散並裂解細胞。細胞條形碼寡核苷酸裂解或釋放將作為細胞裂解和膜溶解的直接結果發生，或通過特異性或非特異性試劑從細胞裂解或釋放寡核苷酸。然後釋放的細胞底物核酸將結合至細胞條形碼寡核苷酸，其已經被固定在細胞膜/水凝膠界面的殼中。
13.通過細胞/水凝膠界面圈起來的區域的體積基本上是細胞的體積。無論細胞條形碼寡核苷酸是否被固定在寡核苷酸的殼上，這種最小體積將顯著增加細胞條形碼寡核苷酸的有效濃度，達到最大值。這可以補償，例如，對於在不影響細胞生理的情況下可以被裝載到細胞上的細胞條形碼寡核苷酸數量有限，例如，每個細胞100-1000萬寡核苷酸。對於直徑約為9微米的細胞，用200萬寡核苷酸的有效濃度將是幾百個nm，其為足以支持大多數分子生物學反應(例如逆轉錄)的濃度。低分子量rna或dna依賴性聚合酶可以與裂解劑一起或之後加入，也可以在中間的洗滌之後加入，以除去或滅活細胞裂解劑。
14.一旦細胞底物核酸加細胞條形碼寡核苷酸標簽，導致細胞條碼化發生，在從固化或未固化的水凝膠基質除去材料之後，文庫制備的最後步驟可以在水凝膠基質中或溶液中發生。例如，逆轉錄酶，由於其低分子量，將流經組合物中高達5％的水凝膠。將其與裂解劑一起，或是與或不與寡核苷酸裂解/釋放劑一起應用，將導致以下事件。隨著裂解劑溶解細胞膜，細胞條形碼寡核苷酸將結合至水凝膠以在細胞膜存在的位置形成殼。釋放的rna將結合至在細胞膜存在的殼上固定的寡核苷酸，逆轉錄酶將合成cdna。這就是條碼化反應。一旦發生，水凝膠可以被溶解，制備ngs文庫的最終步驟就可以批量完成。
15.上述工作流程都不需要微流體技術(晶元、油和儀器)，且批量發生。這種形式的一個好處是可支持多步驟反應。例如，如果需要dna基因型信息，流經水凝膠的第一試劑可以是蛋白酶k，例如熱敏蛋白酶k。其將消化核小體和染色質輔助蛋白，使dna可及於進一步的分子生物學。通過對細胞膜的破壞，細胞條形碼寡核苷酸可以在細胞膜存在的地方結合形
成殼。蛋白酶k可以失活，dna聚合酶與試劑一起流入水凝膠中，例如，可以發生通過模板導向-dna合成條碼化。一旦條碼化，文庫制備的最後步驟可以在水凝膠內部或外部進行。
16.細胞可以在其原始培養基中與水凝膠材料混合。一旦固化，可以洗滌水凝膠以去除培養基。此外，由於每個細胞都會有一組細胞條形碼克隆的寡核苷酸，所以水凝膠基質中捕捉的每個細胞會被條碼化。這兩個因素將細胞利用率從起始材料增加到接近100％。
17.在一些方面，提供個體細胞或個體細胞核和交聯水凝膠的混合物。在一些實施方式中，個體細胞包含附接至個體細胞的細胞膜的異源寡核苷酸，或個體細胞核包含附接至個體細胞核的核膜的異源寡核苷酸。
18.在一些實施方式中，個體細胞包含錨定於個體細胞的細胞膜的異源寡核苷酸，或個體細胞核包含錨定於個體細胞核的核膜的異源寡核苷酸。在一些實施方式中，異源條碼化寡核苷酸包含脂質部分，其中脂質部分將異源條碼化寡核苷酸錨定在細胞膜中。
19.在一些實施方式中，水凝膠被共價連接至對異源寡核苷酸具有結合親和性的分子。在一些實施方式中，水凝膠被非共價連接至對異源寡核苷酸具有結合親和性的分子。在一些實施方式中，該分子選自下組：生物素、鏈霉親和素、抗體、適配體、鎳(ni)、銪(eu)或包含至少6個連續核苷酸的序列的多核苷酸，其與異源條碼化寡核苷酸中的序列完全互補。
20.在一些實施方式中，所述細胞是哺乳動物細胞。在一些實施方式中，核或細胞包括片段化的核dna，其中片段化的dna在片段末端包含共有銜接子序列。
21.在一些實施方式中，水凝膠包括藻酸鹽、瓊脂糖、聚丙烯醯胺、殼聚糖、透明質酸、葡聚糖、膠原、纖維蛋白(fibrin)、聚乙二醇(peg)、聚(甲基丙烯酸羥乙酯)(聚hema)、聚乙烯醇(pva)或聚己內酯(pcl)。
22.在一些實施方式中，異源條碼化寡核苷酸包含細胞特異性條形碼序列和3』序列。在一些實施方式中，3』序列是至少5個連續的胸腺嘧啶的多聚t序列。在一些實施方式中，3』序列是至少5個(例如至少8個、至少10個、至少12個，例如6-30個)連續核苷酸的隨機序列。在一些實施方式中，3』序列是至少5個連續核苷酸的目標基因特異性序列。在一些實施方式中，3』序列是至少5個(例如，5-100個，5-25個)連續核苷酸的銜接子。在一些實施方式中，銜接子可以在例如來自細胞或核的片段化dna的末端於共有銜接子序列互補。
23.在一些實施方式中，異源條碼化寡核苷酸還包含5』pcr柄(handle)序列。
24.在一些方面，提供了將細胞特異性條形碼加標簽到細胞核酸的方法。一些實施方式中，所述方法包括：提供(i)具有附接至細胞的細胞膜的異源條碼化寡核苷酸的細胞或分離的細胞核或(ii)包含附接至個體細胞核的核膜的異源寡核苷酸的細胞核；混合該細胞或核與液態水凝膠；在該細胞或核周圍交聯水凝膠，其中水凝膠形成固體凝膠；從細胞膜或核膜釋放異源條碼化寡核苷酸以產生釋放的異源條碼化寡核苷酸；允許該異源條碼化寡核苷酸從細胞膜或核膜釋放以定位在細胞或核周圍的固化的水凝膠上；將異源條碼化寡核苷酸附接至細胞多核苷酸或其拷貝或其cdna上，以形成條碼化細胞多核苷酸；並溶解固化水凝膠或從固化水凝膠中提取條碼化細胞多核苷酸，從而從水凝膠中釋放條碼化細胞多核苷酸，從而將細胞特異性條形碼加標簽到細胞核酸上。
25.在一些實施方式中，允許包括將從細胞膜或核膜釋放的異源條碼化寡核苷酸結合至細胞或核周圍的固化的水凝膠。在一些實施方式中，允許包括將從細胞膜或核膜釋放的異源條碼化寡核苷酸擴散至細胞或核周圍的固化的水凝膠，使得異源條碼化寡核苷酸定位

㈤ 什麼免疫PCR（Immune PCR）

博凌科為-為你解答：所謂免疫PCR（Immune PCR）就是利用抗體與DNA特異結合來檢測抗原，把抗原抗體反應與PCR聯合應用而建立的一種抗原檢測系統。 在免疫PCR中，一個中介分子同時具有與DNA、抗體分子特異悶猛結合的能力。其一端連接DNA（標記 物），另彎彎一端連接抗原-抗體復合物，形成一個特殊的抗原-抗體-DNA連接物。作為標記物的DNA分子可用PCR的擴增，存在特異的PCR產物應證明作為 標記物的DNA分子已特異地與抗原埋罩悶-抗體復合物結合，而且表明了抗原的存在。有人採用SAP（streptavidin protein A）嵌合體作為中介物。它具有雙特異性結合能力，一端為鏈霉親和素，可結合生物素；另一端為可與IgG的Fc段結合的蛋白A。這樣可特異地把生物素化的 DNA分子和抗原-抗體復合物連接在一起。 選用BSA作抗原進行免疫PCR實驗，結果表明，可檢測出580個抗原分子（9.610-22mol/L）， 而且可以完全避免其它非特異信號的干擾。與採用鹼性磷酸酶的ELISA相比，其靈敏度可提高105倍，較常規的放名分析靈敏度也高出幾個數 量級。 免疫PCR產物在普通的瓊脂糖電泳上就可以檢測出來，如用更好的方法來檢測PCR產物，如放射性同位素，熒光物或酶等摻入到PCR產物中，可進一步提高其靈敏度和適用性。另外，如果採用不同大小標準的DNA 進行標記，在電泳時，可同時檢測出多種不同的抗原分子。 PCR產物的多少與抗原結合量有關，如果用標准反應作對照，則可以對抗原的量進行估算。因此，通過改變 連接物的濃度就可以改變檢測系統的靈敏性。其它因素，如抗體的濃度，PCR循環周期數，PCR產物的檢測方法等也同樣影響系統的靈敏性。

㈥ 鏈霉親和素植物表達

鏈霉親和素植物表達是鏈霉親和素具有與親和素(Avidin,AV)相似的生物學特性，如都能與4分子的生物素（Biotin）特異性結合，結合常數為1×10-15/M。同時，由於SA不帶糖基、等電點低，在檢測中具有比AV低的背景而大大提高了檢測的靈敏性。
Streptavidin－biotin系統可偶聯抗原、抗體、酶、寡核苷酸分子以及PE等熒光物質，因此，Streptavidin-biotin被廣泛用於生物反應檢測系統，用以檢測抗原、抗體及核酸分子。

目前，國內外大部分基於酶聯免疫反應、熒光分子標記免疫反應和分子雜交為原理的各種檢測試劑盒均採用SA-biotin系統。但目前，國內所用SA均為價格昂貴的進口產品，因此研製和生產國產化的SA具有重要的現實意義和廣闊的應用前景。

鏈霉親和素與 生物素-構成鏈霉親和素-生物素放大系統,是二十世紀七十年代後期發展起來的一種生物反應放大系統，通過一分子親和素和四分子生物素之間特異結合實現信號放大，還可以通過多級級聯放大實現信號多級放大，在生物學特別是免疫檢測中有越來越廣泛的用途。

鏈霉親和素是與親和素具有相似性質的一種蛋白質，都具有與生物素特異結合的能力，結合常數高達1015M。同時，由於鏈霉親和素等電點比親和素低，且不含糖基鏈，故在檢測中的靈敏度和特異性都高於親和素，建立在此基礎上的生物素-鏈霉親和素系統的應用比生物素-親和素系統有更大優勢。

我公司生產用鏈霉親合素-SA菌株及生產工藝均自國外原本帶回。生產工藝穩定，保證質量，常年提供產品，確保供應。

我公司生產的SA單體經SDS-PAGE檢驗分子量為17.2KDa。經論證，完整的SA溶解性差、易於聚集，核心SA被蛋白酶水解掉了與活性無關的某些末端序列，一方面提高了結構的穩定性；另一方面由於減少了空間位阻，使SA更容易與生物返族前素標記的大分子發生反應。

SA的純化是用2-亞氨基生物素瓊脂糖珠4B 凝膠(Sigma 產品)進行親和層析純化，同時以離子交換進行進一步的精細純化。

SA，分子量穗做為58KDa,生物活性15.7U/mg，接近理論值（16.8U/mg）並進行了活性測定。

SA溶解漏清與保存：我公司提供的SA產品，不含任何鹽離子，用戶可以根據自己的試驗需要，使用不同的緩沖液進行溶解，溶解後應放與-20°C保存，避免反復凍溶。

㈦ 怎麼樣在CA中篩選出包含一特定結構的新物質

摘要：大腸桿菌可以應用介電電泳從含有人血細胞的混合物中分離出來，然後在一個微構造生物電子晶元上通過蛋白水解消化電子溶解。鉑微電極利用交流電場分離細菌至25個微位置，這些位置上每個都有一個附加的鉑微電極，電極直徑是80μM，相鄰電極中心間的距離是200μM。細菌分離後用一系列高電壓脈沖溶解，溶解產物包括有一系列的RNA、質粒DNA和基因組DNA。溶解產物進一步在另一個生物電子晶元上用電來提高雜交進行檢測分析。介電電泳分離細胞後，然後在一個電子活躍的晶元上進行的電子溶解和消化，這種方法可能作為樣品的分離在一個完整的DNA/RNA分析系統中，作為用於晶元雜交分析的樣品制備過程中可能很有潛力。

用於生物分析特別是用於DNA雜交的微型生物晶元，包括樣品的制備及檢測的整套系統中具有很大的潛力。這樣的一個系統中的第一部分的結束即樣品的制備，在整個過程中證實是最難者隱整合的部分。

目前已經開發了好幾種分離細胞的方法。微小的硅玻璃濾過晶元可用來從人全血細胞中分離白細胞，通過加熱可以從這些首世廳分離的白細胞中提純溶解產物，這些產物可直接在同一張晶元上進行PCR擴增。已有人做過用在矽片的基質上刻蝕著許多微電極的微構造機械篩床通過電脈進行細胞分析。細胞的運輸是通過電滲和電泳泵完成的，隨後在在微構造上進行細胞的化學溶解。此外，在所有用晶元進行細胞分離的技術中，介電電脈法分離細胞是應用最廣泛的方法之一。極化顆粒包括那些沒有凈電荷的粒子，在非均一的電場中受到電泳牽引力的作用，其條件是這些顆粒有效的極化作用與周圍介質的有效極化作用是不同的。不同細胞類型移動的方向決定於（1）與表面電荷相關的電子雙層外膜（2）細胞膜或細胞壁的傳導性和介電常數（3）形態和結構。介電電脈已用於分離那些攜帶活的或無活性的人群、革蘭氏陽性和陰性菌、病毒和癌細胞。

我們報道在一個微構造晶元上，根據提取的RNA 和DNA的電子擴增雜交這一電子樣品制備過程的進展。樣品制備過程始於從血細胞中分離大腸桿菌，該過程通過在一個覆蓋有25 個特定位置的微電極的矩陣的一個硅晶元上介電電脈進行的。被分離的細菌在血細胞被洗脫後依然存在於電極上。原核細胞通過這種方法進行分離，然後通過提供一系列高電壓脈沖進行電溶解，提取出一系列的核酸。提取的RNA和DNA然後運用生物晶元進行分析。

結果

從血細胞中介電電泳分離大腸桿菌、分離的大腸桿菌電子溶解、用蛋白酶K消化蛋白質都在一個流動池中一張微生物電子晶元上完成。為了提供介電電泳的交流電場，嘗試兩種不同確定位置的模式。圖1表示5×5電極矩陣的square-wall和checkerboard兩種方案的圖解和對應的從交流電場（10KHz正弦波，相鄰峰至峰10V）計算而來的對應的計算機模型。在square-wall模式中位置的確定,相同方框中的電極與相鄰的最近的框中的電極有相反偏電壓。Checkerboard模式中，每一個電極與相鄰的最近的電極有相反的偏壓。這個電場分布模型表明一個電場的有規律分布能夠應用用Checkerboard定位模式得到，但是這種模式應具有在電極和電極周圍的最大值之間的整個范圍內的確定范圍的最小值。相反，這種模型也表明，雖然區域的最大值固定在電極上，但是square-wall模式產生的區域最小值被播散。

圖1：（A）和（B）分別為兩個5×5的電極的定位Square-wall格式和checkerboard 格式；（C）和（D）分別為交流電場分布的相應的計算機模式，顏色從紅、橘紅、橘色、黃色、綠色和蘭返沒色分別代表從最高到最低的電場梯度。

圖2. （A）和（B）分別為經過預打濕的Square-wall和checkerboard經過覆蓋的晶元；（C）和（D）為兩種定位格式的分離結果（電場最大區域為白色陰影區，電場最小區域為紅色陰影區）；（E）和（F）是兩種格式經過完全的清洗過程。

圖3. 通過電解得到的大腸桿菌的核酸的瓊脂糖分析。1為λDNA Hind III 酶解的標記；6為ΦX174 Hae III 酶解的標記；2為超螺旋的pCR2.1質粒；3為線性的pCR2.1質粒；4為經過RNase酶解的電解液；5為未經RNase酶解的電解液。

圖4 從大腸桿菌的電子溶解液中提取的質粒DNA的雜交。電極模式依據X-Y軸的格式進行設計的，X軸是從上開始，Y軸是從左開始。（A）在5-5位置電極上的是用來證明捕捉探針的黏附性及電子雜交的特異性的合成的寡核苷酸RCA5，被與之互補的探針ATA5被定位於5-5點，與之不互補的探針被定位於5-4點，在4-5點沒有探針。（B）以下點為合成的對照靶標的雜交 點1-5為互補的探針；點1-4為非互補的探針；點。點3-1為大腸桿菌基因組DNA溶解液對照的電子雜交，點3-5為沒有插入片段的質粒DNA溶解液對照的電子雜交。3-2和3-4分別為具有與插入片段互補的探針；在以下點表明具有插入片段的質粒的不同稀釋濃度的雜交：5倍稀釋，點1-1，1-3，2-1和2-3為具有互補探針的點，點1-2和2-2為具有非互補探針的點；3倍稀釋，點4-1；4-3，5-1和5-3為具有互補探針的點，點4-2和4-4點為非互補探針的點。

圖5 應用電子溶解從大腸桿菌中提取的RNA的雜交結果。合成的對照靶標RCA5被電子定位於點1-5和1-4，1-5上具有互補的探針，1-4上具有非互補的探針。溶液被定位於在1和3列上，這些點沒有進行嚴謹性過程的雜交，點1-1和點1-3為3倍稀釋的材料，點2-1，2-3，3-1和3-3為5倍稀釋的材料。（B）為應用電子嚴謹性包含RNA的溶解物的夾心雜交的結果。列1和列2 應用負偏壓去掉沒有雜交的核酸；在列1中的點包含有特異性探針，在列2中的點含有非特異性的點。列3是沒有經過副偏壓提高嚴謹性的特異性雜交的結果。

在採用介電電脈從血中分離大腸桿菌之前，用分離緩沖液沖洗晶元，把滲透膜打濕，並且去除任何水泡。在實驗開始時，用預洗過的square-wall式（Fig.2A），電極表面出現黑色，在細胞混合物被引導到流動細胞後分離近4分鍾結束。分離的結果（Fig.2C）與區域分離模型（Fig.1C）比配。大腸桿菌占據電極的整個區域（電極上的白色陰影部分對應最大區域），血細胞在電極之間（紅色陰影、V型部分對應最小區域）聚集。然後，用分離緩沖液沖掉在電極之間的最小區域鬆散聚集的血細胞。在沖洗過程中，因為交流場持續存在，分離後的大腸桿菌依然在電極的最大區域上。沖洗完成後，分離的大腸桿菌在所有25電極上（Fig.2E）顯示為白色陰影部分。

也可以用checkerboard模式（Fig.2B），在細胞混合物被引導到流動細胞後近4分鍾分離結束，分離的結果（Fig.2D）與區域分布模型(Fig.1D)相匹配，電極上的白色陰影部分表示保留的細菌細胞的所在地，紅色陰影部分表示在最小極聚集的紅細胞和白細胞的混合物，在沖洗階段將聚集在最小極的血細胞去除。單個大腸桿菌與紅細胞不能被溶解有2個原因（Fig.2D），首先這些細胞相對於電極的直徑（80μm）來說非常小（<5μm）；其次因為通過介電電脈分離的細胞是個被稱作「珍珠鏈」的三維形式存在，用我們的裝置來使所有的細胞聚集是很困難的。

電溶解是應用在四個相反電極和25個更小的細胞聚集電極之間一系列脈沖（500V400脈沖帶每20脈沖交替的電極脈寬50μs）進行的。為了使沖洗緩沖液中的蛋白酶K能夠消化污染的核酸蛋白質，晶元上的溶解混合物在50℃下培養20分鍾。瓊脂凝膠電泳(Fig.3)結果表明質粒、基因組RNA和DNA二者都能從細胞中提取出來，基本上對核酸無明顯損害的。通過比較經過RNase A處理和沒處理的溶解產物來確定RNA帶。溶液經過RNase A消化後，所有小於1078bp的帶都消失，也就是說這些帶由RNA組成。同時，提取的質粒DNA保持超螺旋（無刻蝕）形式，與所買的超螺旋質粒相比較具有相同分子量。

對於雜交，消化溶解產物從細胞分離晶元上移出，用雜交緩沖液稀釋3倍和5倍，並加熱使其變質。然後將稀釋過的溶解產物轉移至分析晶元上，這些分析晶元表面覆蓋著鏈親和素瓊脂糖，並通過電定位在電極的特殊微位置上定位生物素捕捉探針。這些捕捉探針包括與插入在質粒中的片段互補的寡核苷酸，這一片段是沙門氏桿菌的Spa0區域來的296鹼基，與之互補的寡核苷酸探RCA5來自人的DQα基因，這些靶序列，包括溶解產物和與捕獲探針互補的含SpaO區域序列的模式靶樣寡核苷酸，通過一個夾心雜交過程進行檢測。在這個檢測過程，目的DNA/RNA首先與固定的捕捉探針進行雜交，然後被第二個探針進行結合，逐漸顯現出結果（第二個探針為含熒光團報告分子或標記探針）。

為了進行雜交，每個靶序列都是通過電子定位在分開的帶互補和非互補探針的微位置上（Fig.4），作為一個正對照，合成的靶樣RCA5帶有一個熒光集團，首先被固定在有互補和非互補探針的微位置上，化學固定和雜交工作如預期所想的。此外，在SpaO區域的固定著模式靶樣寡核苷酸探針的微位置上的信號水平幾乎是含非互補探針的微位置上的信號水平的2倍高。下一步，用RNase-A已消化了的含插入SpaO質粒和基因組的溶解產物被定位和雜交在選出的具有互補和非互補探針的微位置上。來自3倍和5倍稀釋的溶解產物與互補探針信號水平比非互補探針上的信號水平強4倍和2倍，這也證明雜交的特異性。作為一個附加的負對照，一個沒有嵌入Spa0質粒的溶解產物與不同微位置的相同探針進行雜交。如預期的那樣，在互補和非互補探針位置上的信號水平都低。

用RNase A處理溶解產物的雜交結果和對照結果表明電溶解產物經過加熱變質的質粒DNA能直接用於雜交分析。從稀釋3倍的溶解產物得到的信號水平與從模式靶樣寡核苷核得到的信號水平相當。

用沒有用RNaseA處理的溶解產物做相似的的雜交實驗。模式靶樣寡核苷酸作為一個正對照，可以看到一個特殊的電子雜交（Fig.5A）。包含RNA的溶解產物在雜交緩沖液中稀釋3倍或5倍，在特殊的微位置上進行電固定和雜交。為了提高雜交至溶解產物的16S核糖RNA的特異性，還試著用電來改進缺點，在互補探針的信號水平至少比非互補探針信號水平強4倍（Fig.5B），固定在捕獲探針上的模式靶樣寡核苷酸的信號水平幾乎是非互補探針信號水平的2倍。從電子溶解產物來的經過加熱處理的核糖體RNAs被直接用於雜交分析，同時包括一個嚴謹的洗滌過程。從稀釋3倍的溶解產物得到的雜交信號水平能夠與特異性寡核苷酸靶得到信號是相當的（Fig.5B）。

討論

從人血細胞中分離大腸桿菌是應用生物電晶元來完成的，這種晶元最初的設計是用來應用電子學來提高雜交分析的。從理論模擬和實驗結果表明用checkerboard定位模式應用介電電泳分離大腸桿菌，比用square-wall定位模式（即從最小極至最大極）產生的分離效果更好。在應用的區域進行明顯的分離，更容易洗去不想要的細胞。雖然用於該研究的晶元只有25個電極，但應用這種方法分離大腸桿菌用於質粒DNA和RNA雜交分析已經足夠了。通過用一個帶已提高密度的微電極的矩陣，在很短的時間內就能獲得想要細胞的高覆蓋區域。

晶元表面覆蓋著一層瓊脂糖滲透膜。這層膜能夠降低細胞的粘合力，由於這層膜的電場處於最小值，因此很容易將不想要的細胞洗去。這些分離的細胞也與金屬電極有一定的距離，因此被電極表面上發生的電化學所破壞的可能性很小。為了捕獲細胞的特殊類型，瓊脂糖膜能夠提供一個化學附著物的功能。例如，鏈球菌能被共價結合到瓊脂糖上，因此鏈球菌能夠用來固定生物素標記細胞特異性單克隆抗體。

帶有RNA靶樣的非特異性背景熒光較強。嚴謹的電子沖洗在產生非特異性信號方面，甚至在很低的電條件下都有效，這表明如果在那些必須檢測多拷貝的質粒DNA的實驗中，可以用直接信號檢測，不再需要用酶增殖法。

我們所選大腸桿菌和血細胞的混合物是個隨機的模型，我們也分離了溶血性鏈球菌（Micrococcus lysodeikticus）、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)和培養的來自血細胞的子宮頸癌細胞。這些細胞和其他細菌從混合物中的分離，表明電分離方法在醫學診斷、食物檢測、水質監測和其他領域中的應用有很大的潛力，通過電休克得到的從細菌提取的溶解產物包含一系列核酸其中除了瓊脂糖凝膠電脈能發現的最小的剪切物以外，還有RNA、超螺旋質粒DNA和沒有降級的高分子量的基因組DNA。用提取的質粒和RNA可獲得特殊的雜交信號。用基因晶元研究基因表達已經引起了很大的重視，用基因晶元進行RNA的雜交在檢測基因表達方面很有潛力。這里所用的方法可能證明在基因表達研究上很有價值，這個研究價值就在於它能從大量其他細胞中分離一些特殊類型的數量極少的細胞，用於一些特殊亞種群的RNA的研究。

雖然細胞分離和溶菌是在一張晶元上完成的，但是加熱變性和分裂以及雜交是在另一張晶元上。我們預測將來兩張晶元和所有過程（包括核酸在晶元上的擴增）能在一個簡單的盒子里。

實驗操作步驟

正如描述的那樣完成生物電子晶元的構造和增厚。

生物電子晶元的微構造：帶5×5鉑微電極的硅晶元是由標準的半導體技術加工成的，相鄰電極中心至中心的距離是200μm，每個電極的直徑為80μm，熱處理的氧化硅上噴上一層厚度為100nm的鈦－鎢層，然後再覆蓋300 nm厚的鉑層。金屬的圖形由光刻印刷技術與王水濕性方法完成。在此金屬圖形上通過原漿擴增和化學蒸發沉積低密度氮化硅（1.3μm）和氧化硅（100nm）的薄膜。在通過光刻印刷技術和等離子體刻蝕法被刻蝕至微電極上。將晶元線焊至印刷電路板上，製成一個含符合個人電腦內存卡國際組織標準的有個人電腦卡的晶元。

滲透膜離心覆蓋至晶元上：用異丙醇沖洗然後用去離子水洗滌晶元，再在氮氣流中吹乾。膠卷(cartridge)承擔著將這個乾燥晶元垂直地置於原漿清潔船中，用氬（250mtorr，250w）清潔5分鍾。

谷胱苷肽瓊脂糖（Sigma，St.Louis，MO）A.2.5％基質滲透膜（BPL）溶液如下准備，谷胱苷肽瓊脂糖（250mg）加入去離子蒸餾水中（10ml），混合，然後煮沸8分鍾，完全分離的瓊脂糖溶液預熱（65℃），微量離心管用1.2μm孔徑的洗滌過濾器，過濾的瓊脂糖溶液在65℃中平衡5分鍾。上層滲透膜包含固定的允許生物素探針附著物以鏈霉親和素-生物素交互作用為媒介的鏈霉親和素，如下制備，通過一個含氯化鈉（250mM）和磷酸鈉（10mM，PH7.2）的溶液保留鏈霉親和素（Boehringer Mannheim, Indianapolis,IN），得到鏈霉親和素溶液。這個鏈霉親和素溶液與溫度平衡溶液BPL結合產生2％瓊脂糖和1mg/ml的鏈霉親和素。這個溫暖的BPL溶液（50ml）被放至每張晶元上，並且在室溫下用離心機（EC101D，Headway Research，Garlan，TX）在2500rpm離心20秒。在BPL凝固後，上層溫暖的滲透膜溶液（50μl）被放置在BPL的最上層，並且在室溫下用10,000rpm離心機離心20秒。然後這晶元在37℃中培養30分鍾。為了在谷胱苷肽瓊脂糖和鏈霉親和素胺之間得到Schiff基質聯接，新鮮制備的硼氫化氰鈉（sodium cyanoborohyidre）（0.2M）/硼酸鈉（0.3M），PH9.0用晶元在常溫培養1小時，剩下的乙醛組在硼酸鈉（0.3M），PH9.0，常溫下30分鍾，浸入甘氨酸緩沖液(0.2M)中，晶元最後用去離子水沖洗5分鍾，乾燥4h然後儲藏在4℃的環境中。

晶元的膠片裝備：一個碳酸酯模型流動細胞用紫外線膠合法（Norland 68，Thorlabs，New Brunswick，NJ），即200W紫外線照射45秒（4joules/cm2），被膠合在晶元上。然後滑動的蓋板依上述的程序被膠合至上層的流動細胞上，形成一個密封室，帶瓶頸塞的塑料管被嵌入流入和流出的流動細胞，然後膠合至上述的部位。流動細胞的最後容量約7.5μl，從滲透膜至最上層蓋（滑動蓋板）的距離是0.45mm。

細胞培養：從沙門氏菌的SpaO區域來的A 296bp片斷被擴增，然後用體外基因 T/A克隆試劑盒（Invitrogen，San Diego,CA）克隆至質粒pCR2.1（3890bp）上，按照試劑盒的說明完成連接，連接產物用於將INVαF』轉移至合適的大腸桿菌上。轉移產物在金屬板上擴增，這個金屬板含加有氨苄青黴素（100μg/ml）、80μl X-gal(20mg/ml)和4μl異丙基硫代－β-D一半乳糖苷（40mΜ）可以蘭/ 白掃描的 Luria－Bertani（LB）介質，用SpaO特殊引物的PCR篩選出真正的克隆，用瓊脂糖凝膠電脈檢查擴增片段。經PCR篩選的克隆片段在LB介質中於37℃擴增一整夜，並且在225rpm搖動的氨苄青黴素（100μg/ml）液中培養。

細胞混合液的制備：細胞分離緩沖液包括0.05×TBE(4.5μM Tris,4.5μM硼酸，0.1μM EDTA，PH8.2)和250mM蔗糖，PH8.2。緩沖液的傳導性用Accumet pH meter 50（Fisher Scientific，匹茲堡，PA）測量是114μS/cm，細胞分離緩沖液的傳導性的選擇是非常小心的，為了確保大腸桿菌受制於介電電脈的正極，並且所有人血細胞受制於介電電脈的負極，培養的大腸桿菌細胞懸浮液（1ml 含約2×109細胞）被離心機在325G離心4分鍾，然後去除浮在表面的一層。在細胞分離緩沖液（1ml）中洗去細胞球，在相同的條件下依上面所述小球化。然後細胞在細胞分離緩沖液（1ml）中重新被懸浮，將新鮮的EDTA一抗凝血劑（20ml含1.46×105白細胞和9.38×107紅細胞）加入大腸桿菌的懸浮液中，細胞懸浮液的傳導性是315μS/cm。

介電電脈系統：大腸桿菌受限於正極的介電電脈牽引力，血細胞受限於相反的介電電脈牽引力的頻率，通過在不同條件下暴露細胞混合物，憑經驗被確定。這個研究由逐漸提高開始為5KHz的正弦波頻率（相鄰峰至峰10v）被傳導。當頻率達到10KHz，能發現大腸桿菌的分離物和剩餘的人血細胞。這個電參數下面會被用來分離大腸桿菌。

介電電脈分離細胞：為了用介電電脈從人血中分離大腸桿菌，一種沒用的膠卷被利用，首先通過流動細胞緩沖液沖洗晶元，細胞混合液被泵入流動細胞中，然後泵功能關閉。整個5×5的電極序列通過10v相鄰峰至峰，10KHz正弦波固定在checkerboard 的斜線上，泵重新啟動開始洗滌過程，當樣品混合物從樣品/緩沖液池中幾乎洗凈時，加入分離緩沖液在交流信號仍然存在時從流動細胞中洗去殘余樣品。洗滌完後，這個含蛋白酶K（490μg; Boehringer Mannheim）的分離緩沖液被泵入流動室。

電子分解產物：為了溶解細胞，在4個計數電極和25個更小的細胞富極電極之間需要提供一系列脈沖（500v，50μs脈寬），這個脈沖是這樣提供的，在兩組電極間每20個脈沖交替產生極性，每個溶菌過程需總共400個脈沖，這個溶解產物在50℃中培養20分鍾，使污染的DNA蛋白消化，溶解產物（300μl）從流動室中被泵出收集，介電電脈分離細胞和電子溶菌的組合被重復6次，所有的溶解產物被集中在一起，收集的溶解產物用16,000G離心5分鍾，重新得到浮在表面的一層，並加入2 升冰酒精（-20℃），混合，在16,000G離心10分鍾，去掉浮在上面的一層，小球在空氣中乾燥，然後再溶解至0.05×TBE緩沖液（300μl）中，再溶解得到的碎片溶液（30μl）含Rnase A（3μl，10mg/ml，Boehringer Mannheim），然後在37℃中培養30分鍾。

膠質電脈：將600mg溶解的瓊脂糖加入50ml 1×TBE的緩沖液中製成A1.2％瓊脂糖。在瓊脂糖溶液變成固體前還要加入溴乙啶（2.5μg），有或沒有RNase的經蛋白酶K處理過的溶解產物樣品延標記的DNAs加入啫哩中。

DNA雜交分析：一個寡核苷酸捕獲探針，5』－biotin－-3』, 對Spa0區域有特異性的質粒DNA通過輔酶在5』末合成。探針被50mM L一組氨酸緩沖稀釋得到一個終濃度500nM，捕獲探針被固定在覆蓋有鏈親和黴素瓊脂糖的電極上（固定在左面的第一和第三列和1－5和3－5上），但會有正電磁場，這電磁場來自於各個電極上200nA持續1分鍾的交流電，之後去掉剩餘的探針溶液，晶元用50nM L一組氨酸緩沖液沖洗。生物素控制的寡核苷酸捕獲探針ATA5（pad5－5）和不互補的鏈球菌A(GAS)探針（固定在第二和第四列）的合成，用上面所述來完成，ATA5與RCA5（ref.13）互補，GAS探針來源於化膿性葡萄球菌的speB基因，GAS探針序列如下所示：5』-biotin--3』。一個含互補序列的64－mer的模擬靶（50pM）捕獲探針被合成，序列如下：5』--3』。為了測試控制，對捕獲探針ATA5特異性的經Bodipy Texas Red (BTR)標記在靶樣寡核苷酸RCA5（ref.13）（50pM）通過在每個電極上給450nA的交流電3分鍾，平行雜交至固定的ATA5探針（pad5-5）和鄰近的非特異性GAS探針（pad5-4）上。雜交完後，用新鮮的L-組氨酸緩沖液沖洗，通過150直交流脈沖（1μA 每0.1s開和0.1s關）同時糾正電磁場來完成沖洗，控制雜交試驗（i.e.,捕獲探針[pad1-5]和非特異性GAS探針[pad1-4] 合成靶的雜交，變性大腸桿菌DNA和帶特異性捕獲探針[pads 3－1和3－5]和非特異性GAS探針[pads 3-2和3－4]的質粒pCR2.1 [上面提到的不帶296bp插入]的混合物用上面所述的相同操作來完成，為了DNA容易雜交，經蛋白酶K處理的溶解產物片斷在L－組氨酸緩沖液中被分別稀釋3倍和5倍。含稀釋溶解產物樣品的管子放在100℃水浴中10分鍾，打碎DNA（最後DNA序列在300bp至1kb之間），並且得到一個單一的DNA。如上面所述用每個靶樣（與5倍稀釋的靶樣互補的探針在pads1－1，1－3，2－1和2－3與3倍稀釋的靶樣互補的探針在pads4－1，4－3，5－1和5－3上，非互補探針在與5倍稀釋的靶樣非互補探針在pads1－2，2－2和與3倍稀釋的靶樣非互補探針在pads4－2，5－2）來完成雜交。為了傳導2層分析，報告探針（5』-BTR-GTTGAAATGACCTAACTTTTTCG-3』）按以下方法雜交，晶元在室溫下放入1×STE（150mM硫化鈉，10mM Tris－HCI,1 mM EDTA,PH8.0）含超聲處理的變性的小牛胸腺DNA（100μg/ml，Sigma）的緩沖液中放置5分鍾，然後去除緩沖液，將10μl混合液（500nM在含小牛胸腺DNA的1×STE緩沖液中的報告探針）置於晶元上，在室溫中放置5分鍾，晶元用由0.2×STE製成的1％SDS的緩沖液10μl沖洗5次，然後常溫下在5ml相同的緩沖液中浸10分鍾，最後用0.2×STE沖洗5次。

RNA雜交：寡核苷酸捕獲探針5』-biotin- TTTA-3』對16SRNA有特異性，在3，末與之結合，探針在50mM L－組氨酸緩沖液中稀釋，得到終濃度為500nM，捕捉探針固定在帶電磁場的鏈親和素的實驗微位置上，正電磁場通過在每個電極上200nA特續1分鍾的交流電產生，去除剩餘探針溶液，晶元用50mM L－組氨酸緩沖液沖洗，GAS探針（非特異性控制）的固定是通過如上所述的操作來完成的，為了測試捕獲探針的特異性，合成的靶樣寡核苷酸（5』-TGGAGTATGCAACTCG-3』，50pM）通過持續給每個電極450nA3分鍾的交流電平行電雜交至固定的互補探針和鄰近的非互補探針上。為了使16SRNA容易雜交，經蛋白酶K處理過的溶解產物碎片分別用L－組氨酸緩沖液稀釋3次和5次。同時稀釋溶解產物樣品與質粒DNA雜交，雜交完成後，新鮮的三磷酸緩沖液(20mM Tris-base,20mM di-basic 磷酸鈉PH9.0)取代舊的L－組氨酸緩沖液來完成嚴格的電子沖洗。沖洗靠同時將70直交流脈沖至一排負的電磁場，750nA每pad0.1s開0.1s關來完成。為了傳導2層分析報告探針的雜交如下：報告探針的混合序列為：5』-BTR-TCC GACTTCATGGAGTC-3』，5』-BTR-TGAGGTCCGCTTGCTCTCGCGA-3』和 5』-GGTCGCTTC TCTTTGTATGCGCCATT-BTR-3』。晶元在室溫下放入1×STE（10μl）含超聲處理的變性小牛胸腺DNA的緩沖液中放置5分鍾，然後去除緩沖液，將15μl的混合溶液（500nM在含前述小牛胸腺DNA的1×STE緩沖液中的報告探針）加在晶元上，在室溫中放置5分鍾。然後晶元用0.2×STE 製成的1％SDS的緩沖液15μl沖洗5次，在常溫下浸入5ml相同的緩沖液10分鍾，最後晶元用0.2×STE沖洗5次。

㈧ 我問師兄如何讓蛋白純度更高，他只告訴我這點……

硬核 | 細胞培養哪物羨筆記如何精讀一篇文獻獻給初學者：如何選擇合適的熒光蛋白又被蛋白純化折磨到哭泣，如果早知道這點就好了

用 His-tag 做蛋白純化時，或多或少有這樣的經歷：要麼蛋白純度低、純化出來的蛋白失去原有結構，要麼功能受到影響、難以從哺乳類細胞表達系統中純化出目標蛋白。

作為一個孜孜不倦積極進取的人，我覺得在實驗之前得先多做做功課，於是跑到隔壁實驗室向師兄請教。師兄跟我說 Strep-tag 系統具有純化過程溫和，目標蛋白純度高，且相容於多種表達系統的特性，愈來愈受到大眾的歡迎。但是，對於 Strep-tag 這個純化系統是怎麼發展起來的，為什麼蛋白純度高，很多人可能不知道，而這點得從功能性抗體開始說起……

1.功能性抗體的出現

隨著生物制葯技術的發展，抗體也因此成為科學家研究的熱門領域。但在 80 年代初，功能性抗體的表達一直是個問題，酵母表達系統中表達出來的蛋白只有部分具有功能，在其他的微生物表達系統中，也沒有成功的先例。

一直到 80 年代末，一個具有功能性的 McPC603 抗體的 Fv 片段終於成功的在 E.coli 被中表達出來「1」。這一方法的出現，使得科學家能更快速的表達具有不同基因變異的抗體片段，並能對這些變異所引發功能改變進行檢視。

2.抗體純化不簡單

將重組抗體片段表達出來之後，必須將此片段純化出來，當時多以親和層析法搭配目標抗體的抗血清（antiserum）進行蛋白純化，但這一方法常常受到限制：在研究一個未知目標蛋白時，常出現沒有抗血清或是相容抗體的情況，這嚴重影響了實驗進度。為此，科學家嘗試找出更有效的一步純化法。

首先，他們考慮在重組蛋白上加入短肽標簽（tag），當時市面上已有 myc、flag、KT3 epitope 等標簽，但這些主要適用於偵測目標蛋白，純化蛋白效果非常有限，或非常昂貴。

隨著 His-tag 的問世，讓固定化金屬離子親和層析法（Immobilized Metal Affinity Chromatography, IMAC）純化目標蛋白變為可能，這的確提高了蛋白純化的效率。

但是His-tag 僅適用於純化，無法用於偵測目標蛋白，而且使用His-tag 進行Fv 片段純化時，高鹽濃度常使得Fv 片段解離成兩個單體（VL 及VH），難以保持抗體的功能性及正確結構「2」。

3.更高能的短肽標簽呼之欲出

要解決這些問題，科學家需要找出一個具備以下功能的短肽標簽：

能被融合到目標蛋白上，且不會影響蛋白功能 能直接以現有試劑偵測出來 與配體結合穩定、特異性高且容易控制

經過一番搜索，發現鏈霉親和素（Streptavidin）在特定情況下，能與不同短肽進行可逆性的結合，再加上其與生物素（biotin）極高的親合力，且與背景蛋白的非特異性結合機率低，鏈霉親和素已被應用在許多檢測系統中，甚至能做為一個穩定的介質來固定蛋白。又因為鏈霉親和素在不同溶液條件中穩定性好，較抗體來的高，所以能夠重復被利用。

因此，90 年代初，科學家開始尋找一個能與鏈霉親和素特異性結合的親和標簽「2」。

4.終於找到了第一代 Strep-tag 系統 Strep-tag vs Streptavidin

因先前已知可用E.coli 系統表達出具有功能性的Fv 片段來「1」，科學家又希望能確認標簽是否會影響蛋白功能，所以選擇了已知的D1.3 抗體Fv 片段做為實驗模型，以便檢測加上的短肽標簽是否影響了這片段與其抗原結合的特李拍性「3」。

接著，一連串能與鏈霉親和素結合的標簽被接到VH domain 上，大量篩選之後，得到了一個適用於進行一步純化的Strep-tag（Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly -Gly）「3」，與生物素相比，Strep-tag 和鏈霉親和素間的親和力較低，因此可以使用生物素衍生物Diaminobiotin，進行在生理條件下的溫和洗脫。又因整個純化流程溫和，含鹽濃度低螞宏，純化出來的 Fv 片段完整且功能不受影響「3」。

除此之外，這個標簽還能被應用在 Western blot 或 ELISA 實驗中，以鏈霉親和素酶偶聯物（Streptavidin-enzyme conjugates）來檢測純化出的 Fv 片段。後續測試了以 Strep-tag 來純化抗體以外蛋白的可能性，證實了這個一步純化系統可以被廣泛使用在不同類型的蛋白上「3」。

5.因為不完美，所以有了第二代 Strep-tag II vs Strep-Tactin®

但 Strep-tag 僅能接在目標蛋白的 C 端，對於需將標簽接在 N 端或是蛋白內部的實驗，非常的不實用。因此科學家進一步優化了這個標簽，便有了現在被廣泛使用的 Strep-tag II（Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys）「4」。

但即便足以用於蛋白純化，科學家對 Strep-tag II 與鏈霉親和素的結合強度低這點仍不甚滿意，因為在比較特殊的純化條件中效率會受影響。於是進行了鏈霉親和素的改造，發展出 Strep-Tactin®。

Strep-Tactin®:Strep-tag II 的親和力較 Streptavidin:Strep-tag II 提升了近 100 倍，這個改變使得洗脫時需改用脫硫生物素（Desthiobiotin）「5」，但過程一樣溫合。這就是二代 Strep-tag 系統，在過去近 20 年間，逐漸被廣泛應用於純化或偵測蛋白質中，還甚至發展出細胞分離檢測的方法「6」。

6.總覺得還能更好，一起看看第三代 Twin-Strep-tag vs Strep-Tactin®XT

即便親和力已提升，在某些狀況下，Strep-Tactin® 使用仍有所限制，尤其是在需要極高親和力的應用之中，例如檢測蛋白質間的交互作用、或是從目標蛋白濃度低的樣本中進行純化。

因此科學家利用總結合力（Avidity）的原理，將兩個 Strep-tag II 以 linker 連接在一起：Twin-Strep-tag「7」。這一新標簽的出現再度提升了目標蛋白與Strep-Tactin® 的鏈接強度，改善了低濃度樣本純化效果「8」，還能於抓取蛋白復合體、檢視蛋白間的交互作用「7,9 」。

美中不足的是，Strep-Tactin® 在變性條件下並不穩定（例如：使用尿素時），無法進行純化，且進行批量純化時，即使搭配 Twin-Strep-tag，效果仍有改善的空間。為此，科學家再次改造了 Strep-Tactin®，得到與 Twin-Strep-tag 親和力更上一層樓的 Strep-Tactin®XT（XT 意指 extreme tight）「10」。

經過這次的優化，科學家首次創造出一個純化系統，其中標簽與配體的鍵結力幾近共價，但鏈結仍保持可逆（註：Strep-tag II 也能與Strep-Tactin®XT 結合）。因親和力的增加，即使經過多次清洗步驟，蛋白也不會從 Strep-Tactin®XT 上解離，提高了目標蛋白的得率。

需注意的是，洗脫步驟必須使用生物素，但是整個純化流程與前幾代一樣溫合，純度超過 95%，這就是最新一代 Strep-tag 系統。用Strep-Tactin®XT 來純化時，得率及純度都提高；且Twin-Strep-tag 搭配後還能用在Biacore 晶元「11,12」、微量滴定板或ELISA 中來固定蛋白，進行後續檢測，是一個多用途的親和標簽系統。

參考文獻

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10.Carl U（2016）Poster session presented at: PEGS Bosten 2016.

11.Dintner S, Heermann R, Fang C, Jung K & Gebhard S（2014）J Biol Chem., 289, 27899-910.

12.Yeliseev A, Zoubak L, Schmidt TGM（2017）。 Protein Expr Purif., 131, 109-118.

作者：IBA

圖片來源：IBA

題圖來源：pexels

話題： Strep-tag 系統, 功能性抗體, 生物素, 短肽標簽, 蛋白純化, 鏈霉親和素

㈨ 可用於elisa的抗體有哪些類型

• ELISA的類碼陸螞型
  ELISA可用於測定抗原，也可用於測定抗體。在這種測定方法中有三個必要的試劑：
  （1）固相的抗菌素原或抗體，即"免疫吸附劑"（immunosorbent）；（2）酶標記的抗原
  或抗體，稱為"結合物"（conjugate）；（3）酶反應的底物。根據試劑的來源和標本的情
  況以及檢測的具體條件，可設計出各種不同類型的檢測方法。用於臨床檢驗的ELISA主要
  有以下幾種類型：

• 2.2.1 雙抗體夾心法測抗原

• 雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，操作步驟如下：
  1） 將特異性抗體與固相載體聯結，形成固相抗體。洗滌除去未結合的抗體及雜質。
  2） 加受檢標本，保溫反應。標本中的抗原與固相抗體結合，形成固相抗原抗體復合物。
  洗滌除去其他遲埋未結合物質。
  3） 加酶標抗體，保溫反應。固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合
  的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢抗原的量相關。
  4） 加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產物。通過比色，測知標本中抗原的量。
  在臨床檢驗中，此法適用於檢驗各種蛋白質等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、
  AFP、hCG等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可用於包被固相載體和制備酶結合
  物而建立此法。如抗體的來源為抗血清，包被和酶標用的抗體最好分別取自不同種屬的動
  物。如應用單克隆抗體，一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗，分別用於包被固相
  載體和制備酶結合物。這種雙位點夾心法具有很高的特異性，而且可以將受檢標本和酶標
  抗體一起保溫反應，作一步檢測。
  在一步法測定中，當標本中受檢抗原的含量很高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標
  抗體結合，而不再形成"夾心復合物"。類同於沉澱反應中抗原過剩的後帶現象，此時反應
  後顯色的吸光值（位於抗原過剩帶上）與標准曲線（位於抗體過剩帶上）某一抗原濃度的
  吸光值相同（參見1.3.2，圖1-4），如按常法測讀，所得結果將低於實際的含量，這種現
  象被稱為鉤狀效應（hook effect），因為標准曲線到達高峰後呈鉤狀彎落。鉤狀效應嚴重
  時，反應甚至可不顯色而出現假陰性結果。因此在使用一步法試劑測定標本中含量可異常
  增高的物質（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）時，應注意可測范圍的最高值。用
  高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應。
  假使在被測分子的不同位點上含有多個相同的決定簇，例如HBsAg的a決定簇，也可
  用針對此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結合物。但在HBsAg的檢測中應注意亞型
  問題，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4個亞型，雖然每種亞型均有相同的a決定簇的反應
  性，這也是用單抗作夾心法應注意的問題。
  雙抗體夾心法測抗原的另一注意點是類風濕因子（RF）的干擾。RF是一種自身抗
  體，多為IgM型，能和多種動物IgG的Fc段結合。用作雙抗體夾心法檢測的血清標本中如含
  有RF，它可充當抗原成份，同時與固相抗體和酶標抗悉局體結合，表現出假陽性反應。採用
  F（ab"）或Fab片段作酶結合物的試劑，由於去除了Fc段，從而消除RF的干擾。雙抗體
  夾心法ELISA試劑是否受RF的影響，已被列為這類試劑的一項考核指標（參見6.2）。
  雙抗體夾心法適用於測定二價或二價以上的大分子抗原，但不適用於測定半抗原及小
  分子單價抗原，因其不能形成兩位點夾心。

• 2.2.2 雙抗原夾心法測抗體
  反應模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進行包被和制備酶結合物，以檢測相應
  的抗體。與間接法測抗體的不同之處為以酶標抗原代替酶標抗抗體。此法中受檢標本不需
  稀釋，可直接用於測定，因此其敏感度相對高於間接法。乙肝標志物中抗HBs的檢測常采
  用本法。本法關鍵在於酶標抗原的制備，應根據抗原結構的不同，尋找合適的標記方法。

• 2.2.3 間接法測抗體

• 間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗
  體）以檢測與固相抗原結合的受檢抗體，故稱為間接法（見圖2-3）。操作步驟如下：
  1）將特異性抗原與固相載體聯結，形成固相抗原。洗滌除去未結合的抗原及雜質。
  2）加稀釋的受檢血清，保溫反應。血清中的特異抗體與固相抗原結合，形成固相抗原抗
  體復合物。經洗滌後，固相載體上只留下特異性抗體，血清中的其他成份在洗滌過程
  中被洗去。
  3）加酶標抗抗體。可用酶標抗人Ig以檢測總抗體，但一般多用酶標抗人IgG檢測IgG抗
  體。固相免疫復合物中的抗體與酶標抗體抗體結合，從而間接地標記上酶。洗滌後，
  固相載體上的酶量與標本中受檢抗體的量正相關。
  4）加底物顯色
  本法主要用於對病原體抗體的檢測而進行傳染病的診斷。間接法的優點是只要變換包
  被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法。
  間接法成功的關鍵在於抗原的純度。雖然有時用粗提抗原包被也能取得實際有效的結
  果，但應盡可能予以純化，以提高試驗的特異性。特別應注意除去能與一般健康人血清發
  生反應的雜質，例如以E.Coli為工程酶的重組抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能與受過
  E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗體發生反應。抗原中也不能含有與酶標抗人Ig反應的物
  質，例如來自人血漿或人體組織的抗原，如不將其中的Ig去除，試驗中也發生假陽性反
  應。另外如抗原中含有無關蛋白，也會因竟爭吸附而影響包被效果。
  間接法中另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性。病人血清中受檢的
  特異性IgG只佔總IgG中的一小部分。IgG的吸附性很強，非特異IgG可直接吸附到固相載體
  上，有時也可吸附到包被抗原的表面。因此在間接法中，抗原包被後一般用無關蛋白質
  （例如牛血清蛋白）再包被一次，以封閉（blocking）固相上的空餘間隙。另外，在檢
  測過程中標本須先行稀釋（1:40~1:200），以避免過高的陰性本底影響結果的判斷。

• 2.2.4 競爭法測抗體

• 當抗原材料中的干擾物質不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特
  異性抗體。其原理為標本中的抗體和一定量的酶標抗體競爭與固相抗原結合。標本中抗體
  量越多，結合在固相上的酶標抗體愈少，因此陽性反應呈色淺於陰性反應。如抗原為高純
  度的，可直接包被固相。如抗原中會有干擾物質，直接包被不易成功，可採用捕獲包被
  法，即先包被與固相抗原相應的抗體，然後加入抗原，形成固相抗原。洗滌除去抗原中的
  雜質，然後再加標本和酶標抗體進行競爭結合反應。競爭法測抗體有多種模式，可將標本
  和酶標抗體與固相抗原競爭結合，抗HBc ELISA一般採用此法。另一種模式為將標本
  與抗原一起加入到固相抗體中進行競爭結合，洗滌後再加入酶標抗體，與結合在固相上的
  抗原反應。抗HBe的檢測一般採用此法。

• 2.2.5 競爭法測抗原
  小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的位點，因此不能用雙抗體夾心法
  進行測定，可以採用競爭法模式。其原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相
  抗體結合。標本中抗原量含量愈多，結合在固相上的酶標抗原愈少，最後的顯色也愈淺。
  小分子激素、葯物等ELISA測定多用此法。

• 2.2.6 捕獲包被法測抗體

• IgM抗體的檢測用於傳染病的早期診斷(early diagnosis)中。間接法ELISA一般僅適用於檢測總抗體或
  IgG抗體。如用抗原包被的間接法直接測定IgM抗體，因標本中一般同時存在較高濃度的
  IgG抗體，後者將競爭結合固相抗原而使一部份IgM抗體不能結合到固相上。因此如用抗人
  IgM作為二抗，間接測定IgM抗體，必須先將標本用A蛋白或抗IgG抗體處理，以除去IgG的
  干擾。在臨床檢驗中測定抗體IgM時多採用捕獲包被法。先用抗人IgM抗體包被固相，以捕
  獲血清標本中的IgM（其中包括針對抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM）。然後加入
  抗原，此抗原僅與特異性IgM相結合。繼而加酶標記針對抗原的特異性抗體。再與底物作
  用，呈色即與標本中的IgM成正相關。此法常用於病毒性感染的早期診斷(early diagnosis)。甲型肝炎病毒
  （HAV）抗體的檢測模式見圖2-7。
  類風濕因子（RF）同樣能幹擾捕獲包被法測定IgM抗體，導致假陽性反應。因此中和
  IgG的間接法近來頗受青睞，用這類試劑檢測抗CMV IgGM和抗弓形蟲IgM抗體已獲成功。

• 2.2.7 ABS-ELISA法
  ABS為親和素(avidin)生物素(biotin)系統(system)的略語。親和素是一種糖蛋白，分子
  量60000，每個分子由4個能和生物素結合的亞基組成。生物素為小分子化合物，分子量
  244。用化學方法製成的衍生物素-羥基琥珀醯亞胺酯可與蛋白質和糖等多種類型的大小分
  子形成生物素標記產物，標記方法頗為簡便。生物素與親和素的結合具有很強的特異性，
  其親和力較抗原抗體反應大得多，兩者一經結合就極為穩定。由於一個親和素可與4個生
  物素分子結合，因此如把ABS與ELISA法可分為酶標記親和素-生物素（LAB）法和橋聯親
  和素-生物素（ABC）法兩種類型。兩者均以生物素標記的抗體（或抗原）代替原ELISA系
  統中的酶標抗體（抗原）。在LAB中，固相生物素先與不標記的親和素反應，然後再加酶
  標記的生物素以進一步提高敏感度。在早期，親和素從蛋清中提取，這種卵親和素為鹼性
  糖蛋白，與聚苯乙烯載體的吸附性很強，用於ELISA中可使本底增高。從鏈黴菌中提取的
  鏈霉親和素則無此缺點，在ELISA應用中有替代前者的趨勢。由於ABS-ELISA較普通
  ELISA多用了兩種試劑，增加了操作步驟，在臨床檢驗中ABS-ELISA應用不多。

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