中性樹脂能用做免疫熒光的封片嗎

㈠ 免疫熒光甩片能將細胞固定在載玻片上么

免疫熒光基本實驗步驟

基本實驗步驟：
（1） 細胞准備。對單層生長細胞，在傳代培養時，將細胞接種到預先放置有處理過的蓋玻片的培養皿中，待細胞接近長成單層後取出蓋玻片，PBS洗兩次；對懸浮生長細胞，取對數生長細胞，用PBS離心洗滌（1000rpm，5min）2次，用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞塗片。
（2） 固定。根據需要選擇適當的固定劑固定細胞。固定完畢後的細胞可置於含疊氮納的PBS中4℃保存3個月。PBS洗滌3×5 min。
（3） 通透。使用交聯劑（如多聚甲醛）固定後的細胞，一般需要在加入抗體孵育前，對細胞進行通透處理，以保證抗體能夠到達抗原部位。選擇通透劑應充分考慮抗原蛋白的性質。通透的時間一般在5-15min。通透後用PBS洗滌3×5 min。
（4） 封閉。使用封閉液對細胞進行封閉，時間一般為30min。
（5） 一抗結合。室溫孵育1h或者4℃過夜。PBST漂洗3次，每次沖洗5min。
（6） 二抗結合。間接免疫熒光需要使用二抗。室溫避光孵育1h。PBST漂洗3次，每次沖洗5min後，再用蒸餾水漂洗一次。
（7） 封片及檢測。滴加封片劑一滴，封片，熒光顯微鏡檢查。

（一）細胞准備
用於免疫熒光實驗的細胞可以是直接生長在蓋玻片上的貼壁細胞，也可以是經過離心後塗片的懸浮細胞或者是將取自體內的組織細胞懸液離心後塗片。貼壁良好的細胞一般在培養時直接放入coverslips讓細胞生長在其上即可，盡量避免使用貼壁性能不好的細胞進行免疫熒光實驗，以免後續的漂洗操作引起細胞脫落。少數實驗需要使用這類細胞或者懸浮細胞進行免疫熒光觀察，建議使用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞塗片。

（二）固定和通透
除研究細胞表面抗原或不穩定抗原可不固定外，一般均應固定。固定的目的有三：
①防止細胞從玻片上脫落；
②除去防礙抗原-抗體結合的類脂；
③使標本易於保存。

標本的固定原則是：
①不能損傷細胞內的抗原；
②不能凝集蛋白質；
③應保持細胞和亞細胞結構；
④固定後應保持通透性，以保證抗體自由進入所有細胞與亞細胞組分與抗原結合。
常用的固定劑有多種，應根據所研究抗原的性質和所使用的抗體特性選擇適當的固定劑。通常固定方法可以分為兩類：有機溶劑和交聯劑。有機溶劑如甲醇和丙酮等可去除類脂並使細胞脫水，同時將細胞結構蛋白沉澱。交聯劑如多聚甲醛通常通過自由氨基酸基團形成分子間橋連，從而產生一種抗原相互連接的網路結構。交聯劑比有機溶劑更易於保持細胞的結構，但因為交聯阻礙抗體結合，可能會降低一些細胞組分的抗原性，因此需要增加一個通透步驟以使抗體能夠進入標本。兩種固定方法都可能使蛋白抗原變性，因此使用變性蛋白作為抗原生產的抗體在免疫熒光中可能更為有效。
最常用的固定劑有多聚甲醛和甲醇，少數情況也使用乙醇，丙酮及戊二醛等進行固定。通常，細胞結構抗原、病毒及一些酶類抗原使用丙酮、乙醇及高濃度的甲醛固定可獲得較好的結果，而細胞膜相關組分抗原一般以多聚甲醛固定。細胞器和細胞顆粒內的抗原一般也用多聚甲醛固定，並需要進行通透以使抗體能達到抗原表位。
通透步驟只在檢測細胞內抗原表位的時候才需要，因為抗體需要進入細胞內部去檢測蛋白。但是，如果待檢測的是跨膜蛋白，且其抗原表位處於胞質內區域，則同樣需要對細胞進行通透。相反，如果所檢測的抗原表位位於膜蛋白的胞外段，則不需要進行通透。丙酮本身具有通透作用，因此用丙酮作為固定劑時是不需要通透的。甲醇同樣具有通透作用，但有些場合並不適合用甲醇，因為一些表位對甲醇非常敏感。常用的通透劑是去垢劑，如Triton ，NP-40，以及Tween 20, Saponin, Digitonin 和 Leucoperm等。Triton和NP-40屬於烈性去垢劑，可部分溶解細胞核膜，因此非常適合核抗原檢測。但應該注意的是，如果在高濃度下使用或者作用時間過長，它們將破壞蛋白，從而影響實驗結果。Triton X-100是最常用的通透劑，但是它將破壞細胞膜，因此不適用於細胞膜相關抗原。後面一組去垢劑要溫和得多，它們可以在細胞質膜上形成足夠大的孔隙以允許抗體通過，但是不會溶解細胞質膜。適於胞質抗原或者質膜上靠近胞質一面的抗原，也適於可溶性的核抗原。
一般的操作程序是先固定後通透，但針對有些水不溶性的目的抗原的檢測宜先通透再固定，這樣做的原因主要是可以通過通透去除許多水溶性的蛋白，從而大大減少了免疫熒光的背景和非特異性信號。固定後以冷PBS液漂洗，最後以蒸餾水沖洗，防止自發性熒光。

（三）封閉
封閉的目的是為了減少抗體的非特異性結合，最常用的封閉劑為1% BSA, PBS pH 7.5，其他可選擇的封閉劑還有 1% gelatin, 1%bovine 或與二抗種屬相同的血清（3-10%）等。

（四）抗體孵育
直接免疫熒光法中的一抗和間接免疫熒光法中的二抗都是熒光抗體，因此在這些抗體孵育的時候必須注意避光。此外，為保證結合質量和防止乾燥，抗體孵育應盡量在濕盒中進行。

（五）封片及熒光觀察
標記好熒光的細胞片原則上可以直接進行觀察，特別是有時候封片不當反而使得前功盡棄。但在絕大多數情況下，為了保存結果，以便進一步觀察、照像、統計分析等，需作封片處理。常規的方法是採用甘油或中性樹脂封片，為了增強封片的效果，往往需要在封片時添加特殊的抗熒光淬滅劑。

（六）標本保存
由於熒光色素和蛋白質分子的穩定性都是相對的，因此隨著保存時間的延長，在各種條件影響下，標記蛋白可能變性解離，失去其應有的亮度和特異性。因此給標本的保存帶來一定的困難，所以在標本進行熒光染色之後應立即觀察。由於性能良好的抗熒光淬滅劑的出現，熒游標記的標本可以在低溫（4℃或-20℃）下保存相當長的時間。在某些情形下，考慮到實驗的成本及實驗條件，也可以採取權宜的辦法，比如固定標本片後低溫保存，在需要時再進行熒游標記，即隨用隨染。

㈡ 我想請教一下，我做油紅0 ，沒封片時候圖像清晰，為什麼拿中性樹脂封片以後再看感覺紅色團一塊了

中性樹膠裡面有二甲苯啊，二甲苯溶解脂肪，建議使用甘油明膠等回水溶性封固劑答封片，其實你可以買現成的試劑盒，南京建成就有，他家的油紅O試劑盒裡有個專門的封固劑，就是要加熱才能溶解，麻煩是麻煩，但效果還不錯。

㈢ 細胞爬片染色免疫組化法步驟是什麼

師兄用的晶安生物的細胞爬片。
晶安生物細胞爬片免疫組化法： 1 胰酶消化細胞，收集至離心管；調整樣本細胞數為1×106 /ml； 2 將單細胞懸液滴加至平皿內無菌載玻片表面，置於37℃ 5%的加濕CO2孵箱中過夜，使細胞爬片。 3 吸棄平皿內培養上清，加入新鮮培養基，用無菌培養基洗3次； 4 PBS沖洗相應方案的載玻片3次； 5 將載玻片置於95%乙醇中固定約1h； 6 倒置相差顯微鏡下觀察，並劃定載玻片上細胞爬片密集區； 7 在相應區域滴加按一定比例稀釋後一抗，4℃冰箱內過夜濕孵。陰性對照以PBS緩沖液代替一抗。 8 先暫復溫30min，後PBS沖洗載玻片3次； 9 滴加二抗，室溫濕孵30min；後PBS沖洗載玻片3次； 10 DAB顯色：將配置好的DAB溶液滴加至載玻片上，室溫下孵育3min至載玻片略顯黃色； 11 清水充分沖洗載玻片，蘇木素復染核3-5min，清水沖洗，鹽酸酒精分化20s，清水沖洗，氨水返藍3min，清水沖洗，後置於75%-80%-95%-無水酒精中脫水，每步驟約2min； 12 將載玻片置於1、2、3道二甲苯中，各約15min，中性樹脂封片，置於陰涼通風處風干。

㈣ 細胞爬片做免疫熒光用什麼封片

甘油不會凝固，片子不易長時間保存。指甲油、樹脂對熒光有影響，而且指甲油所含有機回溶劑對物鏡不好。最答好用專門的熒光封片劑。
Aqua-Poly/Mount (Polysciences, Inc.) #18606 20ml $37.65
*HISTOTEC PERMANENT AQUEOUS MOUNTANT(serotec,Immunological Excelence)
(HIS002B)30ml $89
這兩個是現成的，買來就可以用，但價格較貴。
sigma Mowiol 4-88 是顆粒，需自己配製，量大，價格很便宜。

㈤ HE染色的方法步驟及注意事項

一、實驗步驟：

（1）樣品制備：對於貼壁生長細胞，胰酶消化，調整細胞濃度約1×105/ml，滴加於蓋玻片上(置於6孔板中)，培養相應時間後，取出細胞爬片，用PBS 洗滌3次。

（2）樣品固定：95%乙醇固定20min，PBS洗滌2次，每次1min。

（3）染核：蘇木素染液染色2-3min，自來水洗滌。

（4）分色：鏡下觀察，若細胞核染色過深，用1%鹽酸酒精溶液分色數秒，自來水洗滌。

（5）染胞質：浸入伊紅染液染色1min，自來水洗滌。

（6）吹乾或自然晾幹細胞 爬片後，中性樹膠封片。

若細胞用4%多聚甲醛固定，則染色時間相應延長，蘇木素染色12-15min，伊紅5min即可。

二、注意事項：

1、染色時調節pH值很重要。如果組織塊在福爾馬林中固定時間長，組織酸化而影響細胞核著色。因此，要在自來水中沖洗時間長一些或在飽和碳酸鋰水溶液中處理10-30min，這樣可以使細胞核著色較深。染伊紅時胞漿著色不佳，可在伊紅溶液中滴加1-2滴冰醋酸。

2、切片染蘇木精後，分色這一步是關鍵，應在顯微鏡下控制進行，一般以細胞核染色清楚（晰）而細胞質基本無色為佳。如果過分延長分色時間將導致染色太淺，應重新染色後再行分色。

3、切片經酒精脫水後，入二甲苯時可出現白色不透明狀態，此為脫水不徹底，應將切片退回無水酒精，更換酒精、二甲苯，以求徹底脫水與透明。

4、在染色過程中不要讓切片乾燥，以免切片收縮、變形，影響神經元形態。

5、切片從二甲苯取出或進入二甲苯前，切片周邊均應擦乾凈或吸干多餘水分。

6、最後封固時，要用中性樹脂，防止日後褪色，蓋片要選大於組織塊的面積，如漏出一部分不久將會褪色，所用樹脂濃度要適當，樹脂封固時不能有氣泡。

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一、細胞核染色原理：

蘇木精為鹼性天然染料，可使細胞核著色。細胞核內染色質的成分主要是DNA，在DNA的雙螺旋結構中，兩條核苷酸鏈上的磷酸基向外。

使DNA雙螺旋的外側帶負電荷，呈酸性，很容易與帶正電荷的蘇木精鹼性燃料以離子鍵或氫鍵結合而被染色。蘇木精在鹼性溶液中呈藍色，所以細胞核被染成藍色。

二、細胞漿染色原理：

細胞漿內主要成分是蛋白質，為兩性化合物、細胞漿的染色與pH值有密切關系，當pH調到蛋白質等電點4.7-5.0時，胞漿對外不顯電性，此時酸或鹼性染料不易染色。

當pH調到6.7-6.8時，大於蛋白質的等電點pH值，表現酸性電離，而帶負電荷的陰離子，可被帶正電荷的染料染色，現時胞核也被染色，核和胞漿難以區分。因此必須把pH調至胞漿等電點以下，在染液中加入醋酸使胞漿帶正電荷（陽離子），就可被帶負電荷（陰離子）的染料染色。

伊紅Y是一種化學合成的酸性染料，在水中離解成帶負電荷的陰離子，與蛋白質的氨基正電荷（陽離子）結合而使細胞漿染色，細胞漿、紅細胞、肌肉、結締組織，嗜伊紅顆料等被感染成不同程度的紅色或粉紅色，與藍色的細胞核形成鮮明的對比。

㈥ 怎樣用中性樹脂封片

晾乾後滴在上面兩滴中性樹脂然後放蓋玻片，輕壓蓋玻片讓液滴充滿整個玻片，然後晾乾，最好晾一個星期再看，不然容易脫落。當然不用油鏡的話應該就不用晾那麼久了。