鹽酸胍溶液能過超濾膜

㈠ RNA 變性PAGE的配製方法

氯仿是分子量比較大的有機溶劑,在提取rna時,氯仿可以有效的使有機相和無機相迅速分離.dna提取過程
有機相中主要是酚和蛋白結合,從而使得蛋白和dna脫離,dna進入水相.但是在rna的提取過程就要避免蛋白和dna脫離,否則dna會釋放到水相.不管有酚也好,沒有酚也好,氯仿本身也對蛋白有變性作用,劇烈的震盪,很容易使得dna的親水基團,與水相接觸.所以不要劇烈震盪.
異丙醇的作用是通過-oh的疏水作用使得rna
或者dna鏈中的親水基團受到保護,等同於沉澱,但是這是個反應時發生在水相中,與前面的氯仿不矛盾.
氯仿的作用有多個方面,一是作為有機溶劑變性蛋白,使其沉澱並通過離心除去,同時也通過變性作用抑制rnase活性；二是rna提取試劑中通常含有苯酚（trizol主要成分就是苯酚,很多自己配試劑提的方法也用苯酚,抽提蛋白時也會用到苯酚）,苯酚微溶於水,抽提烷之後水相里有痕量的酚,如果不除去會損傷核酸,需要通過氯仿把水相里參與的苯酚抽提掉；三是作為溶劑抽提樣品中的一些脂溶性雜質（比如油脂、脂溶性色素等）,起到一定除雜作用
通常氯仿裡面會加少量異戊醇（1/25）,減少蛋白質在變性過程中由於震盪產生的泡沫,影響後續操作,不過個人經驗感覺加不加沒什麼太大區別,也許是我的樣品里蛋白不多吧
異丙醇是沉澱核酸用的,作用和乙醇一樣.只不過用量少一點,0.6v~1v就夠了,不像乙醇沉澱需要至少2v,一般需要2.5倍體積.在水相很多,離心管容積有限,加不下太多乙醇的時候一般會用異丙醇沉澱.不過感覺效果不如乙醇,偶爾會有沉澱不出來東西的時候

㈡ 超濾膜怎麼進行清洗

超濾膜有幾種清洗方法：

超濾膜會隨著使用時間的延長，超濾膜的污染會不斷的加重，當污染到達一個程度的時候就需要對超濾膜進行一個清洗，清洗後能讓超濾膜最大程度上恢復原有的產水量，那麼超濾膜的清洗方法有幾種呢？超濾膜的清洗方法大類可以分為兩種分別是：物理清洗方法和化學清洗方法。物理清洗方法還可以分為逆向沖洗、反沖洗、正洗沖洗三種。這些清洗都有著不同的作作和特點，下面為大家詳細的介紹一下。

超濾膜的清洗方法有哪些，詳細的解答：

一、物理清洗法：物理方法其實就是用有一定壓力的水去沖洗超濾膜，這也是最常用的方法。因為這個水沖洗的方向不一樣，又可以分為逆向沖洗、反沖洗和正洗沖洗。

1.逆向沖洗：用原水沖洗膜內和進水端面的雜質。

2.反沖洗：用超濾水從膜塊表面的污染物沖鬆散、剝落，分別從進水口和濃縮口排出(可加酸、鹼或次氯酸鈉等葯品加強清洗效果)。

二、化學清洗法：

利用化學葯品與膜面雜質進行化學反應來達到清洗膜的目的

酸溶液清洗：常用溶液有鹽酸、檸檬酸、草酸等，調配溶液的PH=2~3，利用循環清洗或者浸泡0.5h~1h後循環清洗，對無機雜質去除效果較好。

鹼溶液清洗：常用的鹼主要有NaOH ，調配溶液的PH=10~12左右，利用水循環操作清洗或浸泡0.5h~1h後循環清洗，可有效去除雜質及油脂。

氧化劑清洗劑：利用1%~3%H2O2、 500~1000mg/L NaClO 等水溶液清洗超濾膜，可以去除污垢，殺滅細菌。H2O2和NaClO是常用的殺菌劑。

加酶洗滌劑：如0.5%~1.5%胃蛋白酶、胰蛋白酶等，對去除蛋白質、多糖、油脂類污染物質有效。

進行方法與正常超濾過程相同，清洗液自原液入口處進入，濃縮液及超濾液全部返回清洗液容器，循環後排放，以凈水洗凈即可。

㈢ 包涵體染色的方法有哪些原理是什麼

包涵體染色的方法有哪些？原理是什麼
包涵體染色的方法有哪些？原理是什麼
包涵體染色的方法有哪些？原理是什麼

蛋白包涵體-溶解原理及方法2009年03月15日；維持包涵體內蛋白質結構的作用力是分子內的作用力，；1.遵循標准；包涵體蛋白質的溶解同樣是一個工藝的關鍵的步驟；(1)快速溶解的動力學；；(2)與蛋白質的結合是可逆的；；(3)對細胞碎片的分離方法沒有干擾作用；；(4)對溫度沒有依賴作用；；(5)抑制蛋白質酶的降解作用；；(6)與蛋白質的氨基沒有化學修飾作用；；

維持包涵體內蛋白質結構的作用力是分子內的作用力，這種作用力也維持天然蛋白質的穩定性的結構。先前有報道這種作用力是共價鍵結合的，但是，現在趨向於一致，就是維持包涵體內部的蛋白質的緊密的結構的是非共價鍵的作用力。二硫鍵，無論是正確的還是錯誤的二硫鍵，在維持內部蛋白質的緊密的結構中都沒有發揮直接的作用。最經常的獲得活性蛋白質的第一步是溶解這些包涵體蛋白質，溶解液是使這些包涵體蛋白質完全變性的成分，當蛋白質被溶解以後，則進入到蛋白質的體外折疊的過程。

1. 遵循標准

包涵體蛋白質的溶解同樣是一個工藝的關鍵的步驟。溶劑的選擇會影響後續的操作、最終的各種蛋白質的收率以及最終的成本，必須遵循以下的標准：

(1) 快速溶解的動力學；

(2) 與蛋白質的結合是可逆的；

(3) 對細胞碎片的分離方法沒有干擾作用；

(4) 對溫度沒有依賴作用；

(5) 抑制蛋白質酶的降解作用；

(6) 與蛋白質的氨基沒有化學修飾作用；

(7) 在可能的情況下，選擇最低的溶解濃度和廉價的溶劑，並適於以後的復性方法。

2. 溶解包涵體的試劑

最經常使用溶解包涵體的試劑包括離液劑或者去垢劑。

最經常使用的溶解和制備蛋白質的離子型的離液劑最早於1969年Hatefi等人發展的離子型的去垢劑如SDS是另外一種溶解包涵體蛋白質和膜蛋白質的試劑，但是一般不用來大規模的生產，而是用來定性。除了強酸、強鹼和利用有機溶劑來提取疏水性很強的蛋白質以外，其他的變性方法如非可逆的共價修飾在工業的大規模生產中很少用到。一旦蛋白質被溶解，蛋白質中的巰基很容易快速地氧化並形成共價的聚集體或者分子內錯配的二硫鍵，然後這些蛋白質就不能再進行折疊。為了防止氧化，可以使這些基團或者利用緩沖液中含有低分子量的疏基試劑保持在還原的狀態或形成磺酸鹽或者形成混合的二硫鍵。

（1）去垢劑

去垢劑是一種最經濟的溶解包涵體蛋白質的方法，一個最大的優點是溶解的蛋白質有可能保持全部的生物活性，說明在此條件下保持了蛋白質的四級結構。最重要的是稀釋以後蛋白質的聚集比其它溶劑生成的很
少。陽離子型、陰離子型的和非離子型的去垢劑都可以使用，使用時的濃度一般高於去垢劑的臨界膠束濃度（CMC ），通常是0.5-5%。

SDS僅僅在大量生產牛生長激素、干擾素和白介素-2中用到。SDS由於具有較低的臨界膠束濃度（CMC）而使得結合到蛋白質分子上的SDS比較難於除去。由於N-十二烷肌氨酸它的CMC比SDS高0.4%，也被用來溶解包涵體蛋白質並可用稀釋的方法使蛋白質復性，殘余的去垢劑可以使用陰離子交換色譜或者超濾的方法除去。這種去垢劑是一種比較溫和的去垢劑，可以選擇性地溶解一些包涵體，但是不能溶解完全的變性的蛋白質的聚集體和大腸桿菌的內膜的蛋白質分子。使用去垢劑一個主要的缺點是對以後的純化和復性的步驟的干擾，去垢劑結合到蛋白質上的強度大離子交換色譜復性蛋白質小不同，比較難於除去，並干擾離子交換和疏水相互作用色譜的過程，在變性的濃度時超濾膜會吸附這些變性劑。所以復性後需要盡量洗滌這些去垢劑，也可以使用環狀糊精鏈狀糊精或者環狀澱粉從復性緩沖液中提取去垢劑。

一個不容忽視的問題是去垢劑可以溶解全部的膜蛋白質中的蛋白質酶，這些蛋白質酶的活性在去垢劑的存在的情況下被活化，可能造成溶解和復性過程的收率的降低。蛋白質復性的收率可以通過以下的方法來提高： a) 先期使用可以溶解膜蛋白質但是不溶解包涵體蛋白質的溶劑盡量洗滌包涵體蛋白質；

b) 包涵體的含有的菌體碎片被完全除去；

c) 溶解包涵體的液體中含有蛋白質酶的抑制劑，如EDTA，苯甲基磺醯氟（PMSF ）等 。

（2）離液劑

其它的離液劑也被用來溶解包涵體蛋白質，最主要的溶解包涵體蛋白質的離液劑是鹽酸胍和尿素，這是最經常使用的溶解試劑，一般情況下選擇6-8mo1/L的濃度，蛋白質濃度在1-10mg/mL。

在溶解色氨酸合成酶A的過程，發現陽離子的溶解能力順序是Gdm+ > Li+ > K+ > Na+，陰離子的順序是SCN- > I- > Br- >Cr-。一些離液劑由於它們的溶液比鹽酸胍和尿素有更高的密度和黏度而不適合用於溶解包涵體，因為利用離心和色譜分離起來比較困難。

為了溶解包涵體蛋白質需要的尿素或者鹽酸胍的濃度根據蛋白質的不同而不同。如果蛋白質天然形態需要溶解的變性劑的濃度不能獲得，則在溶解包涵體時需要首先確定離液劑的濃度。

鹽酸胍由於比較貴，所以一般用來溶解一些附加值比較高的葯物蛋白質分子，選擇鹽酸胍作為溶解試劑，是因為鹽酸胍是一種比脲更為強烈的變性劑，甚至可以溶解脲所不能溶解的包涵體；尿素，由於可能被自發的形成的氰酸鹽或者已有的氰酸鹽的污染，特別是在鹼性環境中，從而造成蛋白質的自由的氨基被不可逆的修飾。消除此種影響的方法是用陰離子的緩沖系統如Tris-HCl溶解脲或者脲在使用之前利用陰離子交換色譜純化，並且配製的溶解和復性的緩沖液在當天使用。脲溶液中影響蛋白質變性的因素與鹽酸胍的不同。溶在脲中的蛋白質受到pH和離子強度的影響，從而影響電荷的蛋白質殘基之間的電荷作用，但是由於鹽酸胍含有高濃度的離子強度，所以這兩個因素的影響很少。

（3）混合溶劑

一般情況下去垢劑並不聯合使用，Lilly等人發現去垢劑和尿素的混合液有效的摩爾濃度較低。尿素和去垢
劑型的鹽混合可以使蛋白質變性，但是尿素和非去垢劑的鹽如氯化鈉反而降低包涵體蛋白質的溶解性，所以要避免使用。

去垢劑結合其他的試劑或者溶解增強劑也被使用，發現尿素和乙酸，尿素和二甲亞楓，尿素和高pH等是比較有效的溶解包涵體蛋白質的方法。

高壓（1-2kbar）、超聲也可以溶解包涵體蛋白質，此時使用的溶解試劑濃度可以比較低，便於後續的復性步驟。

3. 極端pH

酸鹼度也是比較廉價的有效的溶解包涵體的方法。最經常使用酸的是有機酸，濃度在5-80%之間。Gavif和Better使用低的（pH≤2.6）和高溫（85℃ ）溶解抗真菌的重組蛋白質的膚段，低溫和高PH需要溶解時間要長。Reddy和合作者也使用20%乙酸溶解一種麥芽糖結合的蛋白質。但是，同樣的一些不可逆的修飾作用或者酸降解會在極端pH下發生，所以此種方法並不是經常使用的溶解包涵體的方法。

高pH（≥12）也被用來溶解生長激素和原胰島素。在高pH下一些蛋白質同樣可能發生非可逆的變性，原因在於半胱氨酸在鹼性條件下的脫硫過程。所以這種方法盡管比較簡單、廉價，同樣僅僅用於一些特定的蛋白質，特別對於葯用蛋白質一般不採用這種方法。

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摘要 基因重組蛋白在大腸桿菌中表達時，由於表達量高，往往形成無生物活性的包涵體。包涵體必須經過變性和復性的過程才能獲得有活性的重組蛋白。如何提高基因重組蛋白質的復性率，是生物工程技術的一個研究熱點。對近年來的重組蛋白質的復性方法做一評述，為研究蛋白質折疊以及復性技術的進一步應用提供依據。
關鍵詞 重組蛋白 包涵體 復性 二硫鍵
到目前為止，人們表達的重組蛋白質已有4000多種，其中用E.coli表達的蛋白質要佔90%以上，盡管基因重組技術為大規模生產目標蛋白質提供了嶄新的途徑，然而人們在分離純化時卻遇到了意想不到的困難，即這些蛋白質在E.coli中絕大多數是以包涵體形式存在，重組蛋白不僅不能分泌到細胞外，反而在細胞內聚集成沒有生物活性的直徑約0.1~3.0μm的固體顆粒[1]。自從應用大腸桿菌體系表達基因工程產品以來，人們就一直期望得到高活性、高產量的重組蛋白。不可溶、無生物活性的包涵體必須經過變性、復性才能獲得天然結構以及生物活性，因此應該選擇一個合適的復性過程來實現蛋白質的正確折疊，獲得生物活性，近年來的研究可以使復雜的疏水蛋白、多結構域蛋白、寡聚蛋白、含二硫鍵蛋白在體外成功復性。
包涵體形成的原因

重組蛋白在宿主系統中高水平表達時，無論是原核表達體系或真核表達體系甚至高等真核表達體系，都會形成包涵體[2]。主要因為在重組蛋白的表達過程中，缺乏某些蛋白質折疊過程中需要的酶和輔助因子，或環境不適，無法形成正確的次級鍵等原因形成的[3]。

1、 表達量過高，研究發現在低表達時很少形成包涵體，表達量越高越容易形成包涵體。原因可能是合成速度太快，以至於沒有足夠的時間進行折疊，二硫鍵不能正確配對，過多的蛋白間的非特異性結合，蛋白質無法達到足夠的溶解度等。

2、 重組蛋白的氨基酸組成，一般說來含硫氨基酸越多越容易形成包涵體。

3、 重組蛋白所處的環境：發酵溫度高或胞內pH接近蛋白的等電點時容易形成包涵體。

4、 重組蛋白是大腸桿菌的異源蛋白，由於缺少真核生物中翻譯後修飾所需酶類，致使中間體大量積累，容易形成包涵體沉澱。

5、 有報道認為，豐富的培養基有利於活性蛋白質的表達，當培養條件不佳時，容易形成包涵體。
減少包涵體形成的策略

1、 降低重組菌的生長溫度，降低培養溫度是減少包涵體形成的最常用的方法，較低的生長溫度降低了無活性聚集體形成的速率和疏水相互作用，從而可減少包涵體的形成[4]。

2、 添加可促進重組蛋白質可溶性表達的生長添加劑，培養E.coli時添加高濃度的多醇類、蔗糖或非代謝糖可以阻止分泌到周質的蛋白質聚集反應，在最適濃度范圍內添加這些添加劑不會影響細胞的生長、蛋白質的合成或運輸，其它促重組蛋白質可溶性表達的生長添加劑還有乙醇（誘導熱休克蛋白的表達）、低分子量的巰基或二硫化合物（影響細胞周質的還原態，從而影響二硫鍵的形成）和NaCl[5]。

3、 供給豐富的培養基，創造最佳培養條件，如供氧、pH等。

包涵體的分離及溶解

對於生物制葯工業來說，包涵體的形成也是有利的，不僅可獲得高表達、高純度的重組蛋白質，還可避免細胞水解酶對重組蛋白質的破壞。由於包涵體是蛋白質聚集而成的緻密顆粒，分離的第一步是對培養收集的細胞進行破碎，比較有效的方法是高壓勻漿結合溶菌酶處理，然後5000~20000g離心，可使大部分包涵體沉澱，與可溶性蛋白分離，接著，包涵體沉澱需用去污劑（Triton X-100或脫氧膽酸鈉）和低濃度變性劑（2mol/L尿素或鹽酸胍等）洗滌除去脂類和膜蛋白，這一步很重要，否則會導致包涵體溶解和復性的過程中重組蛋白質的降解[6、7、8]。

包涵體的溶解必須用很強的變性劑，如8mol/L尿素、6~8mol/L鹽酸胍，通過離子間的相互作用破壞包涵體蛋白間的氫鍵而增溶蛋白。其中尿素的增溶效果稍差，異氰鹽酸胍最強；去污劑，如SDS[7]，可以破壞蛋白內的疏水鍵，可以增溶幾乎所有的蛋白，但由於無法徹底去除而不允許用在制葯行業中；酸，如70%甲酸[9]，可以破壞蛋白的次級鍵從而增溶蛋白，這種方法只適合少數蛋白質。對於含有半胱氨酸的蛋白，在增溶時應加入還原劑（如DTT、GSH、β-ME）打開蛋白質中所有二硫鍵，對於目標蛋白沒有二硫鍵的有時也應使用還原劑，為含二硫鍵的雜蛋白會影響包涵體的溶解，同時還應加入金屬螯合劑，如EDTA或EGTA，用來螯合Cu2+、Fe3+等金屬離子與還原狀態的巰基發生氧化反應[10]。

蛋白質的折疊機理

包涵體蛋白在變性劑作用下，為可溶性伸展態，在變性劑去除或濃度降低時，就會自發的從變性的熱不穩
狀態向熱力學穩定狀態轉變，形成具有生物活性的天然結構[11]。然而在去除變性劑的同時，重組蛋白質在體外折疊，分子間存在大量錯誤折疊和聚合，復性效率往往很低，包涵體蛋白折疊復性的效率實際上取決於正確折疊過程與聚集過程之間的競爭[1]。對於蛋白質的折疊機制，目前有多種不同的假設，但很多學者認為有一個「熔球態」的中間狀態，在「熔球態」中，蛋白質的二級結構已經基本形成，其空間結構也初具規模，再做一些局部調整就可形成正確的立體結構，總之，蛋白質的具體步驟可用下式描述[12、13、14]：
伸展態→中間體→後期中間體→天然態體→聚集體

在折疊反應中，從伸展態到中間體的速度是非常快的，只需要幾毫秒，但從中間體轉變為天然態的過程比較緩慢，是一個限速過程。聚集過程與復性過程相互競爭，故而應盡量避免聚集體的產生。一般認為，蛋白質在復性過程中涉及兩種疏水作用，一是分子內的疏水相互作用，可促進蛋白質正確折疊；一是部分折疊的肽鏈分子間的疏水相互作用，在復性過程中，部分折疊的中間體的疏水簇外露，分子間的疏水相互作用會導致蛋白質聚集。蛋白質的立體結構雖然由其氨基酸的順序決定，然而伸展肽鏈折疊為天然活性結構的過程還受到周圍環境的影響，如溫度、pH值、離子強度、復性時間等因素的影響。

提高重組蛋白質折疊復性的方法

一個有效的、理想的折疊復性方法應具備以下幾個特點：活性蛋白質的回收率高；正確復性的產物易於與錯誤折疊蛋白質分離；折疊復性後應得到濃度較高的蛋白質產品；折疊復性方法易於放大；復性過程耗時較少[15]。

1、 透析、稀釋和超濾復性法：這三種方法是最傳統也是應用最普遍的蛋白質折疊復性方法，復性活性回收率低，而且難於與雜蛋白分離。透析法耗時長，易形成無活性蛋白質聚集體；超濾法在膜上聚集變性，易造成膜污染；稀釋法處理量太大，不利於工業放大[16]。

2、 高蛋白濃度下的復性方法：一個成功的復性過程在於能夠在高蛋白濃度下仍能得到較高的復性率。一個方法是把變性蛋白緩慢連續或不連續地加入到復性液中[17]。在兩次蛋白加入之間，應有足夠的時間間隔使蛋白質折疊通過了易聚集的中間體階段。這是由於完全折疊的蛋白通常不會與正在折疊的蛋白一起聚集。第二種方法是用溫度跳躍策略[4]。變性蛋白在低溫下復性折疊以減少聚集，直到易聚集的中間體大都轉化為不易聚集的後期中間體後，溫度快速升高來促進後期中間體快速折疊為蛋白的天然構象。第三種方法是復性在中等的變性劑濃度下進行[18]，變性劑濃度應高到足以有效防止聚集，同時又必須低到能夠引發正確復性。

3、 添加促進劑的復性方法：包涵體蛋白質折疊復性促進劑的促進作用可以分為：穩定正確折疊蛋白質的天然結構、改變錯誤折疊蛋白質的穩定性、增加折疊復性中間體的溶解性、增加非折疊蛋白質的溶解性。通常使用的添加劑有：a、共溶劑：如PEG6000~20000，通過與中間體特異的形成非聚集的復合物，可以阻止蛋白質分子間的相互碰撞機會，減少蛋白質的聚集；b、去污劑及表面活性劑：如Trition X-100、CHAPs、磷脂、磺基甜菜鹼等對蛋白質復性有促進作用，但它們能與蛋白質結合，很難去除；c、氧化-還原劑：對於含有二硫鍵的蛋白，復性過程中應加入氧化還原體系，如GSH/GSSG、DTT/GSSG、DTE/GSSG等，氧化還原系統通過促進不正確形成的二硫鍵快速交換反應，提高了正確配對的二硫鍵的產率[19]；d、小分子的添加劑：如鹽酸胍或尿素、烷基脲、碳酸醯胺類等，都可阻止蛋白聚集，它們的作用可能為：穩定蛋白的活性狀態、降低非正確折疊的穩定性、增加折疊中間體的穩定性、增加解折疊狀態的穩定性。e、0.4~0.6M L-Arg：L-Arg能使得不正確折疊的蛋白質結構以及不正確連接的二硫鍵變得不穩定，使折疊向正確方向進行，可大幅度地提高包涵體蛋白質的折疊效率。f、添加分子伴侶和折疊酶：分子伴侶是指能夠結合和穩定

㈣ 包涵體的實驗方法

1、機械破碎
2、超聲破碎
3、化學方法破碎 可以破壞蛋白的次級鍵從而增溶蛋白。如有人在pH>9.0溶解牛生長激素和牛凝乳蛋白酶包涵體。有些蛋白可以溶解在60mMHCl中。這些方法只適合於少部分蛋白的增溶。
變性劑的使用濃度和作用時間：一般在偏鹼性性的環境中如pH8.0-9.0，尿素在鹼性環境中不穩定，一般不要超過pH1.0。有些蛋白只能用鹽酸胍如IL-4。增溶時一般室溫過夜，但鹽酸胍在37度1小時便可以使多數蛋白完全變性溶解。 通過緩慢去除變性劑使目標蛋白從變性的完全伸展狀態恢復到正常的折疊結構，同時去除還原劑使二硫鍵正常形成。一般在尿素濃度4M左右時復性過程開始，到2M左右時結束。對於鹽酸胍而言，可以從4M開始，到1.5M 時復性過程已經結束。
復性中常採用
稀釋復性：直接加入水或緩沖液，放置過夜，缺點是體積增加較大，變性劑稀釋速度太快，不易控制。
透析復性：好處是不增加體積，通過逐漸降低外透液濃度來控制變性劑去除速度，有人稱易形成沉澱，且不適合大規模操作，無法應用到生產規模。超濾復性：在生產中較多的使用，規模較大，易於對透析速度進行控制，缺點是不適合樣品量較少的情況，且有些蛋白可能在超濾過程中不可逆的變性。
柱上復性：是研究較多並成功的在生產中應用的一種復性方法，如華北制葯的G-CSF復性據說是通過柱上復性進行的。常用於復性的層析方法有SEC、HIC等。 還原劑一般和變性劑的去除一起慢慢的氧化去除，使二硫鍵慢慢形成。但是由於二硫鍵的形成並不是蛋白質正確折疊所必須的，可以考慮在變性劑完全去除之後，在去除還原劑使已經按照正確的結構相互接近的巰基間形成正確的二硫鍵。
常用的氧化方法有：
空氣氧化法：在鹼性條件下通空氣，或者加入二價銅離子，能夠取得更好的效果，缺點是不易控制氧化還原電勢。
氧化還原電對（redox）：常採用GSSG/GSH，通過調整兩者的比例來控制較精確的氧化還原電勢，也可以在添加了還原劑如BME、DTT的增溶液中直接加入GSSG，如：5mMGSSG/2mM DTT=GSH/GSSG(1.33/1）。 1、共溶劑：如PEG6000-20000，據說可以可逆的修飾折疊中間體的疏水集團，此外由於阻止了蛋白質分子間的相互接觸的機會，也可能對復性效率的提高起作用。一般的使用濃度在0.1%左右，具體條件可根據實驗條件確定。
2、二硫鍵異構酶（PDI）和脯氨酸異構酶（PPI）：PDI可以使錯配的二硫鍵打開並重新組合，從而有利於恢復到正常的結構，此外在復性過程中蛋白質的脯氨酸兩種構象間的轉變需要較高能量，常常是復性過程中的限速步驟，而PPI的作用是促進兩種構象間的轉變，從而促進復性的進行。
3、分子伴侶，即熱休克蛋白（HSP），是一種沒有蛋白質特異性的促進折疊的蛋白因子，研究發現很多蛋白在缺乏分子伴侶時無法自己正確的折疊。有人構建了與伴侶分子共同表達的菌株，據說效果不錯。不過在生產中還沒有看到2和3的應用的例子。
4、0.4-0.6ML-Arg：成功的應用於很多蛋白如t-PA的復性中，可以抑制二聚體的形成。
5、甘油等：增加黏度，減少分子碰撞機會，一般使用濃度在%5-30%。
6、一定的鹽濃度，可能是為了降低某些帶電集團間的斥力，有利於蛋白質的折疊。
7、輔助因子：添加蛋白質活性狀態必須的輔助因子如輔酶輔基等或蛋白配體等很多時候對蛋白質正確的折疊是有利的。
8、色譜法：通過將目標蛋白結合到層析柱上，減少蛋白分子間的相互影響，該方法得到越來越多的應用，常用的色譜有SEC、HIC、IEC、IMAC等。
當然，雖然有很多所謂的理性的復性方案設計，復性工作更多的是一個經驗的過程，沒有一種通用的方法可以套用。 根據具體的蛋白性質和需要，可以從生化、免疫、物理性質等方面對蛋白質的復性效率進行檢測。
1、凝膠電泳：一般可以用非變性的聚丙烯醯胺凝膠電泳可以檢測變性和天然狀態的蛋白質，或用非還原的聚丙烯醯胺電泳檢測有二硫鍵的蛋白復性後二硫鍵的配對情況。
2、光譜學方法：可以用紫外差光譜、熒光光譜、圓二色性光譜（CD）等，利用兩種狀態下的光譜學特徵進行復性情況的檢測，但一般只用於復性研究中的過程檢測。
3、色譜方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由於兩種狀態的蛋白色譜行為不同。
4、生物學活性及比活測定：一般用細胞方法或生化方法進行測定，較好的反映了復性蛋白的活性，值得注意的是，不同的測活方法測得的結果不同，而且常常不能完全反映體內活性。
5、黏度和濁度測定：復性後的蛋白溶解度增加，變性狀態時由於疏水殘基暴露，一般水溶性很差，大多形成可見的沉澱析出。
6、免疫學方法：如ELISA、WESTERN等，特別是對結構決定簇的抗體檢驗，比較真實的反映了蛋白質的折疊狀態。 1、MHCⅡ JBC 269(47）：1994
增溶：16-40mg Protein,8MGdnHCl,16-32mM DTT,1mM EDTA,50mM Tris pH8.037度1hr.
復性：8-16fold dilution to1-5mg/ml Protein.
2、增溶：10mM DTT,0.1%SDS,25mM Tris,200mMGlucine pH8.5.
復性：10倍稀釋到10mM DTT,2mMDodOMalt(dodecyl-beta-D-maltoside),150mMNaCl,10mMTris pH8.0.對起始緩沖液密閉透析16hr，開口透析8hr，對150mMNaCl,10mM Tris pH8.0透析48hr。
3、Bovine Prethrombin-2,JBC 270⑴：1990 四對二硫鍵。
增溶：7M GdnHCl,10mMTris pH8.0,1mM EDTA 4mg/ml.
復性：稀釋到100mM Na2HPO4,2 mM EDTA,0.1% PEG,0-4M GdnHCl,0.1 mM GSSG,0.2 mM GSH,pH7.4,0.025 mg/ml Protein.RT 24hr.對4L 25mM sodiumphosphate,2mM EDTA,0.1%PEG,pH7.4 透析3次，溫度4度。 一般說來，復性液的體積較大，為了減少處理體積，在進行柱純化以前可以先進行硫酸銨沉澱，沉澱在低速離心收集後復溶的鹽濃度較高，可以直接進行HIC純化，目標峰經適當稀釋後（cond<5mS/cm）進行IEX純化，然後通過SEC脫鹽，更換緩沖液，除菌過濾後，在質量合格的情況下便可以進入制劑階段。
當然在復性濃度較高的情況下，也可以直接將復性液進行IEX純化，優點是在純化的同時進行體積的濃縮，為以後的精製創造條件。
從生產的角度看，由於每增加一步純化工序便降低很多收率，所以可過兩到三次柱純化，工藝越簡單越有利於收率的提高。當然這只是一個一般的原則，對於純度要求較高的產品如重組人白蛋白，不得不進行多次純化。 1. 真核細胞表達外源蛋白質的缺點
一些蛋白質需要翻譯後的修飾，如糖基化，則必須選用真核細胞。但是無論是正在臨床的還是市場上的蛋白質葯物，主要的是以大腸桿菌作為宿主細胞。
1982年第一次選用大腸桿菌作為表達重組DNA的宿主細胞，表達的產物是人胰島素。選擇原核細胞作為表達載體，因為真核細胞表達外源蛋白質有其缺點：⑴真核細胞的天然蛋白質的表達和外源蛋白質的表達，表達量相當少，即使有的蛋白質表達量高時，容易出現蛋白質的無活性的現象，或者形成聚集體；而原核細胞表達的蛋白質量比真核細胞大很多；
⑵相對於大腸桿菌，人類對於真核細胞的基因的了解還是有限的，而對大腸桿菌的基因了解的相當透徹，並能進行熟練的基因重組等操作對大腸桿菌的基因進行改造；
⑶真核細胞生長到高密度需要更長的時間（7天左右），並且細胞的最終濃度低，所以需要較大的培養容器，而大腸桿菌可以在幾個h以內達到108cells/mL；
⑷動物細胞生長的培養液的造價較高，並且大部分使用血清作為生長液的添加劑，從而提高了產品的造價並且不利於以後的純化步驟；
⑸原核細胞的堅硬的細胞壁，可以使用簡單的攪拌的方法完成傳熱、傳質過程，而大部分的真核細胞需要溫和的培養方法及復雜的操作以達到其對培養基的要求。
基於以上的原因，真核細胞尤其是哺乳動物細胞表達外源蛋白質大部分處在研究階段，大部分重組蛋白質使用的表達載體是大腸桿菌細胞。大腸桿菌表達的外源蛋白質量相當大，有時達到細胞內蛋白質總量的5-20%，甚至達到50%以上。但是，大腸桿菌表達的蛋白質，當含量相當大時，有時由於原核細胞缺少分泌到胞外的機制或者折疊的機制，最後表達的蛋白質往往以無活性的包涵體的形式存在。
2. 包涵體表達蛋白質的優越性
為了研究基因的功能，可以把體內的基因轉移到其他表達宿主中，研究基因表達性狀以確定基因的功能。但是，外源基因的表達，特別是真核生物基因在大腸桿菌中的表達，由於宿主菌缺乏此種基因表達的調控機制，細胞內的化學環境與其天然環境差異，如氧化還原環境、胞內pH、自由水的濃度，以及外源基因的導入，使得表達目的蛋白質的細胞在非正常狀態下生長，表達的蛋白質多數以無活性的包涵體的形式存在。
在下游生產過程中特別是在醫葯生產中，以包涵體形式表達的蛋白質具有一些優越性。
⑴ 異源表達的蛋白質很容易被宿主細胞內的蛋白質酶降解，如果重組蛋白質以包涵體形式表達，由於包埋了酶攻擊的位點，可以最大限度地抵抗蛋白質酶的攻擊；
⑵ 包涵體表達的蛋白質沒有活性，細胞破碎和以後的純化步驟不用考慮蛋白質的失活問題；
⑶ 包涵體形式表達的蛋白質與宿主細胞的其他蛋白質的分離比可溶蛋白質的分離方法簡便，造價低，使用簡單的離心或者過濾的手段就能使包涵體與宿主細胞的其他蛋白質成分進行有效的分離；
⑷ 有些表達的外源蛋白質對細胞有毒性或者致死，大量表達時會導致細胞的死亡，最終的細胞數量和產物相當低；而包涵體形式的蛋白質由於喪失了生物活性從而可以高效大量地表達；
⑸ 對於以包涵體形式表達的產物可以比較容易進行在線觀測定性，含有包涵體蛋白質的細胞有較大的折射率，不必像可溶的蛋白質需要細胞破碎後使用酶學或者電泳學的方法進行鑒定。
包涵體的形成和蛋白質在等電點或者高鹽情況下的沉澱是不同的。在沉澱過程中，分子是通過分子表面的相互作用而形成的分子的聚集，無論在聚集的沉澱狀態還是在天然狀態，沒有明顯的構象的變化。因此，當溶液中的pH重新改變，或者沉澱重新溶解的時候，蛋白質的結構和活性會重新獲得。蛋白質的包涵體形式的聚集則不同於蛋白質的沉澱，把包涵體蛋白質直接溶解在天然的緩沖液中得不到天然的構象，無活性的聚集體與其天然活性形式之間沒有自然的平衡轉化的過程。包涵體的形成是由於范氏引力、疏水作用力和二硫鍵等作用力形成的，破壞這些作用力比較困難，溶解包涵體需要加入強的變性劑破壞多肽鏈之間的作用力，說明聚集體的多肽鏈之間的作用力遠遠大於普通的沉澱的分子間的作用力。當變性劑溶解的包涵體只是簡單地通過稀釋或者透析除去變性劑，而不是尋找合適的復性的條件的話，聚集體會重新形成，並且，不同於沉澱溶解的100%的活性的保留，包涵體的復性水平往往很低。所以，蛋白質沉澱是活性的天然蛋白質之間的作用力形成的，而包涵體的形成是在細胞內新合成的蛋白質肽鏈中間體而形成的，體外折疊時的聚集體是折疊過程中折疊中間體形成的。這些折疊的中間體並不一定是形成高級天然結構的中間體，從天然結構也不能推論出折疊中間體的構象。

㈤ 超濾膜的常見污染是什麼清洗方法是什麼

超濾膜的清洗，又可分為物理清洗法和化學清洗法兩種。

一、物理清洗法：

在這方面用的最多最普遍的就是水力沖洗法。它又可因水力沖洗方向的不同，分為逆向沖洗、反沖洗和正洗沖洗。

酸性清洗劑常用的有0.1N鹽酸溶液，0.1M草酸溶液，1～3%檸檬酸、檸檬酸胺、EDTA等。這類清洗劑在去除鈣離子、鎂離子、氟離子等金屬離子及其氫氧化物，無機鹽凝膠層是較為有效的。

鹼性清洗劑主要是0.1～0.5%的NaOH水溶液。它對去除蛋白質，油脂類的污染具有良好的效果。

氧化性清洗劑如1～1.5%雙氧水、0.5～1%NaOCl、0.05～0.1%疊氮酸鈉等，對去除有機物質的污染有顯著效果。

生物酶制劑如1%胃蛋白酶、胰蛋白酶等，對去除蛋白質、多糖、油脂類的污染是有效的。對去除有機物污染也有一定效果。應用酶清洗劑時，如能在55～60℃下進行清洗效果更佳。清洗時間的長短與酶濃度的高低有關。

超濾膜在特定條件下採用化學清洗方法雖是必要，但使用時須慎重。要避免化學清洗劑破壞膜的分離性能；不能使污染物發生變形，加重膜的污染；不應破壞污染物的膠體性質，使它變硬僵化。在食品工業，醫葯工業生產中，不能讓清洗劑的殘留物影響產品質量等。

㈥ 在包涵體細胞的變性與復性中實驗中，最有可能用到哪個

您好！您這里可能有些概念錯誤。
① 包涵體就是蛋白的變性聚集後的產物，6M鹽酸胍及8M尿素是作為溶解包涵體的溶劑。
② 復性的過程是逐步去除鹽酸胍或者尿素，從而使得蛋白天然構象逐步形成。
所以一般如果起始使用的是6M鹽酸胍進行包涵體溶解，這個過程中逐步降低的是鹽酸胍的濃度。梯度離心或者差速離心去除細胞碎片，一般1000r/min左右就差不多可以達到效果。包涵體是表達過快的蛋白來不及折疊而形成的蛋白團，所以一般蛋白純度能夠達到95%以上，用6M鹽酸胍就基本把包涵體分開，再超濾一下加上緩沖液就基本上很純了

㈦ 超濾管能用於強鹼或強酸溶液的超濾嗎

1、選擇合適的超濾管，主要考慮MWCO和濃縮體積，最常見的是Ultra-15（10kD）。
通常應截留分子量版不應大於目的蛋白分子量的權1/3，比如目的蛋白分子量為35kDa，就可以選擇10kDa截留分子量的超濾管。
若目的蛋白分子量為10kD左右，則可以用截留分子量3kD的超濾管。
認真閱讀使用說明書，注意超濾膜對各種化學物質的耐受程度有所不同，表格中有。
2、新買來的超濾是乾燥的，使用前加入MilliQ水，水量完全過膜，冰浴或冰箱里預冷幾分鍾。
然後將水倒出，即可加入蛋白液，加入的多少，以不超過管頂的白線為准。
操作要輕，加入蛋白液前，超濾管需要插在冰上預冷。
3、平衡。
質量和重心二者都要達到平衡。
注意轉速和加速度不可太快，否則直接損壞超濾膜。
注意，一定要等離心機達到目的轉速之後，方可離開
離心機，否則離心機出問題時，無法第一時間處理，後果不可預測。
膜與轉軸的方向根據說明書調整（角轉離心機的情況是膜與軸垂直）。
在實際使用中，一般轉速開的比說明書里的要低，這樣可以延長離心管的使用壽命。

㈧ 超濾膜該怎麼清洗呢

超濾膜的清洗方法：

一、物理清洗法：

物理方法其實就是用有一定壓力的水去沖洗超濾膜，這也是最常用的方法。因為這個水沖洗的方向不一樣，又可以分為逆向沖洗、反沖洗和正洗沖洗。

1.逆向沖洗：用原水沖洗膜內和進水端面的雜質。

2.反沖洗：用超濾水從膜塊表面的污染物沖鬆散、剝落，分別從進水口和濃縮口排出(可加酸、鹼或次氯酸鈉等葯品加強清洗效果)。

二、化學清洗法：

利用化學葯品與膜面雜質進行化學反應來達到清洗膜的目的

酸溶液清洗：常用溶液有鹽酸、檸檬酸、草酸等，調配溶液的PH=2~3，利用循環清洗或者浸泡0.5h~1h後循環清洗，對無機雜質去除效果較好。

鹼溶液清洗：常用的鹼主要有NaOH ，調配溶液的PH=10~12左右，利用水循環操作清洗或浸泡0.5h~1h後循環清洗，可有效去除雜質及油脂。

氧化劑清洗劑：利用1%~3%H2O2、 500~1000mg/L NaClO 等水溶液清洗超濾膜，可以去除污垢，殺滅細菌。H2O2和NaClO是常用的殺菌劑。

加酶洗滌劑：如0.5%~1.5%胃蛋白酶、胰蛋白酶等，對去除蛋白質、多糖、油脂類污染物質有效。

進行方法與正常超濾過程相同，清洗液自原液入口處進入，濃縮液及超濾液全部返回清洗液容器，循環後排放，以凈水洗凈即可。

㈨ 超濾膜化學清洗方法

化學清洗：隨著超濾膜組件的長期使用，當超濾膜的產水量下降20%以上版或使用了1-4個月時，便需要對超濾權膜進行化學清洗，以便及時去除超濾膜上的污染物，防止超濾膜形成頑固性結垢。一般情況的化學清洗，分為酸洗，鹼洗
A、
酸洗：使用檸檬酸將葯液箱內的RO反滲透水(或超濾水)的PH值調到PH=2，啟動葯液泵，調節節閥使壓力表顯示壓力P=0.20MPa,循環酸洗30分鍾後使用超濾水將超濾膜沖洗干凈為止。
B、鹼洗：使用氫氧化鈉和次氯酸鈉將葯液箱內的RO反滲透水(或超濾水)調節PH=12，啟動葯液泵，調節調節閥使壓力表顯示壓力P=0.20MPa，循環鹼洗30分鍾後使用超濾水將超濾膜沖洗干凈為止。

㈩ 如何利用透析法進行脫鹽濃縮蛋白

二、蛋白質的分離純化
蛋白質的分離純化方法很多，主要有：
（一）根據蛋白質溶解度不同的分離方法
1、蛋白質的鹽析
中性鹽對蛋白質的溶解度有顯著影響，一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高，蛋白質的溶解度增加，此稱鹽溶；當鹽濃度繼續升高時，蛋白質的溶解度不同程度下降並先後析出，這種現象稱鹽析，將大量鹽加到蛋白質溶液中，高濃度的鹽離子（如硫酸銨的SO4和NH4)有很強的水化力，可奪取蛋白質分子的水化層，使之「失水」，於是蛋白質膠粒凝結並沉澱析出。鹽析時若溶液pH在蛋白質等電點則效果更好。由於各種蛋白質分子顆粒大小、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣，因此調節混合蛋白質溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質分段沉澱。
影響鹽析的因素有：（1）溫度：除對溫度敏感的蛋白質在低溫（4度）操作外，一般可在室溫中進行。一般溫度低蛋白質溶介度降低。但有的蛋白質（如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白）在較高的溫度（25度）比0度時溶解度低，更容易鹽析。（2）pH值：大多數蛋白質在等電點時在濃鹽溶液中的溶介度最低。（3）蛋白質濃度：蛋白質濃度高時，欲分離的蛋白質常常夾雜著其他蛋白質地一起沉澱出來（共沉現象）。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋，使蛋白質含量在2.5-3.0%。
蛋白質鹽析常用的中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。
其中應用最多的硫酸銨，它的優點是溫度系數小而溶解度大（25度時飽和溶液為4.1M，即767克/升；0度時飽和溶解度為3.9M，即676克/升），在這一溶解度范圍內，許多蛋白質和酶都可以鹽析出來；另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好，不易引起蛋白質變性。硫酸銨溶液的pH常在4.5-5.5之間，當用其他pH值進行鹽析時，需用硫酸或氨水調節。
蛋白質在用鹽析沉澱分離後，需要將蛋白質中的鹽除去，常用的辦法是透析，即把蛋白質溶液裝入秀析袋內（常用的是玻璃紙），用緩沖液進行透析，並不斷的更換緩沖液，因透析所需時間較長，所以最好在低溫中進行。此外也可用葡萄糖凝膠G-25或G-50過柱的辦法除鹽，所用的時間就比較短。
2、等電點沉澱法
蛋白質在靜電狀態時顆粒之間的靜電斥力最小，因而溶解度也最小，各種蛋白質的等電點有差別，可利用調節溶液的pH達到某一蛋白質的等電點使之沉澱，但此法很少單獨使用，可與鹽析法結合用。
3、低溫有機溶劑沉澱法
用與水可混溶的有機溶劑，甲醇，乙醇或丙酮，可使多數蛋白質溶解度降低並析出，此法分辨力比鹽析高，但蛋白質較易變性，應在低溫下進行。
（二）根據蛋白質分子大小的差別的分離方法
1、透析與超濾
透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質分開。
超濾法是利用高壓力或離心力，強使水和其他小的溶質分子通過半透膜，而蛋白質留在膜上，可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質。
2、凝膠過濾法
也稱分子排阻層析或分子篩層析，這是根據分子大小分離蛋白質混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠（Sephadex
ged）和瓊脂糖凝膠（agarose gel）。
（三）根據蛋白質帶電性質進行分離
蛋白質在不同pH環境中帶電性質和電荷數量不同，可將其分開。
1、電泳法
各種蛋白質在同一pH條件下，因分子量和電荷數量不同而在電場中的遷移率不同而得以分開。值得重視的是等電聚焦電泳，這是利用一種兩性電解質作為載體，電泳時兩性電解質形成一個由正極到負極逐漸增加的pH梯度，當帶一定電荷的蛋白質在其中泳動時，到達各自等電點的pH位置就停止，此法可用於分析和制備各種蛋白質。
2、離子交換層析法
離子交換劑有陽離子交換劑（如：羧甲基纖維素；CM-纖維素）和陰離子交換劑（二乙氨基乙基纖維素；DEAE?FONT
FACE="宋體"
LANG="ZH-CN">纖維素），當被分離的蛋白質溶液流經離子交換層析柱時，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質被吸附在離子交換劑上，隨後用改變pH或離子強度辦法將吸附的蛋白質洗脫下來。（詳見層析技術章）
（四）根據配體特異性的分離方法－親和色譜法
親和層析法（aflinity
chromatography）是分離蛋白質的一種極為有效的方法，它經常只需經過一步處理即可使某種待提純的蛋白質從很復雜的蛋白質混合物中分離出來，而且純度很高。這種方法是根據某些蛋白質與另一種稱為配體(Ligand）的分子能特異而非共價地結合。其基本原理：蛋白質在組織或細胞中是以復雜的混合物形式存在，每種類型的細胞都含有上千種不同的蛋白質，因此蛋白質的分離（Separation），提純（Purification）
和鑒定（Characterization）是生物化學中的重要的一部分，至今還沒的單獨或一套現成的方法能移把任何一種蛋白質從復雜的混合蛋白質中提取出來，因此往往採取幾種方法聯合使用。
細胞的破碎
1、高速組織搗碎：將材料配成稀糊狀液，放置於筒內約1/3體積，蓋緊筒蓋，將調速器先撥至最慢處，開動開關後，逐步加速至所需速度。此法適用於動物內臟組織、植物肉質種子等。
2、玻璃勻漿器勻漿：先將剪碎的組織置於管中，再套入研桿來回研磨，上下移動，即可將細胞研碎，此法細胞破碎程度比高速組織搗碎機為高，適用於量少和動物臟器組織。
3、超聲波處理法：用一定功率的超聲波處理細胞懸液，使細胞急劇震盪破裂，此法多適用於微生物材料，用大腸桿菌制備各種酶，常選用50-100毫克菌體/毫升濃度，在1KG至10KG頻率下處理10-15分鍾，此法的缺點是在處理過程會產生大量的熱，應採取相應降溫措施。對超聲波敏感和核酸應慎用。
4、反復凍融法：將細胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復幾次，由於細胞內冰粒形成和剩餘細胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細胞結構破碎。
5、化學處理法：有些動物細胞，例如腫瘤細胞可採用十二烷基磺酸鈉（SDS）、去氧膽酸鈉等細胞膜破壞，細菌細胞壁較厚，可採用溶菌酶處理效果更好。

無論用哪一種方法破碎組織細胞，都會使細胞內蛋白質或核酸水解酶釋放到溶液中，使大分子生物降解，導致天然物質量的減少，加入二異丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或減慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺醯氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酥活力，但不是全部，還可通過選擇pH、溫度或離子強度等，使這些條件都要適合於目的物質的提取。
濃縮、乾燥及保存
一、樣品的濃縮
生物大分子在制備過程中由於過柱純化而樣品變得很稀，為了保存和鑒定的目的，往往需要進行濃縮。常用的濃縮方法的：
1、減壓加溫蒸發濃縮
通過降低液面壓力使液體沸點降低，減壓的真空度愈高，液體沸點降得愈低，蒸發愈快，此法適用於一些不耐熱的生物大分子的濃縮。
2、空氣流動蒸發濃縮
空氣的流動可使液體加速蒸發,鋪成薄層的溶液，表面不斷通過空氣流；或將生物大分子溶液裝入透析袋內置於冷室，用電扇對准吹風，使透過膜外的溶劑不沁蒸發，而達到濃縮目的，此法濃縮速度慢，不適於大量溶液的濃縮。
3、冰凍法
生物大分子在低溫結成冰，鹽類及生物大分子不進入冰內而留在液相中，操作時先將待濃縮的溶液冷卻使之變成固體，然後緩慢地融解，利用溶劑與溶質融點介點的差別而達到除去大部分溶劑的目的。如蛋白質和酶的鹽溶液用此法濃縮時，不含蛋白質和酶的純冰結晶浮於液面，蛋白質和酶則集中於下層溶液中，移去上層冰塊，可得蛋白質和酶的濃縮液。
4、吸收法
通過吸收劑直接收除去溶液中溶液分子使之濃縮。所用的吸收劑必需與溶液不起化學反應，對生物大分子不吸附，易與溶液分開。常用的吸收劑有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝膠等，使用聚乙二醇吸收劑時，先將生物大分子溶液裝入半透膜的袋裡，外加聚乙二醇復蓋置於4度下，袋內溶劑滲出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水飽和後要更換新的直至達到所需要的體積。
5、超濾法
超濾法是使用一種特別的薄膜對溶液中各種溶質分子進行選擇性過濾的方法，不液體在一定壓力下（氮氣壓或真空泵壓）通過膜時，溶劑和小分子透過，大分子受阻保留，這是近年來發展起來的新方法，最適於生物大分子尤其是蛋白質和酶的濃縮或脫鹽，並具有成本低，操作方便，條件溫和，能較好地保持生物大分子的活性，回收率高等優點。應用超濾法關鍵在於膜的選擇，不同類型和規格的膜，水的流速，分子量截止值（即大體上能被膜保留分子最小分子量值）等參數均不同，必須根據工作需要來選用。另外，超濾裝置形式，溶質成份及性質、溶液濃度等都對超濾效果的一定影響。Diaflo
超濾膜的分子量截留值：
膜名稱分子量截留值孔的大的平均直徑
XM－300300，000140
XM－200100，00055
XM－5050，00030
PM－30 30，00022
UM－2020，00018
PM－1010，00015
UM－21，00012
UM05500 10

用上面的超濾膜製成空心的纖維管，將很多根這樣的管攏成一束，管的兩端與低離子強度的緩沖液相連，使緩沖液不斷地在管中流動。然後將纖維管浸入待透析的蛋白質溶液中。當緩沖液流過纖維管時，則小分子很易透過膜而擴散，大分子則不能。這就是纖維過濾秀析法，由於透析面積增大，因而使透析時間縮短10倍。