耐甲苯超濾膜

Ⅳ 制備蛋白質類制劑需注意哪些問題

可以根據其特點選擇適當的溫度(0-4度）

選擇材料及預處理

以蛋白質和結構與功能為基礎，從分子水平上認識生命現象，已經成為現代生物學發展的主要方向，研究蛋白質，首先要得到高度純化並具有生物活性的目的物質。蛋白質的制備工作涉及物理、化學和生物等各方面知識，但基本原理不外乎兩方面。一是得用混合物中幾個組分分配率的差別，把它們分配到可用機械方法分離的兩個或幾個物相中，如鹽析，有機溶劑提取，層析和結晶等；二是將混合物置於單一物相中，通過物理力場的作用使各組分分配於來同區域而達到分離目的，如電泳，超速離心，超濾等。在所有這些方法的應用中必須注意保存生物大分子的完整性，防止酸、鹼、高溫，劇烈機械作用而導致所提物質生物活性的喪失。蛋白質的制備一般分為以下四個階段：選擇材料和預處理，細胞的破碎及細胞器的分離，提取和純化，濃細、乾燥和保存。

微生物、植物和動物都可做為制備蛋白質的原材料，所選用的材料主要依據實驗目的來確定。對於微生物，應注意它的生長期，在微生物的對數生長期，酶和核酸的含量較高，可以獲得高產量，以微生物為材料時有兩種情況：（1）得用微生物菌體分泌到培養基中的代謝產物和胞外酶等；（2）利用菌體含有的生化物質，如蛋白質、核酸和胞內酶等。植物材料必須經過去殼，脫脂並注意植物品種和生長發育狀況不同，其中所含生物大分子的量變化很大，另外與季節性關系密切。對動物組織，必須選擇有效成份含量豐富的臟器組織為原材料，先進行絞碎、脫脂等處理。另外，對預處理好的材料，若不立即進行實驗，應冷凍保存，對於易分解的生物大分子應選用新鮮材料制備。

蛋白質的分離純化

一，蛋白質（包括酶）的提取

大部分蛋白質都可溶於水、稀鹽、稀酸或鹼溶液，少數與脂類結合的蛋白質則溶於乙醇、丙酮、丁醇等有機溶劑中，因些，可採用不同溶劑提取分離和純化蛋白質及酶。

（一）水溶液提取法

稀鹽和緩沖系統的水溶液對蛋白質穩定性好、溶解度大、是提取蛋白質最常用的溶劑，通常用量是原材料體積的1-5倍，提取時需要均勻的攪拌，以利於蛋白質的溶解。提取的溫度要視有效成份性質而定。一方面，多數蛋白質的溶解度隨著溫度的升高而增大，因此，溫度高利於溶解，縮短提取時間。但另一方面，溫度升高會使蛋白質變性失活，因此，基於這一點考慮提取蛋白質和酶時一般採用低溫（5度以下）操作。為了避免蛋白質提以過程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制劑（如二異丙基氟磷酸，碘乙酸等）。
下面著重討論提取液的pH值和鹽濃度的選擇。
1、pH值
蛋白質，酶是具有等電點的兩性電解質，提取液的pH值應選擇在偏離等電點兩側的pH 范圍內。用稀酸或稀鹼提取時，應防止過酸或過鹼而引起蛋白質可解離基團發生變化，從而導致蛋白質構象的不可逆變化，一般來說，鹼性蛋白質用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白質用偏鹼性的提取液。
2、鹽濃度
稀濃度可促進蛋白質的溶，稱為鹽溶作用。同時稀鹽溶液因鹽離子與蛋白質部分結合，具有保護蛋白質不易變性的優點，因此在提取液中加入少量NaCl等中性鹽，一般以0.15摩爾。升濃度為宜。緩沖液常採用0.02-0.05M磷酸鹽和碳酸鹽等滲鹽溶液。

（二）有機溶劑提取法

一些和脂質結合比較牢固或分子中非極性側鏈較多的蛋白質和酶，不溶於水、稀鹽溶液、稀酸或稀鹼中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑，它們具的一定的親水性，還有較強的親脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必須在低溫下操作。丁醇提取法對提取一些與脂質結合緊密的蛋白質和酶特別優越，一是因為丁醇親脂性強，特別是溶解磷脂的能力強；二是丁醇兼具親水性，在溶解度范圍內（度為10%，40度為6.6%）不會引起酶的變性失活。另外，丁醇提取法的pH及溫度選擇范圍較廣，也適用於動植物及微生物材料。

二、蛋白質的分離純化

蛋白質的分離純化方法很多，主要有：

（一）根據蛋白質溶解度不同的分離方法

1、蛋白質的鹽析
中性鹽對蛋白質的溶解度有顯著影響，一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高，蛋白質的溶解度增加，此稱鹽溶；當鹽濃度繼續升高時，蛋白質的溶解度不同程度下降並先後析出，這種現象稱鹽析，將大量鹽加到蛋白質溶液中，高濃度的鹽離子（如硫酸銨的SO4和NH4)有很強的水化力，可奪取蛋白質分子的水化層，使之「失水」，於是蛋白質膠粒凝結並沉澱析出。鹽析時若溶液pH在蛋白質等電點則效果更好。由於各種蛋白質分子顆粒大小、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣，因此調節混合蛋白質溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質分段沉澱。
影響鹽析的因素有：（1）溫度：除對溫度敏感的蛋白質在低溫（4度）操作外，一般可在室溫中進行。一般溫度低蛋白質溶介度降低。但有的蛋白質（如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白）在較高的溫度（25度）比0度時溶解度低，更容易鹽析。（2）pH值：大多數蛋白質在等電點時在濃鹽溶液中的溶介度最低。（3）蛋白質濃度：蛋白質濃度高時，欲分離的蛋白質常常夾雜著其他蛋白質地一起沉澱出來（共沉現象）。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋，使蛋白質含量在2.5-3.0%。
蛋白質鹽析常用的中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。 其中應用最多的硫酸銨，它的優點是溫度系數小而溶解度大（25度時飽和溶液為4.1M，即767克/升；0度時飽和溶解度為3.9M，即676克/升），在這一溶解度范圍內，許多蛋白質和酶都可以鹽析出來；另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好，不易引起蛋白質變性。硫酸銨溶液的pH常在4.5-5.5之間，當用其他pH值進行鹽析時，需用硫酸或氨水調節。
蛋白質在用鹽析沉澱分離後，需要將蛋白質中的鹽除去，常用的辦法是透析，即把蛋白質溶液裝入秀析袋內（常用的是玻璃紙），用緩沖液進行透析，並不斷的更換緩沖液，因透析所需時間較長，所以最好在低溫中進行。此外也可用葡萄糖凝膠G-25或G-50過柱的辦法除鹽，所用的時間就比較短。

2、等電點沉澱法
蛋白質在靜電狀態時顆粒之間的靜電斥力最小，因而溶解度也最小，各種蛋白質的等電點有差別，可利用調節溶液的pH達到某一蛋白質的等電點使之沉澱，但此法很少單獨使用，可與鹽析法結合用。

3、低溫有機溶劑沉澱法
用與水可混溶的有機溶劑，甲醇，乙醇或丙酮，可使多數蛋白質溶解度降低並析出，此法分辨力比鹽析高，但蛋白質較易變性，應在低溫下進行。

（二）根據蛋白質分子大小的差別的分離方法

1、透析與超濾
透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質分開。
超濾法是利用高壓力或離心力，強使水和其他小的溶質分子通過半透膜，而蛋白質留在膜上，可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質。

2、凝膠過濾法
也稱分子排阻層析或分子篩層析，這是根據分子大小分離蛋白質混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠（Sephadex ged）和瓊脂糖凝膠（agarose gel）。

（三）根據蛋白質帶電性質進行分離

蛋白質在不同pH環境中帶電性質和電荷數量不同，可將其分開。

1、電泳法
各種蛋白質在同一pH條件下，因分子量和電荷數量不同而在電場中的遷移率不同而得以分開。值得重視的是等電聚焦電泳，這是利用一種兩性電解質作為載體，電泳時兩性電解質形成一個由正極到負極逐漸增加的pH梯度，當帶一定電荷的蛋白質在其中泳動時，到達各自等電點的pH位置就停止，此法可用於分析和制備各種蛋白質。

2、離子交換層析法
離子交換劑有陽離子交換劑（如：羧甲基纖維素；CM-纖維素）和陰離子交換劑（二乙氨基乙基纖維素；DEAE?FONT FACE="宋體" LANG="ZH-CN">纖維素），當被分離的蛋白質溶液流經離子交換層析柱時，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質被吸附在離子交換劑上，隨後用改變pH或離子強度辦法將吸附的蛋白質洗脫下來。（詳見層析技術章）

（四）根據配體特異性的分離方法－親和色譜法

親和層析法（aflinity chromatography）是分離蛋白質的一種極為有效的方法，它經常只需經過一步處理即可使某種待提純的蛋白質從很復雜的蛋白質混合物中分離出來，而且純度很高。這種方法是根據某些蛋白質與另一種稱為配體(Ligand）的分子能特異而非共價地結合。其基本原理：蛋白質在組織或細胞中是以復雜的混合物形式存在，每種類型的細胞都含有上千種不同的蛋白質，因此蛋白質的分離（Separation），提純（Purification）
和鑒定（Characterization）是生物化學中的重要的一部分，至今還沒的單獨或一套現成的方法能移把任何一種蛋白質從復雜的混合蛋白質中提取出來，因此往往採取幾種方法聯合使用。

細胞的破碎

1、高速組織搗碎：將材料配成稀糊狀液，放置於筒內約1/3體積，蓋緊筒蓋，將調速器先撥至最慢處，開動開關後，逐步加速至所需速度。此法適用於動物內臟組織、植物肉質種子等。

2、玻璃勻漿器勻漿：先將剪碎的組織置於管中，再套入研桿來回研磨，上下移動，即可將細胞研碎，此法細胞破碎程度比高速組織搗碎機為高，適用於量少和動物臟器組織。

3、超聲波處理法：用一定功率的超聲波處理細胞懸液，使細胞急劇震盪破裂，此法多適用於微生物材料，用大腸桿菌制備各種酶，常選用50-100毫克菌體/毫升濃度，在1KG至10KG頻率下處理10-15分鍾，此法的缺點是在處理過程會產生大量的熱，應採取相應降溫措施。對超聲波敏感和核酸應慎用。

4、反復凍融法：將細胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復幾次，由於細胞內冰粒形成和剩餘細胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細胞結構破碎。

5、化學處理法：有些動物細胞，例如腫瘤細胞可採用十二烷基磺酸鈉（SDS）、去氧膽酸鈉等細胞膜破壞，細菌細胞壁較厚，可採用溶菌酶處理效果更好。

無論用哪一種方法破碎組織細胞，都會使細胞內蛋白質或核酸水解酶釋放到溶液中，使大分子生物降解，導致天然物質量的減少，加入二異丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或減慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺醯氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酥活力，但不是全部，還可通過選擇pH、溫度或離子強度等，使這些條件都要適合於目的物質的提取。

濃縮、乾燥及保存

一、樣品的濃縮

生物大分子在制備過程中由於過柱純化而樣品變得很稀，為了保存和鑒定的目的，往往需要進行濃縮。常用的濃縮方法的：
1、減壓加溫蒸發濃縮
通過降低液面壓力使液體沸點降低，減壓的真空度愈高，液體沸點降得愈低，蒸發愈快，此法適用於一些不耐熱的生物大分子的濃縮。
2、空氣流動蒸發濃縮 空氣的流動可使液體加速蒸發,鋪成薄層的溶液，表面不斷通過空氣流；或將生物大分子溶液裝入透析袋內置於冷室，用電扇對准吹風，使透過膜外的溶劑不沁蒸發，而達到濃縮目的，此法濃縮速度慢，不適於大量溶液的濃縮。
3、冰凍法 生物大分子在低溫結成冰，鹽類及生物大分子不進入冰內而留在液相中，操作時先將待濃縮的溶液冷卻使之變成固體，然後緩慢地融解，利用溶劑與溶質融點介點的差別而達到除去大部分溶劑的目的。如蛋白質和酶的鹽溶液用此法濃縮時，不含蛋白質和酶的純冰結晶浮於液面，蛋白質和酶則集中於下層溶液中，移去上層冰塊，可得蛋白質和酶的濃縮液。
4、吸收法 通過吸收劑直接收除去溶液中溶液分子使之濃縮。所用的吸收劑必需與溶液不起化學反應，對生物大分子不吸附，易與溶液分開。常用的吸收劑有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝膠等，使用聚乙二醇吸收劑時，先將生物大分子溶液裝入半透膜的袋裡，外加聚乙二醇復蓋置於4度下，袋內溶劑滲出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水飽和後要更換新的直至達到所需要的體積。
5、超濾法 超濾法是使用一種特別的薄膜對溶液中各種溶質分子進行選擇性過濾的方法，不液體在一定壓力下（氮氣壓或真空泵壓）通過膜時，溶劑和小分子透過，大分子受阻保留，這是近年來發展起來的新方法，最適於生物大分子尤其是蛋白質和酶的濃縮或脫鹽，並具有成本低，操作方便，條件溫和，能較好地保持生物大分子的活性，回收率高等優點。應用超濾法關鍵在於膜的選擇，不同類型和規格的膜，水的流速，分子量截止值（即大體上能被膜保留分子最小分子量值）等參數均不同，必須根據工作需要來選用。另外，超濾裝置形式，溶質成份及性質、溶液濃度等都對超濾效果的一定影響。Diaflo 超濾膜的分子量截留值：

膜名稱
分子量截留值
孔的大的平均直徑

XM－300
300，000
140

XM－200
100，000
55

XM－50
50，000
30

PM－30
30，000
22

UM－20
20，000
18

PM－10
10，000
15

UM－2
1，000
12

UM05
500
10

用上面的超濾膜製成空心的纖維管，將很多根這樣的管攏成一束，管的兩端與低離子強度的緩沖液相連，使緩沖液不斷地在管中流動。然後將纖維管浸入待透析的蛋白質溶液中。當緩沖液流過纖維管時，則小分子很易透過膜而擴散，大分子則不能。這就是纖維過濾秀析法，由於透析面積增大，因而使透析時間縮短10倍。

二、乾燥

生物大分子制備得到產品，為防止變質，易於保存，常需要乾燥處理，最常用的方法是冷凍乾燥和真空乾燥。真空乾燥適用於不耐高溫，易於氧化物質的乾燥和保存，整個裝置包括乾燥器、冷凝器及真空乾燥原理外，同時增加了溫度因素。在相同壓力下，水蒸汽壓隨溫度下降而下降，故在低溫低壓下，冰很易升華為氣體。操作時一般先將待乾燥的液體冷凍到冰點以下使之變成固體，然後在低溫低壓下將溶劑變成氣體而除去。此法干後的產品具有疏鬆、溶解度好、保持天然結構等優點，適用於各類生物大分子的乾燥保存。

三、貯存

生物大分子的穩定性與保存方法的很大關系。乾燥的製品一般比較穩定，在低溫情況下其活性可在數日甚至數年無明顯變化，貯藏要求簡單，只要將乾燥的樣品置於乾燥器內（內裝有乾燥劑）密封，保持0－4度冰箱即可，液態貯藏時應注意以下幾點。
1、樣品不能太稀，必須濃縮到一定濃度才能封裝貯藏，樣品太稀易使生物大分子變性。
2、一般需加入防腐劑和穩定劑，常用的防腐劑有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。蛋白質和酶常用的穩定劑有硫酸銨糊、蔗糖、甘油等，如酶也可加入底物和輔酶以提高其穩定性。此外，鈣、鋅、硼酸等溶液對某些酶也有一定保護作用。核酸大分子一般保存在氯化鈉或檸檬酸鈉的標准緩沖液中。
3、貯藏溫度要求低，大多數在0度左右冰箱保存，有的則要求更低，應視不同物質而定

Ⅳ 有沒有能抑制微生物脂水解酶活性的方法

. 生物大分子
的制備

 2.1 概述
 在自然科學，尤其是生命科學高度發展的今天，蛋白質、酶和核酸等生物大分子的結構與功能的研究是探求生命奧秘的中心課題，而生物大分子結構與功能的研究，必須首先解決生物大分子的制備問題，有能夠達到足夠純度的生物大分子的制備工作為前題，結構與功能的研究就無從談起。然而生物大分子的分離純化與制備是一件十分細致而困難的工作。

 與化學產品的分離制備相比較，生物大分子的制備有以下主要特點：
 ⑴生物材料的組成極其復雜，常常包含有數百種乃至幾千種化合物。
 ⑵許多生物大分子在生物材料中的含量極微，分離純化的步驟繁多，流程長。
 ⑶許多生物大分子一旦離開了生物體內的環境時就極易失活，因此分離過程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制備最困難之處。
 ⑷生物大分子的制備幾乎都是在溶液中進行的，溫度、pH值、離子強度等各種參數對溶液中各種組成的綜合影響，很難准確估計和判斷。

 生物大分子的制備通常可按以下步驟進行：
 ①確定要制備的生物大分子的目的和要求，是進行科研、開發還是要發現新的物質。
 ②建立相應的可靠的分析測定方法，這是制備生物大分子的關鍵。
 ③通過文獻調研和預備性實驗，掌握生物大分子目的產物的物理化學性質。
 ④生物材料的破碎和預處理。
 ⑤分離純化方案的選擇和探索，這是最困難的過程。
 ⑥生物大分子制備物的均一性（即純度）的鑒定，要求達到一維電泳一條帶，二維電泳一個點，或HPLC和毛細管電泳都是一個峰。
 ⑦產物的濃縮，乾燥和保存。


 分析測定的方法主要有兩類：
 即生物學和物理、化學的測定方法。
 生物學的測定法主要有：酶的各種測活方法、蛋白質含量的各種測定法、免疫化學方法、放射性同位素示蹤法等；
 物理、化學方法主要有：比色法、氣相色譜和液相色譜法、光譜法（紫外／可見、紅外和熒光等分光光度法）、電泳法、以及核磁共振等。
 實際操作中盡可能多用儀器分析方法，以使分析測定更加快速、簡便。

要了解的生物大分子的物理、化學性質主要有：
 ①在水和各種有機溶劑中的溶解性。
 ②在不同溫度、pH 值和各種緩沖液中生物大分子的穩定性。
 ③固態時對溫度、含水量和凍干時的穩定性。
 ④各種物理性質：如分子的大小、穿膜的能力、帶電的情況、在電場中的行為、離心沉降的表現、在各種凝膠、樹脂等填料中的分配系數。
 ⑤其他化學性質：如對各種蛋白酶、水解酶的穩定性和對各種化學試劑的穩定性。
 ⑥對其他生物分子的特殊親和力。

 制備生物大分子的分離純化方法多種多樣，主要是利用它們之間特異性的差異，如分子的大小、形狀、酸鹼性、溶解性、溶解度、極性、電荷和與其他分子的親和性等。
 各種方法的基本原理可以歸納為兩個方面：
 ①利用混合物中幾個組分分配系數的差異，把它們分配到兩個或幾個相中，如鹽析、有機溶劑沉澱、層析和結晶等；
 ②將混合物置於某一物相（大多數是液相）中，通過物理力場的作用，使各組分分配於不同的區域，從而達到分離的目的，如電泳、離心、超濾等。
 目前純化蛋白質等生物大分子的關鍵技術是電泳、層析和高速與超速離心。

 2.2 生物大分子制備的前處理
 2.2.1 生物材料的選擇
 制備生物大分子，首先要選擇適當的生物材料。材料的來源無非是動物、植物和微生物及其代謝產物。
 選擇的材料應含量高、來源豐富、制備工藝簡單、成本低，盡可能保持新鮮，盡快加工處理。
 動物組織要先除去結締組織、脂肪等非活性部分，絞碎後在適當的溶劑中提取，如果所要求的成分在細胞內，則要先破碎細胞。
 植物要先去殼、除脂。
 微生物材料要及時將菌體與發酵液分開。
 生物材料如暫不提取，應冰凍保存。動物材料則需深度冷凍保存。

 2.2.2 細胞的破碎
 不同的生物體或同一生物體的不同部位的組織，其細胞破碎的難易不一，使用的方法也不相同，如動物臟器的細胞膜較脆弱，容易破碎，植物和微生物由於具有較堅固的纖維素、半纖維素組成的細胞壁，要採取專門的細胞破碎方法。
 (1)機械法：
 1) 研磨：將剪碎的動物組織置於研缽或勻漿器中，加入少量石英砂研磨或勻漿。
 2) 組織搗碎器：這是一種較劇烈的破碎細胞的方法，通常可先用家用食品加工機將組織打碎，然後再用10000r/min～20000r/min的內刀式組織搗碎機(即高速分散器)將組織的細胞打碎。

 (2)物理法：
 1) 反復凍融法：將待破碎的細胞冷至－15℃到－20℃，然後放於室溫(或40℃)迅速融化，如此反復凍融多次，由於細胞內形成冰粒使剩餘胞液的鹽濃度增高而引起細胞溶脹破碎。
 2) 超聲波處理法：此法是藉助超聲波的振動力破碎細胞壁和細胞器。破碎微生物細菌和酵母菌時，時間要長一些。
 3) 壓榨法：這是一種溫和的、徹底破碎細胞的方法。在1000×105Pa～2000×105Pa 的高壓下使細胞懸液通過一個小孔突然釋放至常壓，細胞將徹底破碎。
 4) 冷熱交替法：從細菌或病毒中提取蛋白質和核酸時可用此法。在90℃左右維持數分鍾，立即放入冰浴中使之冷卻，如此反復多次，絕大部分細胞可以被破碎。

 (3)化學與生物化學方法：
 1) 自溶法：將新鮮的生物材料存放於一定的pH和適當的溫度下，細胞結構在自身所具有的各種水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下發生溶解，使細胞內含物釋放出來。
 2) 溶脹法：細胞膜為天然的半透膜，在低滲溶液和低濃度的稀鹽溶液中，由於存在滲透壓差，溶劑分子大量進入細胞，將細胞膜脹破釋放出細胞內含物。
 3) 酶解法：利用各種水解酶，如溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶和酯酶等，於37℃，pH8，處理15分鍾，可以專一性地將細胞壁分解。
 4) 有機溶劑處理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶劑或SDS（十二烷基硫酸鈉）等表面活性劑處理細胞，可將細胞膜溶解，從而使細胞破裂，此法也可以與研磨法聯合使用。


 2.2.3 生物大分子的提取
 「提取」是在分離純化之前將經過預處理或破碎的細胞置於溶劑中，使被分離的生物大分子充分地釋放到溶劑中，並盡可能保持原來的天然狀態不丟失生物活性的過程。
 影響提取的因素主要有：
 目的產物在提取的溶劑中溶解度的大小；
 由固相擴散到液相的難易；
 溶劑的pH值和提取時間等。
 通常：
 極性物質易溶於極性溶劑，非極性物質易溶於非極性溶劑；
 鹼性物質易溶於酸性溶劑，酸性物質易溶於鹼性溶劑；
 溫度升高，溶解度加大；
 遠離等電點的pH值，溶解度增加。
 提取時所選擇的條件應有利於目的產物溶解度的增加和保持其生物活性。

 ⑴ 水溶液提取：
 蛋白質和酶的提取一般以水溶液為主。稀鹽溶液和緩沖液對蛋白質的穩定性好，溶解度大，是提取蛋白質和酶最常用的溶劑。用水溶液提取生物大分子應注意的幾個主要影響因素是：
 1) 鹽濃度（即離子強度）：
 離子強度對生物大分子的溶解度有極大的影響，有些物質，如DNA-蛋白復合物，在高離子強度下溶解度增加。
 絕大多數蛋白質和酶，在低離子強度的溶液中都有較大的溶解度，如在純水中加入少量中性鹽，蛋白質的溶解度比在純水時大大增加，稱為「鹽溶」現象。鹽溶現象的產生主要是少量離子的活動，減少了偶極分子之間極性基團的靜電吸引力，增加了溶質和溶劑分子間相互作用力的結果。
 為了提高提取效率，有時需要降低或提高溶劑的極性。向水溶液中加入蔗糖或甘油可使其極性降低，增加離子強度（如加入KCl、NaCl、NH4Cl或(NH4)2SO4）可以增加溶液的極性。


 2) pH值：蛋白質、酶與核酸的溶解度和穩定性與pH值有關。過酸、過鹼均應盡量避免，一般控制在pH=6～8范圍內，提取溶劑的pH應在蛋白質和酶的穩定范圍內，通常選擇偏離等電點的兩側。
 3) 溫度：為防止變性和降解，制備具有活性的蛋白質和酶，提取時一般在0℃～5℃的低溫操作。
 4) 防止蛋白酶或核酸酶的降解作用：加入抑制劑或調節提取液的pH、離子強度或極性等方法使相應的水解酶失去活性，防止它們對欲提純的蛋白質、酶及核酸的降解作用。

 5) 攪拌與氧化：攪拌能促使被提取物的溶解，一般採用溫和攪拌為宜，速度太快容易產生大量泡沫，增大了與空氣的接觸面，會引起酶等物質的變性失活。因為一般蛋白質都含有相當數量的巰基，有些巰基常常是活性部位的必需基團，若提取液中有氧化劑或與空氣中的氧氣接觸過多都會使巰基氧化為分子內或分子間的二硫鍵，導致酶活性的喪失。在提取液中加入少量巰基乙醇或半胱氨酸以防止巰基氧化。

 ⑵ 有機溶劑提取
 一些和脂類結合比較牢固或分子中非極性側鏈較多的蛋白質和酶難溶於水、稀鹽、稀酸、或稀鹼中，常用不同比例的有機溶劑提取。
 常用的有機溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇、正丁酮等，這些溶劑可以與水互溶或部分互溶，同時具有親水性和親脂性。
 有些蛋白質和酶既溶於稀酸、稀鹼，又能溶於含有一定比例的有機溶劑的水溶液中，在這種情況下，採用稀的有機溶液提取常常可以防止水解酶的破壞，並兼有除去雜質提高純化效果的作用。
例如，胰島素（見講義p36）。

 2.3 生物大分子的分離純化
 由於生物體的組成成分是如此復雜，數千種乃至上萬種生物分子又處於同一體系中，因此不可能有一個適合於各類分子的固定的分離程序，但多數分離工作關鍵部分的基本手段是相同的。
 為了避免盲目性，節省實驗探索時間，要認真參考和借鑒前人的經驗，少走彎路。常用的分離純化方法和技術有：
 沉澱法（包括：鹽析、有機溶劑沉澱、選擇性沉澱等）、離心、吸附層析、凝膠過濾層析、離子交換層析、親和層析、快速制備型液相色譜以及等電聚焦制備電泳等。本章以介紹沉澱法為主。

 2.3.1 沉澱法
 沉澱是溶液中的溶質由液相變成固相析出的過程。沉澱法（即溶解度法）操作簡便，成本低廉，不僅用於實驗室中，也用於某些生產目的的制備過程，是分離純化生物大分子，特別是制備蛋白質和酶時最常用的方法。通過沉澱，將目的生物大分子轉入固相沉澱或留在液相，而與雜質得到初步的分離。
 其基本原理是根據不同物質在溶劑中的溶解度不同而達到分離的目的，不同溶解度的產生是由於溶質分子之間及溶質與溶劑分子之間親和力的差異而引起的，溶解度的大小與溶質和溶劑的化學性質及結構有關，溶劑組分的改變或加入某些沉澱劑以及改變溶液的pH值、離子強度和極性都會使溶質的溶解度產生明顯的改變。

 在生物大分子制備中最常用的幾種沉澱方法是：
 ⑴中性鹽沉澱（鹽析法）：多用於各種蛋白質和酶的分離純化。
 ⑵有機溶劑沉澱：多用於蛋白質和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分離純化。
 ⑶選擇性沉澱（熱變性沉澱和酸鹼變性沉澱）：多用於除去某些不耐熱的和在一定pH值下易變性的雜蛋白。
 ⑷等電點沉澱：用於氨基酸、蛋白質及其他兩性物質的沉澱，但此法單獨應用較少，多與其他方法結合使用。
 ⑸有機聚合物沉澱： 是發展較快的一種新方法， 主要使用PEG聚乙二醇（Polyethyene glycol）作為沉澱劑。

 2.3.1.1 中性鹽沉澱（鹽析法）
 在溶液中加入中性鹽使生物大分子沉澱析出的過程稱為「鹽析」。除了蛋白質和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用鹽析法進行沉澱分離。
 鹽析法應用最廣的還是在蛋白質領域，已有八十多年的歷史，其突出的優點是：
 ①成本低，不需要特別昂貴的設備。
 ②操作簡單、安全。
 ③對許多生物活性物質具有穩定作用。

 ⑴ 中性鹽沉澱蛋白質的基本原理
 蛋白質和酶均易溶於水，因為該分子的－COOH、－NH2和－OH都是親水基團，這些基團與極性水分子相互作用形成水化層，包圍於蛋白質分子周圍形成1nm～100nm顆粒的親水膠體，削弱了蛋白質分子之間的作用力，蛋白質分子表面極性基團越多，水化層越厚，蛋白質分子與溶劑分子之間的親和力越大，因而溶解度也越大。親水膠體在水中的穩定因素有兩個：即電荷和水膜。因為中性鹽的親水性大於蛋白質和酶分子的親水性，所以加入大量中性鹽後，奪走了水分子，破壞了水膜，暴露出疏水區域，同時又中和了電荷，破壞了親水膠體，蛋白質分子即形成沉澱。鹽析示意圖如下頁「圖 4」所示。

 ⑵ 中性鹽的選擇
 常用的中性鹽中最重要的是（NH4）2SO4，因為它與其他常用鹽類相比有十分突出的優點：
 1) 溶解度大：尤其是在低溫時仍有相當高的溶解度，這是其他鹽類所不具備的。由於酶和各種蛋白質通常是在低溫下穩定，因而鹽析操作也要求在低溫下（0～4℃）進行。由下表可以看到， 硫銨在0℃時的溶解度，遠遠高於其它鹽類：
 表2-1 幾種鹽在不同溫度下的溶解度（克/100毫升水）
 0℃ 20℃ 80℃ 100 ℃
（NH4)2SO4 70.6 75.4 95.3 103
 Na2SO4 4.9 18.9 43.3 42.2
 NaH2PO4 1.6 7.8 93.8 101






 2) 分離效果好：有的提取液加入適量硫酸銨
鹽析，一步就可以除去75％的雜蛋白，純
度提高了四倍。
 3) 不易引起變性，有穩定酶與蛋白質結構的
作用。有的酶或蛋白質用2～3mol/L濃度的
（NH4）2SO4保存可達數年之久。
 4) 價格便宜，廢液不污染環境。

 ⑶ 鹽析的操作方法
 最常用的是固體硫酸銨加入法。將其研成細粉，在攪拌下緩慢均勻少量多次地加入，接近計劃飽和度時，加鹽的速度更要慢一些，盡量避免局部硫酸銨濃度過大而造成不應有的蛋白質沉澱。鹽析後要在冰浴中放置一段時間，待沉澱完全後再離心與過濾。
 在低濃度硫酸銨中鹽析可採用離心分離，高濃度硫酸銨常用過濾方法。
 各種飽和度下需加固體硫酸銨的量可由附錄中查出。

 ⑷ 鹽析曲線的製作
 如果要分離一種新的蛋白質和酶，沒有文獻數據可以借鑒，則應先確定沉澱該物質的硫酸銨飽和度。具體操作方法如下(講義p39)：

蛋白質量(mg)或酶活力

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 硫銨飽
和度％

 ⑸鹽析的影響因素
 1) 蛋白質的濃度：高濃度的蛋白質用稍低的硫酸銨飽和度沉澱，若蛋白質濃度過高，易產生各種蛋白質的共沉澱作用。低濃度的蛋白質，共沉澱作用小，但回收率降低。較適中的蛋白質濃度是2.5％～3.0％，相當於25 mg/mL～30mg/mL。
 2) pH值對鹽析的影響：在等電點處溶解度小，pH值常選在該蛋白質的等電點附近。
 3) 溫度的影響：對於蛋白質、酶和多肽等生物大分子，在高離子強度溶液中，溫度升高，它們的溶解度反而減小。在低離子強度溶液或純水中蛋白質的溶解度大多數還是隨濃度升高而增加的。一般情況下，可在室溫下進行。但對於某些對溫度敏感的酶，要求在0℃～4℃下操作，以避免活力喪失。


 2.3.1.2 有機溶劑沉澱法
 ⑴基本原理
 有機溶劑對於許多蛋白質（酶）、核酸、多糖和小分子生化物質都能發生沉澱作用，是較早使用的沉澱方法之一。其原理主要是：
 ①降低水溶液的介電常數，向溶液中加入有機溶劑能降低溶液的介電常數，減小溶劑的極性，從而削弱了溶劑分子與蛋白質分子間的相互作用力，導致蛋白質溶解度降低而沉澱。
 ②由於使用的有機溶劑與水互溶，它們在溶解於水的同時從蛋白質分子周圍的水化層中奪走了水分子，破壞了蛋白質分子的水膜，因而發生沉澱作用。


 有機溶劑沉澱法的優點是：
 ①分辨能力比鹽析法高，即一種蛋白質或其他溶質只在一個比較窄的有機溶劑濃度范圍內沉澱。
 ②沉澱不用脫鹽，過濾比較容易（如有必要，可用透析袋脫有機溶劑）。因而在生化制備中有廣泛的應用。
 其缺點是對某些具有生物活性的大分子容易引起變性失活，操作需在低溫下進行。
 ⑵有機溶劑的選擇和濃度的計算
 用於生化制備的有機溶劑的選擇首先是要能與水互溶。沉澱蛋白質和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。
 為了獲得沉澱而不著重於進行分離，可用溶液體積的倍數：如加入一倍、二倍、三倍原溶液體積的有機溶劑，來進行有機溶劑沉澱。

 ⑶有機溶劑沉澱的影響因素
 1) 溫度：多數生物大分子如蛋白質、酶和核酸在有機溶劑中對溫度特別敏感，溫度稍高就會引起變性，且有機溶劑與水混合時產生放熱反應，因此必須預冷，操作要在冰鹽浴中進行，加入有機溶劑時必須緩慢且不斷攪拌以免局部過濃。
 一般規律是溫度越低，得到的蛋白質活性越高。
 2) 樣品濃度：低濃度樣品回收率低，要使用比例更大的有機溶劑進行沉澱。高濃度樣品，可以節省有機溶劑，減少變性的危險，但雜蛋白的共沉澱作用大。
 通常使用5mg/mL～20mg/mL的蛋白質初濃度為宜。


 3) pH值：選擇在樣品穩定的pH值范圍內，通常是選在等電點附近，從而提高此沉澱法的分辨能力。
 4) 離子強度：鹽濃度太大或太小都有不利影響，通常鹽濃度以不超過5％為宜，使用乙醇的量也以不超過原蛋白質水溶液的2倍體積為宜，少量的中性鹽對蛋白質變性有良好的保護作用，但鹽濃度過高會增加蛋白質在水中的溶解度，降低了沉澱效果，通常是在低濃度緩沖液中沉澱蛋白質。
 沉澱所得的固體樣品，如果不是立即溶解進行下一步的分離，則應盡可能抽干沉澱，減少其中有機溶劑的含量，如若必要可以裝透析袋透析脫有機溶劑，以免影響樣品的生物活性。

 2.3.1.3 選擇性變性沉澱法
 這一方法是利用生物大分子與非目的生物大分子在物理化學性質等方面的差異，選擇一定的條件使雜蛋白等非目的物變性沉澱而得到分離提純。
 ⑴ 熱變性
 利用生物大分子對熱的穩定性不同，加熱升高溫度使非目的生物大分子變性沉澱而保留目的物在溶液中。
 ⑵ 表面活性劑和有機溶劑變性
 使那些對表面活性劑和有機溶劑敏感性強的雜蛋白變性沉澱。通常在冰浴或冷室中進行。
 ⑶ 選擇性酸鹼變性
 利用對pH值的穩定性不同而使雜蛋白變性沉澱。通常是在分離純化流程中附帶進行的分離純化步驟。

 2.3.1.4 等電點沉澱法
 利用具有不同等電點的兩性電解質，在達到電中性時溶解度最低，易發生沉澱，從而實現分離的方法。氨基酸、蛋白質、酶和核酸都是兩性電解質，可以利用此法進行初步的沉澱分離。
 由於許多蛋白質的等電點十分接近，而且帶有水膜的蛋白質等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉澱析出，因此，單獨使用此法解析度較低，因而此法常與鹽析法、有機溶劑沉澱法或其他沉澱劑一起配合使用，以提高沉澱能力和分離效果。
 此法主要用於在分離純化流程中去除雜蛋白，而不用於沉澱目的物。

 2.3.1.5 有機聚合物沉澱法
 有機聚合物是六十年代發展起來的一類重要的沉澱劑，最早應用於提純免疫球蛋白和沉澱一些細菌和病毒。近年來廣泛用於核酸和酶的純化。其中應用最多的是
「聚乙二醇」【HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH (n ＞4)】( Polyethylene Glycol 簡寫為 PEG )，它的親水性強，溶干水和許多有機溶劑，對熱穩定，有廣泛圍的分子量，在生物大分子制備中，用的較多的是分子量為6000～20000的 PEG。
 本方法的優點是：
 ①操作條件溫和，不易引起生物大分子變性。
 ②沉澱效能高，使用很少量的P「EG即可以沉澱相當多
的生物大分子。
 ③沉澱後有機聚合物容易去除。

 2.3.2 透析
 自Thomas Graham 1861年發明透析方法至今已有一百多年。透析已成為生物化學實驗室最簡便最常用的分離純化技術之一。在生物大分子的制備過程中，除鹽、除少量有機溶劑、除去生物小分子雜質和濃縮樣品等都要用到透析的技術。
 透析只需要使用專用的半透膜即可完成。保留在透析袋內未透析出的樣品溶液稱為「保留液」，袋（膜）外的溶液稱為「滲出液」或「透析液」。截留分子量MwCO通常為1萬左右。
 用1％ BaCl2檢查(NH4)2SO4，用1％ AgNO3 檢查NaCl、KCl等。

 2.3.3 超濾
 超過濾即超濾，自20年代問世後，直至60年代以來發展迅速，很快由實驗室規模的分離手段發展成重要的工業單元操作技術。超濾現已成為一種重要的生化實驗技術，廣泛用於含有各種小分子溶質的各種生物大分子（如蛋白質、酶、核酸等）的濃縮、分離和純化。
 超濾是一種加壓膜分離技術，即在一定的壓力下，使小分子溶質和溶劑穿過一定孔徑的特製的薄膜，而使大分子溶質不能透過，留在膜的一邊，從而使大分子物質得到了部分的純化。

 超濾根據所加的操作壓力和所用膜的平均孔徑的不同，可分為微孔過濾、超濾和反滲透三種。
 微孔過濾所用的操作壓通常小於4×104Pa，膜的平均孔徑為500埃～14微米（1微米＝104埃），用於分離較大的微粒、細菌和污染物等。
 超濾所用操作壓為4×104Pa～7×105Pa，膜的平均孔徑為10—100埃，用於分離大分子溶質。
 反滲透所用的操作壓比超濾更大，常達到35×105Pa～140×105Pa，膜的平均孔徑最小，一般為10埃以下，用於分離小分子溶質，如海水脫鹽，制高純水等。

 超濾技術的優點是操作簡便，成本低廉，不需增加任何化學試劑，尤其是超濾技術的實驗條件溫和，與蒸發、冰凍乾燥相比沒有相的變化，而且不引起溫度、pH的變化，因而可以防止生物大分子的變性、失活和自溶。
 在生物大分子的制備技術中，超濾主要用於生物大分子的脫鹽、脫水和濃縮等。
 超濾法也有一定的局限性，它不能直接得到乾粉制劑。對於蛋白質溶液，一般只能得到10～50％的濃度。

 超濾技術的關鍵是膜。
 常用的膜是由乙酸纖維或硝酸纖維或此二者的混合物製成。近年來發展了非纖維型的各向異性膜，例如聚碸膜、聚碸醯胺膜和聚丙烯腈膜等。這種膜在pH 1～14都是穩定的，且能在90℃下正常工作。超濾膜通常是比較穩定的，能連續用1～2年。
 超濾膜的基本性能指標：水通量（cm3/(cm2•h)）；截留率（以百分率％表示）；化學物理穩定性（包括機械強度）等。
 超濾裝置由若干超濾組件構成。分為板框式、管式、螺旋卷式和中空纖維式四種主要類型。
 由於超濾法處理的液體多數是含有水溶性生物大分子、有機膠體、多糖及微生物等。這些物質極易粘附和沉積於膜表面上，造成嚴重的濃差極化和堵塞，這是超濾法最關鍵的問題，要克服濃差極化，通常可加大液體流量，加強湍流和加強攪拌。

 2.3.4 冰凍乾燥
 冰凍乾燥機是生化與分子生物學實驗室必備的儀器之一，因為大多數生物大分子分離純化後的最終產品多數是水溶液，要從水溶液中得到固體產品，最好的辦法就是冰凍乾燥，

Ⅵ PVC合金超濾膜、UPAN超濾膜、中空纖維超濾膜，有什麼區別、哪種好

早上好，具體看要過濾的液體介質成分是什麼，PVDF中空纖維濾膜耐溶劑性能最好，內PVC濾膜只要不是甲苯、二氯甲烷容、四氫呋喃和環己酮等有機溶劑各項性能居中，UPAN濾膜的聚丙烯腈最差不耐大流速和高壓環境通常用在廉價凈水器。濾膜性能和它們材質成本價格成正比。

Ⅶ 請推薦一種材料，耐110度高溫，耐甲苯，謝謝！

合成橡膠可以不？
比如：氟橡膠，氯磺、化聚乙烯，丙烯酸膠，氯丁橡膠等等！

Ⅷ pp,PET,PBT,PE能不能耐甲苯

你的這些材料交聯與否？只要交聯都耐。甲苯類似於苯，但極性比苯強，對極性的材料更具有融解性。
PP、PE交聯可能性很小，應該都溶於甲苯
PET,PBT官能團大，有極性，有不飽和鍵，可能交聯，溶解性能看實際情況而定

Ⅸ 進料中有微量甲苯，能使用聚丙烯嗎

不行的，而且是堅決不行！甲苯輸強溶劑性有機溶劑，會與聚丙烯反應，用聚丙烯隔膜泵輸送甲苯，用不了多久就會被腐蝕掉。推薦你用聚丙烯的輸送甲苯的要拉去殺頭，哈哈。具體原因：1，聚丙烯不耐甲苯，外殼根本受不了。2，聚丙烯泵的價格無疑會高於鋁合金的，全無必要。而鋁合金輸送甲苯完全沒問題。3，輸送易燃易爆流體，國際要求是使用金屬材質泵——為防靜電。