細胞塗片長久保存中性樹脂

1. 血細胞塗片可以選用的固定液可以有哪些

固定劑
用於免疫組織化學的固定劑種類較多，性能各異，在固定半穩定性抗原時，尤其重視固定劑的選擇，介紹如下。
1．醛類固定劑雙功能交聯劑，其作用是使組織之間相互交聯，保存抗原於原位，其特點是對組織穿透性強，收縮性小。有人認為它對IgM、IgA、J鏈、K鏈和λ鏈的標記效果良好，背景清晰，是常用的固定劑。
（1）10%鈣-福爾馬林液（濃甲醛10ml，飽和碳酸鈣90ml）。
（2）10%中性緩沖福爾馬林液（濃甲醋10ml，0.01mol/L pH7.4 PBS 90ml）。
（3）4%多聚甲醛磷酸緩沖液pH7.4（多聚甲醛40g, 0.1mol/L PBS液pH7.4 500ml，兩者混
合加熱至60℃，攪拌並滴加1N NaOH至清晰為止，冷卻後加PBS液至總量1000ml）。
（4）戊二醛-甲醛液（戊二醛1ml，濃甲醛10ml，蒸餾水加至100ml）。
戊二醛是二醛基化合物，交聯結合力比甲醛大，Bullock認為交聯過強，可出現組織改變和空間遮蔽現象，影響組織的抗原性。但McDonald等認為，該試劑用於PAP法免疫酶標記效果仍滿意。
（5）甲醛升汞固定液（即B5固定液。濃甲醛10ml，氯化汞6g,醋酸鈉1.25g ,蒸餾水90ml）。
有人認為此固定液懸液是較理想的固定液，標記IgA、IgM、IgG等抗原效果良好。也有人認為它減弱細胞的抗原性，上皮細胞可產生非特異性熒光，故不宜用於免疫熒游標記。氯化汞是一種強蛋白凝固劑，但對組織穿透性弱，且使組織收縮，故與甲醛混合使用。
（6）醋酸-甲醛液（濃甲醛10ml，冰醋酸3ml，生理鹽水加至100ml）。
Bullock等認為此液固定效果良好，組織可不經消化，胞漿IgA、IgG、IgM、IgD和K、λ、J鏈標記均呈陽性，且背景染色極淡。如標記IgG用PAP法第一抗體僅為甲醛升汞液的1/10。此液內醋酸既可防止組織收縮，又可暴露胞漿免疫球蛋白抗原決定簇。
（7）Bouin』s液。
該固定液為組織學、病理學常用固定劑之一，對組織穿透力較強而收縮性較小，比單獨醛類固定更適合免疫組化染色。Kayhko認為用於標記B細胞的J鏈較好，但Bullock則認為它可導致IgG γ重鏈變性，故必需加大第一抗體的濃度。
（8）Zamboni』s液。
該固定液可用於電鏡免疫細胞化學，對超微結構的保存優於純甲醛，也適用於光鏡免疫細胞化學研究。採用2.5%多聚甲醛和30%飽和苦味酸，更可增加對組織穿透力和固定效果，以保存更多的組織抗原。固定時間6-18h。
（9）PLP液（過碘酸鹽-賴氨酸-多聚甲醛固定液）。
該固定劑適用於富含糖類的組織，對超微結構及許多抗原的抗原性保存較好。其機制是過碘酸氧化組織中的糖類形成醛基，通過賴氨酸的雙價氧基與醛基結合，從而與糖形成交聯。組織抗原大多數是由蛋白質和糖兩部分構成，抗原決定簇位於蛋白部分，故該固定液有選擇性地使糖類固定，既穩定缺的，又不影響其在組織中的位置（固定劑7-9配製法見附錄1）。

2. 血細胞塗片可以選用的固定液可以有哪些

1、95%酒精：
是最常用的細胞學固定液，能沉澱白蛋白、球蛋白和核蛋白，但核蛋沉澱後，能溶於水，因此，經95%酒精固定的塗片，染色前沒有必要經過水洗。此固定液適用於蘇木素-伊紅染色和巴氏染色。固定時間根據標本的不同，時間也不盡相同，一般標本固定時間為15-30分鍾，痰標本需要更長一些時間。經過95%酒精固定的標本，細胞核保存較好，結構清晰，顏色鮮艷。如果在95%酒精液內加入聚乙二醇更佳，可以保護細胞免受空氣乾燥後的人工假象。
2、乙醚酒精液（1：1）：
其效果與95%酒精相似，但由於乙醚有很強的吸水性和特有的刺激性氣味，容易揮發，長期低濃度吸入，有頭痛、頭暈、疲倦、嗜睡、蛋白尿、紅細胞增多等不良反應。長期皮膚接觸，可發生皮膚乾燥、皸裂。所以現在已經逐漸被95%酒精所代替。
3、甲醇：
固定時間快，細胞收縮小，細胞核保存較好，結構清晰，染色鮮艷。常作為穿刺細胞塗片的固定液。對抗原保存較好，可作為細胞塗片免疫組化的固定液。缺點是具有揮發性和毒性，大量接觸與吸入對中樞神經有一定的傷害。甲醇的毒性與其代謝產物甲醛和甲酸的蓄積有關。以前認為毒性作用主要為甲醛所致, 甲醛能抑制視網膜的氧化磷酸化過程,使膜內不能合成ATP,細胞發生變性,最後引起視神經萎縮。近年研究表明,甲醛很快代謝成甲酸,急性中毒引起的代謝性酸中毒和眼部損害，主要與甲酸含量相關。
4、冰醋酸：5%水溶液可作固定用。不能沉澱白蛋白，但能沉澱核蛋白。滲透性強，固定快，能使紅細胞膨脹而破碎，常與其它液體配合使用。
4、無水酒精：
對糖原保存較好，容易使細胞收縮，其性能與95%酒精相似，很少單獨使用，一般只用於糖原的固定。
5、丙酮：
為易揮發的無色液體，有刺激性氣體。可使蛋白質沉澱，滲透性強，細胞收縮嚴重，對核的固定差。很少用於常規細胞學的固定。廣泛用於酶組織化學中的各種酶的固定，也有人用於抗原的保存，作為細胞塗片免疫組化的固定液。丙酮具有揮發性和毒性，大量接觸與吸入對肝、腎及中樞神經有一定的傷害。
6、Carnoy 固定液
配方：無水乙醇60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml。
Carnoy液能固定胞漿和胞核，尤其適宜於染色體等。常用於糖原及尼氏體的固定，由於冰醋酸能溶解紅細胞並可防止細胞由酒精引起的過渡收縮，對固定有血的標本和顯示DNA、RNA效果很好。缺點是每次固定後固定液內有大量的紅細胞碎片和細胞脫落，必須及時過濾，否則容易造成污染。其次，氯仿具有揮發性和毒性，大量接觸與吸入對肝、腎及中樞神經有一定的傷害。
7、10%中性緩沖甲醛液：
固定液配方1：40%甲醛10ml，0.01mol/L pH7.4的PBS90ml。
固定液配方2：40%甲醛120ml，蒸餾水880ml，磷酸二氫鈉（NaH2PO4•H2O）4g，磷酸氫二鈉（Na2HPO4）13g。
10%中性緩沖甲醛液對大多數抗原保存較好，是免疫組織化學最常用的固定液，組織穿透性好，組織收縮較小。但此液體不適合固定濕固定的塗片，可作為干固定塗片和細胞蠟塊的固定液。甲醛也具有揮發性和毒性。大量吸入會出現呼吸道的嚴重刺激和水腫、眼刺痛、頭痛，也可發生支氣管哮喘。經常吸入少量甲醛，能引起慢性中毒，出現粘膜充血、皮膚刺激症、過敏性皮炎、指甲角化和脆弱、甲床指端疼痛等。全身症狀有頭痛、乏力、胃納差、心悸、失眠、體重減輕以及植物神經紊亂等。

3. 免疫熒光甩片能將細胞固定在載玻片上么

免疫熒光基本實驗步驟

基本實驗步驟：
（1） 細胞准備。對單層生長細胞，在傳代培養時，將細胞接種到預先放置有處理過的蓋玻片的培養皿中，待細胞接近長成單層後取出蓋玻片，PBS洗兩次；對懸浮生長細胞，取對數生長細胞，用PBS離心洗滌（1000rpm，5min）2次，用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞塗片。
（2） 固定。根據需要選擇適當的固定劑固定細胞。固定完畢後的細胞可置於含疊氮納的PBS中4℃保存3個月。PBS洗滌3×5 min。
（3） 通透。使用交聯劑（如多聚甲醛）固定後的細胞，一般需要在加入抗體孵育前，對細胞進行通透處理，以保證抗體能夠到達抗原部位。選擇通透劑應充分考慮抗原蛋白的性質。通透的時間一般在5-15min。通透後用PBS洗滌3×5 min。
（4） 封閉。使用封閉液對細胞進行封閉，時間一般為30min。
（5） 一抗結合。室溫孵育1h或者4℃過夜。PBST漂洗3次，每次沖洗5min。
（6） 二抗結合。間接免疫熒光需要使用二抗。室溫避光孵育1h。PBST漂洗3次，每次沖洗5min後，再用蒸餾水漂洗一次。
（7） 封片及檢測。滴加封片劑一滴，封片，熒光顯微鏡檢查。

（一）細胞准備
用於免疫熒光實驗的細胞可以是直接生長在蓋玻片上的貼壁細胞，也可以是經過離心後塗片的懸浮細胞或者是將取自體內的組織細胞懸液離心後塗片。貼壁良好的細胞一般在培養時直接放入coverslips讓細胞生長在其上即可，盡量避免使用貼壁性能不好的細胞進行免疫熒光實驗，以免後續的漂洗操作引起細胞脫落。少數實驗需要使用這類細胞或者懸浮細胞進行免疫熒光觀察，建議使用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞塗片。

（二）固定和通透
除研究細胞表面抗原或不穩定抗原可不固定外，一般均應固定。固定的目的有三：
①防止細胞從玻片上脫落；
②除去防礙抗原-抗體結合的類脂；
③使標本易於保存。

標本的固定原則是：
①不能損傷細胞內的抗原；
②不能凝集蛋白質；
③應保持細胞和亞細胞結構；
④固定後應保持通透性，以保證抗體自由進入所有細胞與亞細胞組分與抗原結合。
常用的固定劑有多種，應根據所研究抗原的性質和所使用的抗體特性選擇適當的固定劑。通常固定方法可以分為兩類：有機溶劑和交聯劑。有機溶劑如甲醇和丙酮等可去除類脂並使細胞脫水，同時將細胞結構蛋白沉澱。交聯劑如多聚甲醛通常通過自由氨基酸基團形成分子間橋連，從而產生一種抗原相互連接的網路結構。交聯劑比有機溶劑更易於保持細胞的結構，但因為交聯阻礙抗體結合，可能會降低一些細胞組分的抗原性，因此需要增加一個通透步驟以使抗體能夠進入標本。兩種固定方法都可能使蛋白抗原變性，因此使用變性蛋白作為抗原生產的抗體在免疫熒光中可能更為有效。
最常用的固定劑有多聚甲醛和甲醇，少數情況也使用乙醇，丙酮及戊二醛等進行固定。通常，細胞結構抗原、病毒及一些酶類抗原使用丙酮、乙醇及高濃度的甲醛固定可獲得較好的結果，而細胞膜相關組分抗原一般以多聚甲醛固定。細胞器和細胞顆粒內的抗原一般也用多聚甲醛固定，並需要進行通透以使抗體能達到抗原表位。
通透步驟只在檢測細胞內抗原表位的時候才需要，因為抗體需要進入細胞內部去檢測蛋白。但是，如果待檢測的是跨膜蛋白，且其抗原表位處於胞質內區域，則同樣需要對細胞進行通透。相反，如果所檢測的抗原表位位於膜蛋白的胞外段，則不需要進行通透。丙酮本身具有通透作用，因此用丙酮作為固定劑時是不需要通透的。甲醇同樣具有通透作用，但有些場合並不適合用甲醇，因為一些表位對甲醇非常敏感。常用的通透劑是去垢劑，如Triton ，NP-40，以及Tween 20, Saponin, Digitonin 和 Leucoperm等。Triton和NP-40屬於烈性去垢劑，可部分溶解細胞核膜，因此非常適合核抗原檢測。但應該注意的是，如果在高濃度下使用或者作用時間過長，它們將破壞蛋白，從而影響實驗結果。Triton X-100是最常用的通透劑，但是它將破壞細胞膜，因此不適用於細胞膜相關抗原。後面一組去垢劑要溫和得多，它們可以在細胞質膜上形成足夠大的孔隙以允許抗體通過，但是不會溶解細胞質膜。適於胞質抗原或者質膜上靠近胞質一面的抗原，也適於可溶性的核抗原。
一般的操作程序是先固定後通透，但針對有些水不溶性的目的抗原的檢測宜先通透再固定，這樣做的原因主要是可以通過通透去除許多水溶性的蛋白，從而大大減少了免疫熒光的背景和非特異性信號。固定後以冷PBS液漂洗，最後以蒸餾水沖洗，防止自發性熒光。

（三）封閉
封閉的目的是為了減少抗體的非特異性結合，最常用的封閉劑為1% BSA, PBS pH 7.5，其他可選擇的封閉劑還有 1% gelatin, 1%bovine 或與二抗種屬相同的血清（3-10%）等。

（四）抗體孵育
直接免疫熒光法中的一抗和間接免疫熒光法中的二抗都是熒光抗體，因此在這些抗體孵育的時候必須注意避光。此外，為保證結合質量和防止乾燥，抗體孵育應盡量在濕盒中進行。

（五）封片及熒光觀察
標記好熒光的細胞片原則上可以直接進行觀察，特別是有時候封片不當反而使得前功盡棄。但在絕大多數情況下，為了保存結果，以便進一步觀察、照像、統計分析等，需作封片處理。常規的方法是採用甘油或中性樹脂封片，為了增強封片的效果，往往需要在封片時添加特殊的抗熒光淬滅劑。

（六）標本保存
由於熒光色素和蛋白質分子的穩定性都是相對的，因此隨著保存時間的延長，在各種條件影響下，標記蛋白可能變性解離，失去其應有的亮度和特異性。因此給標本的保存帶來一定的困難，所以在標本進行熒光染色之後應立即觀察。由於性能良好的抗熒光淬滅劑的出現，熒游標記的標本可以在低溫（4℃或-20℃）下保存相當長的時間。在某些情形下，考慮到實驗的成本及實驗條件，也可以採取權宜的辦法，比如固定標本片後低溫保存，在需要時再進行熒游標記，即隨用隨染。

4. 實驗課上切片、塗片、滴片各有什麼特點

切片：從生物體上切取的薄片製成。如，葉片橫切。

塗片：液體的生物材料塗抹製成。如，血細胞塗片。

裝片：從生物體上撕下或者挑取少量的材料製成。如，洋蔥表皮臨時裝片。

切片應稱做組織切片，或病理切片。將手術取下來的病理組織或可疑的組織經過固定，封臘，經過切片機切成組織薄片，然後固定在玻片面性上，進行染色，這就是切片。最後將切片放在顯微鏡下檢查，根據其病理細胞的特徵，進行病理學的組織定性。

(4)細胞塗片長久保存中性樹脂擴展閱讀：

切片：供光學顯微鏡或電子顯微鏡觀察的動植物組織薄片。因要求不同，可用刀片進行徒手切片，也可將組織塊包埋於石蠟或火棉膠中或以低溫冰凍，用切片機切片。切成5～10微米薄片，供光學顯微鏡觀察。用環氧樹脂或甲基丙烯酸包埋組織塊切制的超薄切片，其厚度在20～50納米，專供在電子顯微鏡下觀察。一般教學用的如根尖、莖的切片通稱石蠟切片。