側鏈BOC脫除與樹脂切除

① 生物化學王鏡岩第三版第四章第三題標准答案

1.如果一個相對分子質量為12000的蛋白質，含10種氨基酸，並假設每種氨基酸在該蛋白質分子中的數目相等，問這種蛋白質有多少種可能的排列順序？[10100]
解：1012000/120=10100

2、有一個A肽，經酸解分析得知為Lys、His、Asp、Glu2、Ala以及Val、Tyr和兩個NH3分子組成。當A肽與FDNB試劑反應後得DNP-Asp；當用羧肽酶處理後得游離纈氨酸。如果我們在實驗中將A肽用胰蛋白酶降解時，得到兩種肽，其中一種（Lys、Asp、Glu、Ala、Tyr）在pH6.4時，凈電荷為零，另一種（His、Glu以及Val）可給除DNP-His，在pH6.4時，帶正電荷。此外，A肽用糜蛋白酶降解時，也得到兩種肽，其中一種（Asp、Ala、Tyr）在pH6.4時全中性，另一種（Lys、His、Glu2以及Val）在pH6.4時帶正電荷。問A肽的氨基酸序列如何？[Asn-Ala-Tyr-Glu-Lys-His-Gln-Val]
解：1、N-末端分析：FDNB法得：Asp-；
2、C-末端分析：羧肽酶法得：-Val；
3、胰蛋白酶只斷裂賴氨酸或精氨酸殘基的羧基形成的肽鍵，得到的是以Arg和Lys為C-末端殘基的肽斷。酸水解使Asn→Asp+ NH4+，由已知條件（Lys、Asp、Glu、Ala、Tyr）可得：Asn-(
)-( )-( )-Lys-(
)-( )-Val；
4、FDNB法分析N-末端得DNP-His，酸水解使Gln→Glu+NH4+由已知條件（His、Glu、Val）可得：Asn-( )-( )-( )-Lys-His-Gln-Val；
5、糜蛋白酶斷裂Phe、Trp和Tyr等疏水氨基酸殘基的羧基端肽鍵。由題，得到的一條肽（Asp、Ala、Tyr）結合（3）、（4）可得該肽的氨基酸序列為：Asn-Ala-Tyr-Glu-Lys-His-Gln-Val

3、某多肽的氨基酸序列如下：Glu-Val-Lys-Asn-Cys-Phe-Arg-Trp-Asp-Leu-Gly-Ser-Leu-Glu-Ala-Thr-Cys-Arg-His-Met-Asp-Gln-Cys-Tyr-Pro-Gly-Glu_Glu-Lys。（1）如用胰蛋白酶處理，此多肽將產生幾個肽？並解釋原因（假設沒有二硫鍵存在）；（2）在pH7.5時，此多肽的凈電荷是多少單位？說明理由（假設pKa值：α-COOH4.0；α- NH3+6.0；Glu和Asp側鏈基4.0；Lys和Arg側鏈基11.0；His側鏈基7.5；Cys側鏈基9.0；Tyr側鏈基11.0）；（3）如何判斷此多肽是否含有二硫鍵？假如有二硫鍵存在，請設計實驗確定5，17和23位上的Cys哪兩個參與形成？[（1）4個肽；（2）-2.5單位；（3）如果多肽中無二硫鍵存在，經胰蛋白酶水解後應得4個肽段；如果存在一個二硫鍵應得3個肽段並且個肽段所帶電荷不同，因此可用離子交換層析、電泳等方法將肽段分開，鑒定出含二硫鍵的肽段，測定其氨基酸順序，便可確定二硫鍵的位置]

4、今有一個七肽，經分析它的氨基酸組成是：Lys、Pro、Arg、Phe、Ala、Tyr和Ser。此肽未經糜蛋白酶處理時，與FDNB反應不產生α-DNP-氨基酸。經糜蛋白酶作用後，此肽斷裂城兩個肽段，其氨基酸組成分別為Ala、Tyr、Ser和Pro、Phe、Lys、Arg。這兩個肽段分別與FDNB反應，可分別產生DNP-Ser和DNP-Lys。此肽與胰蛋白酶反應能生成兩個肽段，它們的氨基酸組成分別是Arg、Pro和Phe、Tyr、Lys、Ser、Ala。試問此七肽的一級結構怎樣？[它是一個環肽，序列為：-Phe-Ser-Ala-Tyr-Lys-Pro-Arg-]
解：（1）此肽未經糜蛋白酶處理時，與FDNB反應不產生α-DNP-氨基酸，說明此肽不含游離末端NH2，即此肽為一環肽；
（2）糜蛋白酶斷裂Phe、Trp和Tyr等疏水氨基酸殘基的羧基端肽鍵，由已知兩肽段氨基酸組成（Ala、Tyr、Ser和Pro、Phe、Lys、Arg）可得：-(
)-( )-Tyr-和-( )-( )-(
)-Phe-；
（3）由（2）得的兩肽段分別與FDNB反應，分別產生DNP-Ser和DNP-Lys可知該兩肽段的N-末端分別為-Ser-和-Lys-，結合（2）可得：-Ser-Ala-Tyr-和-Lys-( )-( )-Phe-；
（4）胰蛋白酶專一斷裂Arg或Lys殘基的羧基參與形成的肽鍵，由題生成的兩肽段氨基酸組成（Arg、Pro和Phe、Tyr、Lys、Ser、Ala）可得：-Pro-Arg-和-( )-( )-( )-( )-Lys；
綜合（2）、（3）、（4）可得此肽一級結構為：-Lys-Pro-Arg-Phe-Ser-Ala-Tyr-

5、三肽Lys- Lys- Lys的pI值必定大於它的任何一個個別基團的pKa值，這種說法是否正確？為什麼？[正確，因為此三肽處於等電點時，七解離集團所處的狀態是C-末端COO-（pKa=3.0），N末端NH2（pKa≌8.0），3個側鏈3（1/3ε- NH3+）（pKa=10.53）,因此pI>最大的pKa值（10.53）]

6、一個多肽可還原為兩個肽段，它們的序列如下：鏈1為Ala-Cys-Phe-Pro-Lys-Arg-Trp-Cys-Arg- Arg-
Val-Cys；鏈2為Cys-Tyr-Cys-Phe-Cys。當用嗜熱菌蛋白酶消化原多肽（具有完整的二硫鍵）時可用下列各肽：（1）（Ala、Cys2、Val）；（2）（Arg、Lys、Phe、Pro）；（3）(Arg2、Cys2、Trp、Tyr)；（4）(Cys2、Phe)。試指出在該天然多肽中二硫鍵的位置。（結構如下圖）
S-S
Ala-Cys-Phe-Pro-Lys-Arg-Trp-Cys-Arg-Arg-Val_Cys

S

S

Cys-Tyr-Cys-Phe-Cys
S-S
解：嗜熱菌蛋白酶作用專一性較差，根據題中已知條件：
（1）消化原多肽得到（Ala、Cys2、Val），說明鏈1在2位Cys 後及11位Val前發生斷裂，2位Cys與12位Cys之間有二硫鍵；
（2）由鏈1序列可得該肽段序列為：-Phe-Pro-Lys-Arg-；
（3）由（1）（2）可知該肽段(Arg2、Cys2、Trp、Tyr)中必有一Cys來自鏈2，另一Cys為鏈1中8位Cys，即鏈1中8位Cys與鏈2中的一個Cys有二硫鍵；
（4）嗜熱菌蛋白酶能水解Tyr、Phe等疏水氨基酸殘基，故此肽（Cys2、Phe）來自鏈2，結合（3）中含Tyr，可知（3）中形成的二硫鍵為鏈1 8位Cys與鏈2中3位Cys與鏈2中3位Cys之間；（4）中（Cys2、Phe）說明鏈2中1位Cys與5位Cys中有二硫鍵。
綜合（1）、（2）、（3）、（4）可得結果。

7、一個十肽的氨基酸分析表明其水解液中存在下列產物：
NH4+ Asp Glu Tyr Arg
Met
Pro Lys Ser
Phe
並觀察下列事實：（1）用羧肽酶A和B處理該十肽無效；（2）胰蛋白酶處理產生兩個四肽和游離的Lys；（3）梭菌蛋白酶處理產生一個四肽和一個六肽；（4）溴化氫處理產生一個八肽和一個二肽，用單字母符號表示其序列為NP；（5）胰凝乳蛋白酶處理產生兩個三肽和一個四肽，N-末端的胰凝乳蛋白酶水解肽段在中性pH時攜帶-1凈電荷，在pH12時攜帶-3凈電荷；（6）一輪Edman降解給出下面的PTH衍生物：
寫出該十肽的氨基酸序列。[Ser-Glu-Tyr-Arg-Lys-Lys-Phe-Met-Asn-Pro]
解：（1）用羧肽酶A和B處理十肽無效說明該十肽C-末端殘基為-Pro；
（2）胰蛋白酶專一斷裂Lys或Arg殘基的羧基參與形成的肽鍵，該十肽在胰蛋白酶處理後產生了兩個四肽和有利的Lys，說明十肽中含Lys-…或-Arg-…-Lys-Lys-…或-Arg-Lys-…-Lys-…Arg-Lys-…四種可能的肽段，且水解位置在4與5、5與6或4與5、8與9、9與10之間；
（3）梭菌蛋白酶專一裂解Arg殘基的羧基端肽鍵，處理該十肽後，產生一個四肽和一個六肽，則可知該十肽第四位為-Arg-；
（4）溴化氰只斷裂由Met殘基的羧基參加形成的肽鍵，處理該十肽後產生一個八肽和一個二肽，說明該十肽第八位或第二位為-Met-；用單字母表示二肽為NP，即-Asn-Pro-，故該十肽第八位為-Met-；
（5）胰凝乳蛋白酶斷裂Phe、Trp和Tyr等疏水氨基酸殘基的羧基端肽鍵，處理該十肽後，產生兩個三肽和一個四肽，說明該十肽第三位、第六位或第七位為Trp或Phe；
（6）一輪Edman降解分析N-末端，根據其反應規律，可得N-末端氨基酸殘疾結構式為：-NH-CH(-CH2OH)-C(=O)-，還原為-NH-CH(-CH2OH)-COOH-，可知此為Ser；
結合（1）、（2）、（3）、（4）、（5）、（6）可知該十肽的氨基酸序列為：
Ser-Glu-Tyr-Arg-Lys-Lys-Phe-Met-Asn-Pro

8、一個四肽，經胰蛋白酶水解得兩個片段，一個片段在280nm附近有強的光吸收，並且Pauly反應和坂口反應（檢測胍基的）呈陽性。另一片段用溴化氰處理釋放出一個與茚三酮反應呈黃色的氨基酸。寫出此四肽的氨基酸序列。[YRMP]
解：胰蛋白酶酶專一水解Lys和Arg殘基的羧基參與形成的肽鍵，故該四肽中含Lys或Arg；一肽段在280nm附近有強光吸收且Pauly反應和坂口反應（檢測胍基的）呈陽性，說明該肽段含Tyr和Arg；溴化氰專一斷裂Met殘基的羧基參加形成的肽鍵，又因生成了與茚三酮反應呈黃色的氨基酸，故該肽段為-Met-Pro-；所以該四肽的氨基酸組成為Tyr-Arg-Met-Pro，即YRMP。

9、蜂毒明肽（apamin）是存在蜜蜂毒液中的一個十八肽，其序列為CNCKAPETALCARRCQQH，已知蜂毒明肽形成二硫鍵，不與碘乙酸發生反應，（1）問此肽中存在多少個二硫鍵？（2）請設計確定這些（個）二硫鍵位置的策略。
[（1）兩個；（2）二硫鍵的位置可能是1-3和11-15或1-11和3-15或1-15和3-11，第一種情況，用胰蛋白酶斷裂將產生兩個肽加Arg；第二種情況和第三種，將產生一個肽加Arg，通過二硫鍵部分氧化可以把後兩種情況區別開來。]

10、敘述用Mernfield固相化學方法合成二肽Lys-Ala。如果你打算向Lys-Ala加入一個亮氨酸殘基使成三肽，可能會掉進什麼樣的「陷坑」？
解：（1）用BOC保護Ala氨基端，然後將其羧基掛接在樹脂上；
（2）除去N端保護，將用BOC保護的Arg用縮合劑DDC與Ala相連；
（3）將把樹脂懸浮在無水三氟乙酸中，通人乾燥的HBr，使肽與樹脂脫離，同時保護基也被切除。
若打算向Lys-Ala加入一個亮氨酸殘基使成三肽，可能的坑為：Leu可能接在Arg的非α-氨基上。

② fmoc 法化學合成大約多少錢

肽涉及物體內各種細胞功能物性物質結構介於氨基酸蛋白質間類化合物,由種氨基酸按照定排列順序通肽鍵結合現已發現離百種存於體肽於肽研究利用現空前繁榮景象
肽全合僅具重要理論意義且具重要應用價值通肽全合驗證新肽結構；設計新肽用於研究結構與功能關系；肽物合反應機制提供重要信息；建立模型酶及合新肽葯物等
肽化合技術論液相固相都已熟近幾十固相合肽更其省、省力、省料、便於計算機控制、便於普及推廣突優勢肽合規並擴展核苷酸合等其機物領域本文概述固相合基本原理、實驗程其現狀進行析並展望今發展趨勢
1．固相合基本原理
肽合重復添加氨基酸程合般C端（羧基端）向N端（氨基端）合肽合溶液進行自1963Merrifield發展功固相肽合經斷改進完善今固相已肽蛋白質合用技術表現經典液相合比擬優點其基本原理：先所要合肽鏈羥末端氨基酸羥基共價鍵結構同溶性高樹脂相連結合固相載體氨基酸作氨基組份經脫氨基保護基並同量化羧基組反應接肽鏈重復（縮合→洗滌→保護→洗滌→輪縮合）操作達所要合肽鏈度肽鏈樹脂裂解經純化等處理即所要肽其α-氨基用BOC（叔丁氧羰基）保護稱BOC固相合α-氨基用FMOC（9-芴甲氧羰基）保護稱FMOC固相合
2． 固相合具體試驗程
2．1樹脂選擇及氨基酸固定
固相合與其技術主要特徵固相載體能用於肽合固相載體必須滿足要求：必須包含反應位點（或反應基團）使肽鏈連些位點並除；必須合程物理化條件穩定；載體必須允許斷增肽鏈試劑間快速、受阻礙接觸；另外載體必須允許提供足夠連接點使每單位體積載體給用產量肽並且必須盡量減少載體束縛肽鏈間相互作用用於固相合肽高載體主要三類：聚苯乙烯-苯二乙烯交聯樹脂、聚丙烯醯胺、聚乙烯-乙二醇類樹脂及衍物些樹脂導入反應基團才能直接連（第）氨基酸根據所導入反應基團同些樹脂及樹脂衍物氯甲基樹脂、羧基樹脂、氨基樹脂或醯肼型樹脂BOC合通選擇氯甲基樹脂Merrifield樹脂；FMOC合通選擇羧基樹脂王氏樹脂 氨基酸固定主要通保護氨基酸羧基同樹脂反應基團間形共價鍵實現形共價鍵種：氯甲基樹脂通先制保護氨基酸四甲銨鹽或鈉鹽、鉀鹽、銫鹽適溫度直接同樹脂反應或合適機溶劑二氧六環、DMF或DMSO反應；羧基樹脂則通加入適縮合劑DCC或羧基二咪唑使保護氨基酸與樹脂形共酯完氨基酸固定；氨基樹脂或醯肼型樹脂卻加入適縮合劑DCC通保護氨基酸與樹脂間形醯胺鍵完氨基酸固定
2．2氨基、羧基、側鏈保護及脫除
要功合具特定氨基酸順序肽需要暫參與形醯胺鍵氨基羧基加保護同氨基酸側鏈性基要保護反應完再保護基除同液相合固相合採用烷氧羰基類型作α氨基保護基易發消旋早用苄氧羰基由於需要較強酸解條件才能脫除所改叔丁氧羰基（BOC）保護用TFA（三氟乙酸）脫保護適用含色氨酸等酸穩定肽類合1978chang MeienloferAtherton等採用Carpino報道Fmoc(9-芴甲氧羰基)作α氨基保護基Fmoc基酸穩定能用哌啶-CH2CL2或哌啶-DMF脫近Fmoc合廣泛應用 羧基通用形酯基進行保護甲酯乙酯逐步合保護羧基用通皂化除或轉變肼便用於片斷組合；叔丁酯酸性條件除；苄酯用催化氫化除 於合含半胱氨酸、組氨酸、精氨酸等帶側鏈功能基氨基酸肽說避免由於側鏈功能團所帶副反應般需要用適保護基側鏈基團暫保護起保護基選擇既要保證側鏈基團參與形醯胺反應要保證肽合程受破壞同要保證肽鏈裂解能除用三苯甲基保護半胱氨酸S-用酸或銀鹽、汞鹽除；組氨酸咪唑環用2,2,2-三氟-1-苄氧羰基2,2,2-三氟-1-叔丁氧羰基乙基保護通催化氫化或冷三氟乙酸脫精氨酸用金剛烷氧羰基（Adoc）保護用冷三氟乙酸脫
2．3肽反應
固相接肽反應原理與液相基本致兩相應氨基保護及羧基保護氨基酸放溶液內並形肽鍵要形醯胺鍵經用手段羧基化變混合酸酐、潑酯、醯氯或用強失劑（碳二亞氨）形稱酸酐等形醯胺鍵其選用DCC、HOBT或HOBT/DCC稱酸酐、化酯接肽應用廣
2．4 裂解及合肽鏈純化 BOC用TFA+HF裂解脫側鏈保護基FMOC直接用TFA根據條件同其鹼、光解、氟離氫解等脫保護採用合肽鏈進步精製、離與純化通採用高效液相色譜、親層析、毛細管電泳等
3．固相合特點及存主要問題
固相合於肽合顯著優點：簡化並加速步驟合；反應簡單反應器皿便進行避免手工操作物料重復轉移產損失；固相載體共價相聯肽鏈處於適宜物理狀態通快速抽濾、洗滌未完間純化避免液相肽合冗重結晶或柱步驟避免間體離純化量損失；使用量反應物迫使別反應完全便終產物高產率；增加溶劑化減少間產物聚焦；固相載體肽鏈輕度交聯聚合鏈緊密相混彼產種相互溶劑效應肽自聚集熱力利反應適宜 固相合主要存問題固相載體間體雜肽離造終產物純度液相合物必需通靠離手段純化
4．固相合研究發展前景
固相肽合已經40歷史現能合些較短肽鏈更談隨所欲合蛋白質同合試劑毒性昂貴費用副產物等直都令痛問題物體內核糖體合肽鏈速度產率都驚否能物體合蛋白質原理些啟發應用固相肽合（樹脂）令興趣問題許今肽合發展
建議查下資料
感覺問題主意不是很清晰

③ 芋螺毒素的毒素制備

制備芋螺毒素的方法主要有三種方法。第一種是自天然芋螺毒管中直接提取，此方法獲取量非常少，且由於海洋生態的破壞使得野生芋螺數量急劇減少，該法會進一步加劇芋螺資源惡化，因此靠分離提取獲得大量的芋螺毒素用於研究和生產並不現實，但提取到的少量天然毒液可通過一系列儀器分析手段得到單個毒素肽的氨基酸序列，再根據所得序列人工合成這些肽，可進一步用於活性測試和結構分析。第二種是基因工程方法，即將芋螺毒素的基因轉化到微生物中使其表達，後期再進行分離純化。由於部分芋螺毒素的N端為Cys，醯胺化C端，加之原核表達系統無法加工去除N-端信號肽序列，無法解決醯胺化C端問題，且芋螺毒素分子小，鹼性氨基酸較多，難於形成特定活性構象，使得分離純化較為困難。但隨著基因工程技術的日新月異，用芋螺毒素成熟肽基因，加接原核或真核生物的信號肽，或同時轉入醯胺化酶基因，可望生產出大量廉價的重組芋螺毒素。 從芋螺的毒管中可提取少量天然芋螺毒素，大多從野生芋螺的死體毒管中提取。或者引誘活體芋螺刺捕獵物，用乳膠套收集噴射的毒液，可收集到幾微升毒液。為了充足供應芋螺，美國研究人員在農場里嘗試芋螺的養殖，只養了Conuspurpurascens一種，但還不能辨別活芋螺的性別，也未觀察到芋螺的交配行為，這說明暫時無法人工繁殖芋螺。因而，靠從芋螺體內分離提取獲得大量的芋螺毒素用於研究和生產是不現實的，天然來源的芋螺毒素十分有限，這制約了芋螺毒素研究的開展和應用。但獲得的少量天然毒液可用高效液相色譜儀進行分離和分析，通過質譜儀和序列分析，可得到單個毒素肽的氨基酸序列。
研究中使用的芋螺毒大多數是毒液排出管抽提物。對於大多數芋螺種來說，這些抽提物勉強用於研究。但也有例外，如一種產自東太平洋獵食魚的種類稱為紫紋芋螺（C.purpurascens），其抽提物量不足以用於生化研究。可以先將紫紋芋螺飼養在水中洞穴中，用吹脹的塑料套子在金魚身上摩擦，芋螺從沙子中跑出來，吸吮著套子，隨套子浮在水面上。或Eppendorf試管，挖去蓋子，放一些魚鰭在試管中，再在魚鰭上面放上一層薄膜，芋螺試圖吸吮試管，便將毒液排入試管中。每收集3-5mL毒液需要耐心地多次用這種方法不停地累積。 芋螺毒素是基因直接表達的產物，現代基因工程技術也促進了芋螺毒素的研究與開發。在研究芋螺毒素基因的結構和生物合成過程，尋找新芋螺毒素基因，研究其分子遺傳學機制，蛋白質折疊機制方面有重要的應用，且已取得了較快的進展。構建芋螺毒素cDNA文庫，從中篩選新芋螺毒素基因已成為研究新芋螺毒素及其分子特徵的重要途徑之一。
芋螺毒素在體內先合成較大的無活性多肽前體，它們由50~80個氨基酸殘基組成，含有典型的信號肽序列區和可變區，在近成熟肽區位置，有標準的蛋白質水解信號，這些信號肽序列在所有超家族成員中具有保守性。同一超家族的芋螺毒素成員具有高度保守的信號肽序列和高度保守的二硫鍵連接方式。如MVIIC，MVIID，SⅥA，SⅥB和SO3是根據已知ω-毒素毒素肽氨基酸保守序列，合成特定的探針，從中篩選出來的。其他國家已構建了織錦芋螺（C.textile），幻芋螺（C.magus），地紋芋螺（C.geographus），金翎芋螺（C.penaceus）等幾種芋螺的cDNA文庫。同時根據信號肽及3』端非翻譯序列，設計芋螺毒素各個超家族基因的特異PCR引物，從cDNA和基因組DNA中克隆新型毒素基因成為可能，且是分離芋螺毒素基因的主要方法。
研究人員從3種芋螺（C. livi-s、C.abbreviatus和C.ebraeus）中測出了284個四環芋螺毒素前體蛋白基因序列，又從另外5種芋螺（C. arena-tus，C.pennaceus，C. tessulatus，C.ven-tricosus和C. textile）中獲得了170個芋螺毒素的cDNA序列。他們都在GeneBank中申請了序列號。中國海南淺紋芋螺（C.striatus）和織錦芋螺（C. textile）中也分別發現了6種新O-超家族毒素的cDNA序列和2種α-CTX。地紋芋螺（C.geographus）基因組DNA則用PCR法克隆到新型α-CTX GIC。
中國海南產的大理石芋螺（Conus marmoreus Linnaeus）、幻芋螺（Conus magus Linnae-us）、信號芋螺（Conus litteratus Linnaeus）、勇士芋螺（Conus miles Linnaeus）、獨特芋螺（Conus caracteristicusFischer）、織錦芋螺（Conus textileLinnaeus）、桶形芋螺（ConusbetulinusLinnaeus）、疣縞芋螺（Conus livi-sHwass）等共12個種中分別發現了具有葯用功能的35種O-超家族芋螺毒素肽及其基因。根據毒素基因推測出相應的毒素氨基酸序列，通過人工合成或基因體外重組表達出這些芋螺毒素，進一步研究其活性，這些毒素即是新葯開發的候選葯物和先導葯物。但部分ω-芋螺毒素的N端為Cys，C端醯胺化，加之原核表達系統無法加工去除N-端信號肽序列，無法解決C-端醯胺化問題，且ω-芋螺毒素分子小，鹼性氨基酸較多，難於形成特定活性構象。 採用人工化學合成的方法，即通過分離天然芋螺毒素後測序或採用基因克隆方式獲得芋螺毒素序列，然後採用人工化學合成獲得更多量的芋螺毒素，較多使用的是多肽固相合成法。與傳統的多肽液相合成法相比，該法具有如下優越性：只需經過過濾和沖洗，就可以將產物多肽從可溶性試劑中分離開來；易於使用自動化設備；過量的反應試劑促使反應徹底進行；反應產物多肽一直結合在固相載體上，損失量將達到最小。根據氨基端保護基的不同，固相合成芋螺毒素常用方法為Fmoc法和Boc法。Fmoc法具有反應條件溫和、副反應少等特點，大多芋螺毒素的合成都採用該方法。合成後將肽鏈從樹脂上裂解下來，常用的裂解劑為reagentK試劑（trifluoroaceticacid∶water∶ethanedithiol∶phenol∶thioanisole，90∶5∶2.5∶7.5∶5）。接著脫去側鏈保護基、復性、純化，即可得到與天然毒素活性相同的肽，也可以合成其同系物進行結構和功能的研究。但由於ω-芋螺毒素氨基酸殘基較多，一般都在25個以上，其人工合成的產率較小，純度也低，合成的肽還需氧化折疊才能形成正確的構象。氧化折疊的方法有空氣氧化法、DMSO、DTT/cysteine、gluthatione氧化法等。
研究人員在合成ω- CNVIIA時，對這幾種氧化折疊方法作了比較，發現gluthatione氧化法效果最好。隨後進行純化，即可得到具有天然毒素活性且純度較高的多肽，最後利用NMR技術進行構象分析。因此，人工合成芋螺毒素的成本較高，還不能完全滿足作為葯物商業化生產的要求。但由於芋螺毒素葯物的用量小，效果好，價值高，可部分滿足市場需求。 隨著對芋螺毒素研究的深入和多肽合成技術的進步，芋螺毒素的合成方法也不斷改進。Ale-wood小組將硒代半胱氨酸引入，合成了3個α-芋螺毒素ImI的類似物。具體操作是用硒代半胱氨酸代替了其中的1對或者2對半胱氨酸，形成二硒鍵替代了原有的二硫鍵，顯著提高了芋螺毒素的氧化折疊效率，NMR和CD譜都表明類似物和天然的ImI在結構上十分相似，並且保持了原有的生物活性。可採用硒代半胱氨酸代替半胱氨酸合成了μ-芋螺毒素SIIIA類似物，並且使用同位素標記了1對半胱氨酸，在提高了合成效率的同時確定了二硫鍵的連接。
有研究人員在利用微波合成法合成了α-芋螺毒素MII的過程中，比較了使用微波合成法和經典的固相合成法。結果表明使用微波合成的產率更高，從77%~89%提高到75%-93%。更重要的是使用微波加熱縮短了每個反應周期的時間，由1-2h減少到12-15 min。如果把微波用於環狀肽α-芋螺毒素IMI合成，合成效率也有所提高。此外，芋螺毒素的合成還有很多其它的策略，如μ-MrIA和α-MII採用N-C骨架環化的方法合成。還有科學家利用內醯胺、硫醚等代替二硫鍵，研究芋螺毒素的折疊產率。 芋螺毒素的化學合成是獲得芋螺毒素的重要方法，也是進一步研究芋螺毒素活性與結構的基礎。關於芋螺毒素線性肽的合成研究已較深入，合成過程中最主要的問題是二硫鍵如何正確連接。針對不同的芋螺毒素合成，一般是在原有研究基礎上，進一步摸索適宜的保護基團和折疊方法。在線性肽的合成過程中，應優化反應試劑，減少副產物的形成，縮短反應時間，提高合成效率。
自從20世紀80年代中期合成α-芋螺毒素GI和MI以及ω-芋螺毒素GVIA以來，有數百種芋螺毒素肽都通過多肽固相合成法（solidphase peptide synthesis，簡稱SPPS）合成。方向是從C端到N端。每一個氨基酸連接由以下幾個過程組成：首先是去保護，即保護氨基酸必須用一種鹼性溶劑去除氨基的保護基團；其次是氨基酸活化，即下一個連接的氨基酸羧基被一種活化劑所活化；最後是偶聯，活化的單體和游離的氨基反應，形成肽鍵。以上3步循環進行，直至所需的肽合成完畢。
在合成過程中，氨基酸保護基團對合成有著重要影響，特別是一些易於氧化的氨基酸，如Met，Trp等，選擇適宜的保護基團可以減少副反應發生。由於芋螺毒素富含半胱氨酸，所以在合成時半胱氨酸保護基團需要慎重考慮。在固相合成中，半胱氨酸有10種以上的保護基團供選擇。這些保護基團對酸鹼或金屬離子的穩定性不同，可以根據這一特點脫去保護基團，從而可以形成游離的巰基、硫醇鹽或者直接脫去保護基團且同時形成二硫鍵，在這個過程中，切割液起著決定性作用。S-Trt、S-Tmob、S-Xan是芋螺毒素合成中常用的半胱氨酸保護基團，對酸不穩定，因此可與其它的保護基團一起用TFA等切割液脫去形成游離的巰基。S-Acm對酸很穩定，可用於Boc或Fmoc合成中，一般用I2或者Tl（tfa）3直接脫去並同時形成二硫鍵，也可以在汞鹽的條件下脫去並形成游離的巰基，這時要注意His，Met，Trp或者Tyr，它們都有可能被氧化。在Boc合成中，最常用的保護基團是S-MeBzl和S-MeOBzl，它們都對TFA很穩定，但可以用HF脫去。若S-Fm用作半胱氨酸的保護基團，就能先於樹脂被脫除。適宜的氨基酸保護基團可以減少合成過程中的副反應，提高合成效率。
由於天然芋螺毒素含有特定的二硫鍵連接方式，因此如何合成特定二硫鍵連接方式的多肽成為合成中最大的難題，也是限制獲得大量天然芋螺毒素的關鍵因素。在芋螺毒素合成過程中，二硫鍵形成一般通過以下兩種方法：第1種為游離的巰基形成二硫鍵；第2種為半胱氨酸脫保護直接形成二硫鍵；，因芋螺毒素一般含有多對二硫鍵，一般情況下需綜合使用上述兩種方法。游離的巰基形成二硫鍵在芋螺毒素的合成過程中，半胱氨酸的保護基團如果是S-Trt、S-Tmob、S-Xan等，經過切割後就會形成游離的巰基，這些巰基需進一步自由氧化形成二硫鍵。這是芋螺毒素合成最常用的策略。游離的巰基形成二硫鍵的方法有多種，如空氣氧化法、二甲基亞碸氧化法、固相埃爾曼試劑法、鐵氰化鉀氧化法等。一般認為此法形成的終產物受熱力學控制，反應產物為水，純化步驟少。但由於芋螺毒素含多個半胱氨酸，自由氧化後會形成多種同分異構體。含兩對二硫鍵可以形成3種異構體，如α、ρ、τ、χ等家族芋螺毒素。如果含有6個半胱氨酸理論上會形成15種異構體。研究者已經摸索多種方法，研究體外條件下二硫鍵形成的機制。結果表明芋螺毒素本身的性質和外界因素都對二硫鍵的連接有著一定程度的影響。如Shigeiu等研究了鹽濃度和溫度對ω-芋螺毒素MVIIC折疊的影響。結果顯示在5℃時氧化的效果最好，天然構象的產率隨著溫度的上升而下降，而2.0mol·L-1（NH4）2SO4可以大大提高ω-芋螺毒素MVIIC的正確折疊效率。Cruz等研究了去污劑對疏水性δ-芋螺毒素PVIA氧化折疊的影響，結果表明加入去污劑後天然產物的比例大大提高。Miloslavina等研究了離子化溶液對芋螺毒素折疊的影響，結果表明離子化溶液可以提高親水性和疏水性肽的氧化折疊效率。此外，前體肽和二硫鍵異構酶作用以及醯胺化等對芋螺毒素二硫鍵形成也都有一定程度的影響。半胱氨酸脫保護定點形成二硫鍵芋螺毒素含有多對半胱氨酸，每一對半胱氨酸可以採用不同的基團保護，合適的脫保護試劑脫去保護基團，定點形成二硫鍵，這是形成芋螺毒素二硫鍵正確連接的常用方法之一，此法可以定點形成二硫鍵，為構象研究提供了方便，但也需要注意Met、Trp等這些敏感的氨基酸可能會發生副反應。含有2對二硫鍵的α-芋螺毒素GI即採用此種方法被合成，其半胱氨酸分別用Acm和MeBzl保護，用HF/anisole脫去MeBzl保護基團，鐵氰化鉀氧化形成第1對二硫鍵，然後利用I2脫去Acm並且直接形成第2對二硫鍵，合成α-芋螺毒素GI時，在脫去MeBzl的同時，樹脂也被切割。而Alewood等對定點合成α-芋螺毒素GI進行了進一步探索，即首先在樹脂上形成二硫鍵，最後切去樹脂，具體為先用巰基乙醇/DIEA/DMF脫去Fm保護基團形成第1對二硫鍵，之後再利用I2脫去Acm並且直接形成第2對二硫鍵，最後才使用HF脫去樹脂。
另外，還有一種新的定點形成二硫鍵的方法，稱為一罐法（One-pot method）。即兩對半胱氨酸分別用t-Butyl和4-methylbenzol基團保護，在5%DMSO/TFA和25℃條件下，t-Butyl保護基團被脫除，再將溫度升高到70℃脫去4-methylbenzol基團。研究人員利用兩步法和一罐法均合成了α-芋螺毒素ImI，並且比較二者合成效率，結果表明一罐法合成效率更高。
O-、M-等超家族芋螺毒素比較特殊，因為含有3對二硫鍵，一般自由氧化和定點形成二硫鍵相結合來合成。如ω-芋螺毒素MVIID，此肽含有6個半胱氨酸。首先用S-Trt保護Cys1，Cys3，Cys4，Cys6，Cys2，Cys5用S-Acm保護。先用切割液脫去樹脂和S-Trt保護基團，形成4個游離的巰基，空氣氧化形成2對二硫鍵，剩下的1對保護基團採用I2脫去並形成第3對二硫鍵。含有3對二硫鍵的芋螺毒素還可以採用三步法合成，即每一步都形成1對二硫鍵。Durieux等利用S-Trt，S-Acm和S-MeOzl3種保護基團，分3步切割形成二硫鍵合成了ω-芋螺毒素MVIIA。

④ 如何脫除boc 酸酐阿

我做boc保護濃縮後產率超過1，有東西沒洗掉，James-CG(站內聯系TA)BOC酸酐與檸檬酸分解掉rava(站內聯系TA)若Boc2O過剩，可以洗掉部分，但不會徹底，殘留是一定的；Boc2O和氨基等摩爾量的話，基本上不會有多餘。
柱分離可將其餘其他雜質除盡。大蜜桃(站內聯系TA)可以簡單的，粗略的過一下柱子，boc酸酐在柱子上會被分解掉的。tqg2468(站內聯系TA)檸檬酸可以洗掉TEA，不大能洗掉多少BOC酸酐。

簡單的柱分離吧，BOC酸酐的極性很小的，石油醚就可以沖出來的寂如秋葉(站內聯系TA)boc酸酐沸點只有57度，在溶劑存在的情況下，隨便蒸蒸就沒了，工業生產中用到它的時候，大部分也如此處理，這也是boc酸酐廣泛應用的一個原因:)寂如秋葉(站內聯系TA)另，採用檸檬酸洗是為了防止boc脫掉，因為Boc對酸敏感，用鹽酸的話很容易脫掉xiaoqihu(站內聯系TA)用水是不能洗掉Boc酸酐的
簡單的辦法，把你的產物濃縮到沒有溶劑，然後加入正己烷，分液，然後再用正己烷洗幾遍，即可chjw2010(站內聯系TA)鹼性條件下用PE/EA3:1萃取幾次就可以了，然後水相酸化萃取產品就可以了huangchk(站內聯系TA)N,N-二甲基乙二胺攪拌後用稀酸水洗除去

⑤ 多肽固相合成法的側鏈保護

His是最容易發生消旋化的氨基酸，必須加以保護.
對咪唑環的非π-N開始用苄基(Bzl)和甲基磺醯基(TOS)保護.但這兩種保護基均不太理想.TOS對親核試劑不穩定，Bzl需要用氫解或Na/NHs除去，並且產生很大程度消旋.Boc基團是一個較理想的保護基，降低了咪唑環的鹼性，抑制了消旋，成功地進行了一些合成.但是當反復地用鹼處理時，也表現出一定的不穩定性.哌啶羰基在鹼中穩定，但是沒能很好地抑制消旋，而且脫保護時要用很強的親核試劉如.
對咪唑環π-N保護，可以完全抑制消旋，π-N可以用苄氧甲基(Bom)和叔丁氧甲基(Bum)保護，(Bum)可以用TFA脫除，Bom更穩定些，需用催化氫解或強酸脫保護，Bum是目前很有發展前途的His側鏈保護基，其不足之處在於Fmoc(His)Bum在DCM和DMF中的溶解度較差. Arg的胍基具有強親核性和鹼性，必須加以保護.理想的情況是三個氮都加以保護，實際上保護1或2個胍基氮原子.保護基分四類：(1)硝基(2)烷氧羰基(3)磺醯基(4)三苯甲基.
硝基在制備、醯化裂解中產生很多副反應，應用不廣.烷氧羰基應主要有Boc和二金剛烷氧羰基(Adoc)2、Fmoc(Arg)Boc的耦聯反效率不高，哌啶理時不處穩定，會發生副反應；Adoc保護了兩個非π－N，但有同樣的副反應發生.對磺醯基保護，其中TOS應用最廣，但它較難脫除.近年來2，3，6-三甲基-4-甲氧苯橫醯基(Mtr)較受歡迎，在TFA作用下，30分鍾即可脫除，但是它們都不能完全抑制側鏈的醯化發生.三苯甲基保護基可用TFA脫除.缺點是反應較慢，側鏈仍有醯化反應，且其在DCM、DMF中溶解度不好. 固相中的接肽反應原理與液相中基本一致.將兩個相應的氨基被保護的及羧基被保護的氨基酸放在溶液內，並不形成肽鍵.要形成醯胺鍵，經常用的手段是將羧基活化，其方法是將它變成混合酸酐，或者將它變為活潑酯、醯氯，或者用強的失去劑(碳二亞胺)也可形成醯胺鍵。
碳二亞胺是常用的活化試劑，其中Dcc使用范圍最廣，其缺點是形成了不溶於DCM的DCH，過濾時又難於除盡.其他一些如二異丙基碳二亞胺(DCI)、甲基叔丁基碳二亞胺也用於固相合成中，它們形成的脲溶於DCM中，經洗滌可以除去.其他活化試劑，還有Bop(Bop－C1)、氯甲酸異丙酯、氯甲酸異丁酯、SOC12等.其中Dcc、Bop活化形成對稱酸酐、SOC12形成醯氯，其餘三種形成不對稱酸酐。 '[)V#e'{8E2c 活化酯法在固相合成中應用最為廣泛.採用過的試劑也很多，近來最常用的有HOBt酯、ODhbt酯、OTDO酯等.
HOBt酯反應快，消旋少，用碳二亞胺很容易製得；ODhbt酯很穩定，容易進行分離純化，與HOBt酯具有類似的反應性和消旋性能，它還有一個優越之處，在醯化時有亮黃色、耦聯結束時顏色消失，有利於監測反應；OTDO酯與ODhbt酯類似，消旋化極低，易分離，醯化時伴有顏色從桔紅色到黃色的變化等. b1Z7n+k:E5w3n2E2l7 將碳二亞胺和α－N保護氨基酸直接加到樹脂中進行反應叫做原位法.。
用DIC代替Dcc效果更好.其他的活化試劑還有Bop和Bop-C1等.原位法反應快、副反應少、易操作.其中DIC最有效，其次是Bop、Bop-C1等.遺憾的是Bop醯化時生成致癌的六甲基磷醯胺，限制了其應用. Fmoc法裂解和脫側鏈保護基時可採用弱酸.TFA為應用最廣泛的弱酸試劑，它可以脫除t-Bu、Boc、Adoc、Mtr等；條件溫和、副反應較少.不足之處：Arg側鏈的Mtr很難脫除，TFA用量較大；無法除掉Cys的t-Bu等基因.也有採用強酸脫保護的方法：如用HF來脫除一些對弱酸穩定的保護基，如Asp、Glu、Ser、Thr的Bzl(苄基)保護基等，但是當脫除Asp的吸電子保護基時，會引起環化副反應.而TMSBr和TMSOTf在有苯甲硫醚存在時，脫保護速度很快.此外，根據條件不同，鹼、光解、氟離子和氫解等脫保護方法也有應用.
固相合成法對於肽合成的顯著的優點：簡化並加速了多步驟的合成；因反應在一簡單反應器皿中便可進行，可避免因手工操作和物料重復轉移而產生的損失；固相載體共價相聯的肽鏈處於適宜的物理狀態，可通過快速的抽濾、洗滌未完成中間的純化，避免了液相肽合成中冗長的重結晶或分柱步驟，可避免中間體分離純化時大量的損失；使用過量反應物，迫使個別反應完全，以便最終產物得到高產率；增加溶劑化，減少中間的產物聚焦；固相載體上肽鏈和輕度交聯的聚合鏈緊密相混，彼此產生一種相互的溶劑效應，這對肽自聚集熱力學不利而對反應適宜。固相合成的主要存在問題是固相載體上中間體雜肽無法分離，這樣造成最終產物的純度不如液相合成物，必需通過可靠的分離手段純化。

⑥ 多肽合成的介紹

多肽合成是一個來固相合成源順序一般從C端（羧基端）向 N端（氨基端）合成。過去的多肽合成是在溶液中進行的稱為液相合成法。從1963年Merrifield發展成功了固相多肽合成方法以來，經過不斷的改進和完善，到今天固相法已成為多肽和蛋白質合成中的一個常用技術，表現出了經典液相合成法無法比擬的優點，從而大大的減輕了每步產品提純的難度。多肽合成總的來說分成兩種：固相合成和液相多肽合成。

⑦ 我想把BOC基團除掉，然後再接上其他的基團。請各位道友推薦一個簡單有效的方法，側鏈上有一個醯胺鍵。

加NaOH水解就可以將BOC去掉

⑧ 多肽合成儀的歷史背景

多肽合成研究已經走過了一百多年的光輝歷程。1902年，Emil Fischer首先開始關注多肽合成，由於當時在多肽合成方面的知識太少，進展也相當緩慢，直到1932年，Max Bergmann等人開始使用苄氧羰基(Z)來保護α-氨基，多肽合成才開始有了一定的發展。到了20世紀50年代，有機化學家們合成了大量的生物活性多肽，包括催產素，胰島素等，同時在多肽合成方法以及氨基酸保護基上面也取得了不少成績，這為後來的固相合成方法的出現提供了實驗和理論基礎。
1963年，Merrifield首次提出了固相多肽合成方法(SPPS)，這個在多肽化學上具有里程碑意義的合成方法，一出現就由於其合成方便，迅速，成為多肽合成的首選方法，而且帶來了多肽有機合成上的一次革命，並成為了一支獨立的學科——固相有機合成(SPOS)，為此，Merrifield榮獲了1984年的諾貝爾化學獎。Merrifield經過了反復的篩選，最終屏棄了苄氧羰基(Z)在固相上的使用，首先將叔丁氧羰基(BOC)用於保護α-氨基並在固相多肽合成上使用，同時，Merrifield在60年代末發明了第一台全自動多肽合成儀，並首次合成生物蛋白酶，核糖核酸酶(124個氨基酸)。
1972年，Lou Carpino首先將9-芴甲氧羰基(FMOC)用於保護α-氨基，其在鹼性條件下可以迅速脫除，10min就可以反應完全，而且由於其反應條件溫和，迅速得到廣泛使用，以BOC和FMOC這兩種方法為基礎的各種肽自動合成儀也相繼出現和發展，並仍在不斷得到改造和完善。同時，固相合成樹脂，多肽縮合試劑以及氨基酸保護基，包括合成環肽的氨基酸正交保護上也取得了豐碩的成果。 第一代多肽合成儀產生時間為上世紀六十年代末至七十年代初。
代表產品是Beckman公司推出的Beckman 990 Peptide Synthesizer和Vega』s Biotechnologies公司推出的Vega』s 296 Peptide Synthesizer。如今該兩家公司均以放棄了多肽合成儀的研發與生產，我們只能在早期的學術文獻中找到其設計原理與研究情況。雖然隨著生產工藝的改進和發展，第一代多肽合成儀已全部退出了市場。但1990年以前的眾多肽化學文獻都是在此實驗設備上運行研發而來，第一代的多肽合成儀為之後的合成儀研發與製造產生了重大意義。 第二代多肽合成儀誕生在上世紀八十年代。
代表產品是Protein Technologies公司推出的PS3 Peptide Synthesizer以及Advanced ChemTech公司推出的ACT peptide synthesizer Model 90。標志性特點是溫和反應法合成多肽，一般可分為單純氮氣鼓泡和搖動式兩種。PS3 的設計原理是採用氮氣鼓泡的反應方式來對反應物進行攪拌，即合成儀上反應器是固定的，氮氣從反應器的下方通過反應器到上部排出，在這一過程中產生的汽泡把固相和液相混合起來。這樣設計的好處是結構簡單，成本低，但反應相對溫和：1）有時候多肽-固相載體在靜電作用下會「抱團」，使其不能與液相充分混合，在這種情況下需要調高氮氣的壓力以消除靜電作用；而在靜電作用消除後要把壓力立刻調低，不然的話較高的壓力會把多肽-固相載體「吹」到反應器液面上方。由於多肽-固相載體具有較強的粘壁性，一旦被粘到反應器液面上方就再也無法下來，也就是無法再參加反應。顯然第一代機器是無法自動作這樣的壓力調整的，這就是造成反應「死角」的重要原因。反應死角會降低多肽合成的效率和多肽的純度，有的甚至造成合成的失敗。2）長時間氮氣鼓泡會使溶液揮發，液面降低後一部分多肽-固相載體就粘在液面上方，也無法再參加反應。3）氮氣消耗量大，運行成本增大。ACT90的設計原理是反應器在直立下圍繞原點作左右擺動，或者圓周運動。ACT的多肽合成儀同樣具有反應溫和的特點，即轉動角度與速度都不能夠完全達到氨基酸耦合的極限，反應往往需要更長的時間。 第三代多肽合成儀誕生在上世紀九十年代
代表產品是美國Applied Biosystems公司的ABI 433 peptide synthesizer 與C S Bio公司的CS336無死角多肽合成儀。ABI433的設計原理是反應器上方相對固定，而下方作圓周360度快速旋轉，帶動反應器里的固液兩相從底部向上作螺旋運動，一直達到反應器的最上方。換句話說，溶液可以達到反應器內部的任意點，真正做到了無死角。由於攪拌速率可達每分鍾1800轉的高速，反應得以充分完全。由於無死角的攪拌方式保證的肽的合成純度，ABI433型多肽合成儀（其退出多肽合成儀市場後最後一款儀器）至今在世界上還佔有著很大的比例。當然，ABI產品的售價也是最高的。由於部件使用頻率高，電磁閥會經常損壞，而ABI將7個電磁閥做成模塊化的設計，壞掉一個電磁閥必須要更換整個模塊，無形中增加了維修成本。
CS336的設計原理是反應器中點為圓心，上下做180度旋轉攪拌，攪拌速度可達180rpm，同時其採用了氮氣鼓泡反應方式的優越性，將氮氣吹動作為可選反應方式融入反應方法中，多肽合成儀在科研領域的高耦合率效果得到充分體現。 多肽合成儀以固相合成為反應原理，在密閉的防爆玻璃反應器中使氨基酸按照已知順序（序列，一般從C端-羧基端 向 N端-氨基端）不斷添加、反應、合成，操作最終得到多肽載體。固相合成法，大大的減輕了每步產品提純的難度。為了防止副反應的發生，參加反應的氨基酸的側鏈都是保護的。羧基端是游離的，並且在反應之前必須活化。固相合成方法有兩種，即Fmoc和tBoc。由於Fmoc比tBoc存在很多優勢，現在大多採用Fmoc法合成，但對於某些短肽，tBoc因其產率高的優勢仍然被很多企業所採用。
具體合成由下列幾個循環組成：
1） 去保護：Fmoc保護的柱子和單體必須用一種鹼性溶劑（piperidine）去 除氨基的保護基團。
2） 激活和交聯：下一個氨基酸的羧基被一種活化劑所活化。活化的單體與游離的氨基反應交聯，形成肽鍵。在此步驟使用大量的超濃度試劑驅使反應完成。循環：這兩步反應反復循環直到合成完成。
3） 洗脫和脫保護：多肽從柱上洗脫下來，其保護基團被一種脫保護劑（TFA） 洗脫和脫保護。 反應器
數百年來，制葯業的反應器/反應釜 設備以玻璃材質最為常見，因其完全透明且耐腐蝕，而被眾多化學、生物學專家沿用。多肽合成的過程需要操作人員直觀監測，同時合成後可進行在線切割（切割試劑TFA的強腐蝕性對反應器材質有了極大限制），這些要求限制反應器以玻璃材質最為適用。玻璃材質的反應器在製造工藝上有極大的難度限制：①燒制工藝：磨口精度要求極高，正如很多國產設備都無法達到要求出現漏液漏氣現象，玻璃壁均勻程度等。②配合攪拌柄以及密封裝置的成套加工工藝③防爆處理
氨基酸儲罐
用來儲存氨基酸粉末或預先活化溶解好的氨基酸溶液。小型合成儀的氨基酸儲罐一般在20－40個之間以保證無人監控下的全自動縮合反應順利進行。大型合成儀根據生產規模的不同，配置也各不相同。
溶劑儲罐
用來儲存多肽合成過程中需要的有機溶液，如DMF,PIP等。
量筒
用來測量氨基酸溶液與其他試劑的合成量，需有精密型感測器設計刻度並回傳信息至電腦控製程序。因早期的恆壓法測定偏差過大且操作繁瑣，而採用此方法測定。觸發器的數量根據不同客戶的要求而定，不同的品牌也略有不同。
轉液瓶
感應器
多端觸發器自感應定量量取法，直觀、科學、相對誤差最低。代替早期的恆壓法，避免了每日進行的大量的數學運算，操作更為簡單，測定誤差值可控制在1%。
廢液桶
廢液桶通常選擇容積較大的HDPE桶，保證通風良好，同時需安裝感應器裝置時刻檢測廢液情況，避免溢出。 電磁閥
多肽合成儀中的電磁閥屬於敏感配件，其控制液路的串聯與閉路，在氨基酸轉移與量取，溶劑轉移與量取兩步驟中起到至關重要的作用。不同品牌的合成儀對電磁閥的設計與排布也略有不同。
控制面板
控制面板內往往含有光敏組建，部分控制電磁閥以及感應器控制組。與電腦主機的控制系統、合成儀統一的鏈接在一起，完成多肽合成的全過程。
軟體系統
多肽合成儀的操作軟體。不同品牌合成儀所注冊的軟體也不同。 a) UV Monitor
在多肽合成儀中，在線檢測耦合效果的裝置，如UV Monitor往往是選配裝置，客戶可根據實驗的需要選購。其功能是讓操作者直觀的看到多肽合成的每一部氨基酸偶聯效果，從而針對特定的序列做合成設置的調整，最終達到最佳合成效果。
對於不熟悉多肽合成儀操作的用戶來說，UV Monitor是相當重要的。
b) 試劑檢測
沒有選購在線檢測附件的多肽合成儀用戶，也可以採用試劑檢測方法做基本的耦合效果測定實驗。
固相多肽合成中，主要是通過檢測樹脂上游離氨基來判斷連接效率，檢測方法稱為Kaiser方法，其檢測結果，如果有游離氨基的時候，顯示蘭色，或紅褐色（pro，ser，His）。
Kaiser試劑包括：A，6% 茚三酮的乙醇溶液；B，80% 苯酚的乙醇溶液；C，2% 0.001M KCN的吡啶溶配製中的吡啶需要經過茚三酮處理後，重蒸後再使用。檢測過程，取少量樹脂，加入A，B，C各2-3滴，100℃下加熱1-2min，如果溶液有蘭色，或樹脂出現蘭色，紅褐色，表明還有游離氨基，否則說明連接完全。

⑨ 多肽合成的基本原理是什麼

多肽合成

多肽合成又叫肽鏈合成，是一個固相合成順序一般從C端(羧基端)向N端(氨基端)合成。過去的多肽合成是在溶液中進行的稱為液相合成法。合肥合生生物多肽的合成主要分為兩條途徑:化學合成多肽和生物合成多肽。

多肽合成的原理

多肽合成就是如何把各種氨基酸單位按照天然物的氨基酸排列順序和連接方式連接起來。由於氨基酸在中性條件下是以分子內的兩性離子形式(H3+NCH(R)COO-)存在，因此，氨基酸之間直接縮合形成醯胺鍵的反應在一般條件下是難於進行的。

氨基酸酯的反應活性較高。在100℃下加熱或者室溫下長時間放置都能聚合生成肽酯，但反應並沒有定向性，兩種氨基酸a1和a2的酯在聚合時將生成a1a2…、a1a1…、a2a1…等各種任意順序的混合物。

為了得到具有特定順序的合成多肽，採用任意聚合的方法是行不通的，合肥合生生物而只能採用逐步縮合的定向多肽合成方法。一般是如下式所示，即先將不需要反應的氨基或羧基用適當的基團暫時保護起來，然後再進行連接反應，以保證多肽合成的定向進行。

式中的X和Q分別為氨基和羧基的保護基，它不僅可以防止亂接副反應的發生，還具有能消除氨基酸的兩性離子形式，並使之易溶於有機溶劑的作用。

Q在有的情況下也可以不是共價連接的基團，而是由有機強鹼(如三乙胺)同氨基酸的羧基氫離子組成的有機陽離子。Y為一強的吸電子基團，它能使羧基活化，而有利於另一氨基酸的自由氨基，對其活化羧基的羧基碳原子進行親核進攻生成醯胺鍵。

由此所得的連接產物是N端和C端都帶有保護基的保護肽，要脫去保護基後才能得到自由的肽。如果肽鏈不是到此為止，而是還需要從N端或C端延長肽鏈的話，則可以先選擇性地脫去X或Q，然後再同新的N保護氨基酸(或肽)或C保護的氨基酸(或肽)進行第二次連接，並依次不斷重復下去，直到所需要的肽鏈長度為止。

對於長肽的多肽合成來說，一般有逐步增長和片段縮合兩種伸長肽鏈的方式，前者是由起始的氨基酸(或肽)開始。每連接一次，接長一個氨基酸，後者則是用N保護肽同C保護肽縮合來得到兩者長度相加的新的長肽鏈。

對於多肽合成中含有谷氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、半胱氨酸等等帶側鏈功能團的氨基酸的肽來說，為了避免由於側鏈功能團所帶來的副反應，一般也需要用適當的保護基將側鏈基團暫時保護起來。

多肽的固相合成

多肽的合成是氨基酸重復添加的過程，通常從C端向N端(氨基端)進行合成。多肽固相合成的原理是將目的肽的第一個氨基酸C端通過共價鍵與固相載體連接，再以該氨基酸N端為合成起點，經過脫去氨基保護基和過量的已活化的第二個氨基酸進行反應，接長肽鏈，重復操作，達到理想的合成肽鏈長度，最後將肽鏈從樹脂上裂解下來，分離純化，獲得目標多肽。

1、Boc多肽合成法

Boc方法是經典的多肽固相合成法，以Boc作為氨基酸α-氨基的保護基，苄醇類作為側鏈保護基，Boc的脫除通常採用三氟乙酸(TFA)進行。多肽合成時將已用Boc保護好的N-α-氨基酸共價交聯到樹脂上，TFA切除Boc保護基，N端用弱鹼中和。

肽鏈的延長通過二環己基碳二亞胺(DCC)活化、偶聯進行，最終採用強酸氫氟酸(HF)法或三氟甲磺酸(TFMSA)將合成的目標多肽從樹脂上解離。在Boc多肽合成法中，為了便於下一步的多肽合成，反復用酸進行脫保護，一些副反應被帶入實驗中，例如多肽容易從樹脂上切除下來，氨基酸側鏈在酸性條件不穩定等。

2、Fmoc多肽合成法

Carpino和Han以Boc多肽合成法為基礎發展起來一種多肽固相合成的新方法——Fmoc多肽合成法。

Fmoc多肽合成法以Fmoc作為氨基酸α-氨基的保護基。其優勢為在酸性條件下是穩定的，不受TFA等試劑的影響，應用溫和的鹼處理可脫保護，所以側鏈可用易於酸脫除的Boc保護基進行保護。

肽段的最後切除可採用TFA/二氯甲烷(DCM)從樹脂上定量完成，避免了採用強酸。同時，與Boc法相比，Fmoc法反應條件溫和，副反應少，產率高，並且Fmoc基團本身具有特徵性紫外吸收，易於監測控制反應的進行。Fmoc法在多肽固相合成領域應用越來越廣泛。

多肽液相分段合成

隨著多肽合成的發展，多肽液相分段合成(即多肽片段在溶液中依據其化學專一性或化學選擇性，自發連接成長肽的合成方法)在多肽合成領域中的作用越來越突出。其特點在於可以用於長肽的合成，並且純度高，易於純化。

多肽液相分段合成主要分為天然化學連接和施陶丁格連接。天然化學連接是多肽分段合成的基礎方法，局限在於所合成的多肽必須含半光氨酸(Cys)殘基，因而限定了天然化學連接方法的應用范圍。天然化學連接方法的延伸包括化學區域選擇連接、可除去輔助基連接、光敏感輔助基連接。

施陶丁格連接方法是另一種基礎的片段連接方法，其為多肽片段連接途徑開拓了更廣闊的思路。正交化學連接方法是施陶丁格連接方法的延伸，通過簡化膦硫酯輔助基來提高片段間的縮合率。

其他多肽合成方法

1、氨基酸的羧內酸酐法(NCA)

氨基酸的羧內酸酐的氨基保護基也可活化羧基。

NCA的原理:在鹼性條件下，氨基酸陰離子與NCA形成一個更穩定的氨基甲酸酯類離子，在酸化時該離子失去二氧化碳，生成二肽。生成的二肽又與其他的NCA結合，反復進行。

NCA適用於短鏈肽片段的多肽合成，其周期短、操作簡單、成本低、得到產物分子量高，在目前多肽合成中所佔比例較大，技術也較為通用。

2、組合化學法

20世紀80年代，以固相多肽合成為基礎提出了組合化學法，即氨基酸的構建單元通過組合的方式進行連接，合成出含有大量化合物的化學庫，並從中篩選出具有某種理化性質或葯理活性化合物的一套多肽合成策略和篩選方案。

組合化學法的多肽合成策略主要包括:混合-均分法、迭代法、光控定位組合庫法、茶葉袋法等。組合化學法的最大優點在於可同時合成多種化合物，並且能最大限度地篩選各種新化合物及其異構體。

3、酶解法

酶解法是用生物酶降解植物蛋白質和動物蛋白質，獲得小分子多肽。酶解法因其多肽產量低、投資大、周期長、污染嚴重，未能實現工業化生產。酶解法獲得的多肽能夠保留蛋白質原有的營養價值，並且可以獲得比原蛋白質更多的功能，更加綠色，更加健康。

4、基因工程法

基因工程法主要以DNA重組技術為基礎，通過合適的DNA模板來控制多肽的序列合成。有研究者通過基因工程法獲得了准彈性蛋白-聚纈氨酸-脯氨酸-甘氨酸-纈氨酸-甘氨酸肽(VPGVG)。

利用基因工程技術生產的活性多肽還有肽類抗生素、干擾素類、白介素類、生長因子類、腫瘤壞死因子、人生長激素，血液中凝血因子、促紅細胞生成素，組織非蛋白纖溶酶原等。

基因工程法合成多肽具有表達定向性強，安全衛生，原料來源廣泛和成本低等優點，但因存在高效表達，不易分離，產率低的問題，難以實現規模化生產。

5、發酵法

發酵法是從微生物代謝產物中獲得多肽的方法。雖然發酵法的成本低，但其應用范圍較窄，因為現在微生物能夠獨立合成的聚氨基酸只有ε-聚賴氨酸(ε-PL)、γ-聚谷氨酸(γ-PGA)和藍細菌肽。

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⑩ 哪位高手能幫我簡述固相肽合成技術

ziyirenjiajia 你好！
多肽合成技術
多肽葯物的研究與開發將作為二十一世紀高新技術竟爭的主要項目之一。生物活性多肽在內源性物質中佔有非常重要的地位，除酶、受體、金屬蛋白等生物大分子外，許多合成或分離的多肽對生理過程或病理過程，對疾病的發生、發展或治療過程有重要意義。

氨基酸彼此以醯胺鍵（也稱肽鍵）相互連接的化合物稱作肽。一種肽含有的氨基酸少於10個就稱作寡肽，超過的就稱為多肽。多肽與蛋白質只有肽鏈長短之別，二者間並沒有嚴格的區分。蛋白質是生命存在的最基本形式。可見多肽是生命之"橋"，蛋白質工程從某種意義上而言就是研究多肽。

伴隨著分子生學物、生物化學技術的飛速發展，多肽研究取得了驚人的、劃時代的飛躍。人們發現存在於生物體的多肽有數萬種，並且發現所有的細胞均能合成多肽。同時，幾乎所有的細胞也都受多肽調節，它涉及激素、神經、細胞生長與生殖等各個領域，21世紀是一個多肽的世界，人們研究多肽，也渴望著將多肽應用到醫療、保健、檢測等多個領域中去，為人類造福。

事實上，肽類葯物開發與應用已走出科學家們的實驗室，變成了現實，並發揮著其獨特的功效。例如，神經緊張肽（NT）能降低血壓，對腸和子宮具有收縮作用；內啡肽和腦啡肽的衍生物有著很強的鎮痛作用；促甲狀腺素釋放激素（TRH）是一種能促進產婦乳汁分泌的多肽；能治療糖尿病、胃潰瘍、胰腺炎的多肽是一種環狀的14肽；臨床上常用的催產素是一種多肽；已獲廣泛應用的白蛋白多肽、胸腺肽、血清胸腺因子（FTS）等均可以引起免疫T細胞的分化；近日來在中國及日本已開始使用的糖肽輔助治療腫瘤，其作用機理是使淋巴系統活化等等。應用多肽技術開發的醫用蛋白質晶元（肽晶元）只有指甲蓋大小，放置了與腎炎、胃潰瘍和胃癌等相關的抗原分子，只要通過晶元閱讀儀便可檢測到有關疾病的功能狀態與變異情況。其功能已相當於一個大型或中型實驗室、化驗室，效率是傳統醫學檢測的成百上千倍，受檢者幾乎沒有任何痛苦。肽晶元的廣泛應用，已在醫學臨床檢測業引發一場技術革命。

自從1963年MERRIFIELD發展成功了固相多肽合成（SPPS）方法以來，經過不斷的改進和完善，到今天這個方法已成為多肽和蛋白質合成中的一個常用技術，表現出了經典液相合成法無法比擬的優點。

固相合成的主要設計思想是：先將所要合成肽鏈的未端氨基酸的羧基以共價鍵的結構同一個不溶性的高分子樹脂相連，然後以此結合在固相載體上。氨基酸作為氨基組分經過脫去氨基保護基，並同過量的活化羥基組分反應接長肽鏈。重復（縮合—洗滌—去保護—中和和洗滌—下一輪縮合）操作，達到所要合成的肽鏈長度；最後將肽鏈從樹脂上裂解下來，經過純化等處理，即得所要的多肽。

http://www.pharmco.com.cn/technical-3.htm

多肽是涉及生物體內各種細胞功能的生物活性物質。它是分子結構介於氨基酸和蛋白質之間的一類化合物,由多種氨基酸按照一定的排列順序通過肽鍵結合而成。到現在，人們已發現和分離出一百多種存在於人體的肽，對於多肽的研究和利用，出現了一個空前的繁榮景象。
多肽的全合成不僅具有很重要的理論意義，而且具有重要的應用價值。通過多肽全合成可以驗證一個新的多肽的結構；設計新的多肽，用於研究結構與功能的關系；為多肽生物合成反應機制提供重要信息；建立模型酶以及合成新的多肽葯物等。
多肽的化學合成技術無論是液相法還是固相法都已成熟。近幾十年來，固相法合成多肽更以其省時、省力、省料、便於計算機控制、便於普及推廣的突出優勢而成為肽合成的常規方法並擴展到核苷酸合成等其它有機物領域。本文概述了固相合成的基本原理、實驗過程，對其現狀進行分析並展望了今後的發展趨勢。
1．固相合成的基本原理
多肽合成是一個重復添加氨基酸的過程，合成一般從C端（羧基端）向N端（氨基端）合成。過去的多肽合成是在溶液中進行的，但自從1963年Merrifield發展成功了固相多肽合成方法以來，經過不斷的改進和完善，到今天固相法已成為多肽和蛋白質合成中的一個常用技術，表現出了經典液相合成法無法比擬的優點。其基本原理是：先將所要合成肽鏈的羥末端氨基酸的羥基以共價鍵的結構同一個不溶性的高分子樹脂相連，然後以此結合在固相載體上的氨基酸作為氨基組份經過脫去氨基保護基並同過量的活化羧基組分反應，接長肽鏈。重復（縮合→洗滌→去保護→中和和洗滌→下一輪縮合）操作，達到所要合成的肽鏈長度，最後將肽鏈從樹脂上裂解下來，經過純化等處理，即得所要的多肽。其中α-氨基用BOC（叔丁氧羰基）保護的稱為BOC固相合成法，α-氨基用FMOC（9-芴甲氧羰基）保護的稱為FMOC固相合成法，
2． 固相合成的具體試驗過程
2．1樹脂的選擇及氨基酸的固定
將固相合成與其他技術分開來的最主要的特徵是固相載體，能用於多肽合成的固相載體必須滿足如下要求：必須包含反應位點（或反應基團），以使肽鏈連在這些位點上，並在以後除去；必須對合成過程中的物理和化學條件穩定；載體必須允許在不斷增長的肽鏈和試劑之間快速的、不受阻礙的接觸；另外，載體必須允許提供足夠的連接點，以使每單位體積的載體給出有用產量的肽，並且必須盡量減少被載體束縛的肽鏈之間的相互作用。用於固相法合成多肽的高分子載體主要有三類：聚苯乙烯-苯二乙烯交聯樹脂、聚丙烯醯胺、聚乙烯-乙二醇類樹脂及衍生物，這些樹脂只有導入反應基團，才能直接連上（第一個）氨基酸。根據所導入反應基團的不同，又把這些樹脂及樹脂衍生物分為氯甲基樹脂、羧基樹脂、氨基樹脂或醯肼型樹脂。BOC合成法通常選擇氯甲基樹脂，如Merrifield樹脂；FMOC合成法通常選擇羧基樹脂如王氏樹脂。 氨基酸的固定主要是通過保護氨基酸的羧基同樹脂的反應基團之間形成的共價鍵來實現的，形成共價鍵的方法有多種：氯甲基樹脂，通常先製得保護氨基酸的四甲銨鹽或鈉鹽、鉀鹽、銫鹽，然後在適當溫度下，直接同樹脂反應或在合適的有機溶劑如二氧六環、DMF或DMSO中反應；羧基樹脂，則通常加入適當的縮合劑如DCC或羧基二咪唑，使被保護氨基酸與樹脂形成共酯以完成氨基酸的固定；氨基樹脂或醯肼型樹脂，卻是加入適當的縮合劑如DCC後，通過保護氨基酸與樹脂之間形成的醯胺鍵來完成氨基酸的固定。
2．2氨基、羧基、側鏈的保護及脫除
要成功合成具有特定的氨基酸順序的多肽，需要對暫不參與形成醯胺鍵的氨基和羧基加以保護，同時對氨基酸側鏈上的活性基因也要保護，反應完成後再將保護基因除去。同液相合成一樣，固相合成中多採用烷氧羰基類型作為α氨基的保護基，因為這樣不易發生消旋。最早是用苄氧羰基，由於它需要較強的酸解條件才能脫除，所以後來改為叔丁氧羰基（BOC）保護，用TFA（三氟乙酸）脫保護，但不適用含有色氨酸等對酸不穩定的肽類的合成。1978年，chang Meienlofer和Atherton等人採用Carpino報道的Fmoc(9-芴甲氧羰基)作為α氨基保護基，Fmoc基對酸很穩定，但能用哌啶-CH2CL2或哌啶-DMF脫去，近年來，Fmoc合成法得到了廣泛的應用。 羧基通常用形成酯基的方法進行保護。甲酯和乙酯是逐步合成中保護羧基的常用方法，可通過皂化除去或轉變為肼以便用於片斷組合；叔丁酯在酸性條件下除去；苄酯常用催化氫化除去。 對於合成含有半胱氨酸、組氨酸、精氨酸等帶側鏈功能基的氨基酸的肽來說，為了避免由於側鏈功能團所帶來的副反應，一般也需要用適當的保護基將側鏈基團暫時保護起來。保護基的選擇既要保證側鏈基團不參與形成醯胺的反應，又要保證在肽合成過程中不受破壞，同時又要保證在最後肽鏈裂解時能被除去。如用三苯甲基保護半胱氨酸的S-，用酸或銀鹽、汞鹽除去；組氨酸的咪唑環用2,2,2-三氟-1-苄氧羰基和2,2,2-三氟-1-叔丁氧羰基乙基保護，可通過催化氫化或冷的三氟乙酸脫去。精氨酸用金剛烷氧羰基（Adoc）保護，用冷的三氟乙酸脫去。
2．3成肽反應
固相中的接肽反應原理與液相中的基本一致，將兩個相應的氨基被保護的及羧基被保護的氨基酸放在溶液內並不形成肽鍵，要形成醯胺鍵，經常用的手段是將羧基活化，變成混合酸酐、活潑酯、醯氯或用強的失去劑（如碳二亞氨）形成對稱酸酐等方法來形成醯胺鍵。其中選用DCC、HOBT或HOBT/DCC的對稱酸酐法、活化酯法接肽應用最廣。
2．4 裂解及合成肽鏈的純化 BOC法用TFA+HF裂解和脫側鏈保護基，FMOC法直接用TFA，有時根據條件不同，其它鹼、光解、氟離子和氫解等脫保護方法也被採用。合成肽鏈進一步的精製、分離與純化通常採用高效液相色譜、親和層析、毛細管電泳等。
3．固相合成的特點及存在的主要問題
固相合成法對於肽合成的顯著的優點：簡化並加速了多步驟的合成；因反應在一簡單反應器皿中便可進行，可避免因手工操作和物料重復轉移而產生的損失；固相載體共價相聯的肽鏈處於適宜的物理狀態，可通過快速的抽濾、洗滌未完成中間的純化，避免了液相肽合成中冗長的重結晶或分柱步驟，可避免中間體分離純化時大量的損失；使用過量反應物，迫使個別反應完全，以便最終產物得到高產率；增加溶劑化，減少中間的產物聚焦；固相載體上肽鏈和輕度交聯的聚合鏈緊密相混，彼此產生一種相互的溶劑效應，這對肽自聚集熱力學不利而對反應適宜。 固相合成的主要存在問題是固相載體上中間體雜肽無法分離，這樣造成最終產物的純度不如液相合成物，必需通過可靠的分離手段純化。
4．固相合成的研究發展前景
固相多肽合成已經有40年的歷史了，然而到現在，人們還只能合成一些較短的肽鏈，更談不上隨心所欲地合成蛋白質了，同時合成中的試劑毒性，昂貴費用，副產物等一直都是令人頭痛的問題，而在生物體內，核糖體上合成肽鏈的速度和產率都是驚人的，那麼，是否能從生物體合成蛋白質的原理上得到一些啟發，應用在固相多肽合成（樹脂）上，這是一個令人感興趣的問題，也許是今後多肽合成的發展。
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