離子交換樹脂的流動相

A. 簡述離子交換色譜法

離子交換色譜法(ion exchange chromatography,IEC)
離子色譜分析法出現在20世紀70年代，80年代迅速發展起來，以無機、特別是無機陰離子混合物為主要分析對象。
離子交換色譜利用被分離組分與固定相之間發生離子交換的能力差異來實現分離。離子交換色譜的固定相一般為離子交換樹脂，樹脂分子結構中存在許多可以電離的活性中心，待分離組分中的離子會與這些活性中心發生離子交換，形成離子交換平衡，從而在流動相與固定相之間形成分配。固定相的固有離子與待分離組分中的離子之間相互爭奪固定相中的離子交換中心，並隨著流動相的運動而運動，最終實現分離。
表達式
離子交換色譜的分配系數又叫做選擇系數，其表達式為：

K_s=\frac{[RX^+]}{[X^+]}

其中[RX + ]表示與離子交換樹脂活性中心結合的離子濃度，[X + ]表示游離於流動相中的離子濃度

分離原理
離子交換色譜（ion exchange chromatography，IEC）以離子交換樹脂作為固定相，樹脂上具有固定離子基團及可交換的離子基團。當流動相帶著組分電離生成的離子通過固定相時，組分離子與樹脂上可交換的離子基團進行可逆變換。根據組分離子對樹脂親合力不同而得到分離。

陽離子交換:

陰離子交換:

式中"－－"表示在固定相上，Kxy和Kzm是交換反應的平衡常數，Z+和X-代表被分析的組分離子。M+和Y-表示樹脂上可交換的離子團。

離子交換反應的平衡常數分別為：

陽離子交換：

陰離子交換：

平衡常數K值越大，表示組分的離子與離子交換樹脂的相互作用越強。由於不同的物質在溶劑中離解後，對離子交換中心具有不同的親合力，因此具有不同的平衡常數。親合力大的，在柱中的停留時間長，具有高的保留值。

固定相
離子交換色譜常用的固定相為離子交換樹脂。目前常用的離子交換樹脂分為三種形式，一是常見的純離子交換樹脂。第二種是玻璃珠等硬芯子表面塗一層樹脂薄層構成的表面層離子交換樹脂，第三種為大孔徑網路型樹脂。它們各有特點，例如第二種樹脂有很高的柱效，但它的柱容量不大；第三種樹脂適用於非水溶液中物質的分離，因為它們的孔徑和內表面積大，不需要用水溶脹，便可滿意地使用。

典型的離子交換樹脂是由苯乙烯和二乙烯基苯交聯共聚而成：

其中，二乙烯基苯起了交聯和加牢整個構型的作用，其含量決定了樹脂交聯度大小。交聯度一般控制在4％～16％范圍內，高度交聯的樹脂較硬而且脆，也較滲透，但選擇性較好。在基體網狀結構上引入各種不同酸鹼基團作為可交換的離於基團。

按結合的基團不同，離子交換樹脂可分為陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂。陽離子交換樹脂上具有與樣品中陽離子交換的基團。陽離子交換樹脂又可分為強酸性和弱酸性樹脂。強酸性陽離子交換樹脂所帶的基團為磷酸基（一），其中和有機聚合物牢固結合形成固定部分，是可流動的能為其他陽離子所交換的離子。

陰離子交換樹脂具有與樣品中陰離子交換的基團。陰離子交換樹脂也可分為強鹼性和弱鹼性樹脂。

陰離子交換樹脂屬強鹼性，它是由有機聚合物骨架和一季胺鹼基團所組成，它帶有正電荷。而與相反的是可以移動的部分，它能被其它陰離子所交換

流動相
離子交換色譜的流動相最常使用水緩沖溶液，有時也使用有機溶劑如甲醇，或乙醇同水緩沖溶液混合使用，以提供特殊的選擇性，並改善樣品的溶解度。

離子交換色譜所用的緩沖液，通常用下列化合物配製：鈉、鉀、被的檸檬酸鹽，磷酸鹽，甲酸鹽與其相應的酸混合成酸性緩沖液或氫氧化鈉混合成鹼性緩沖液等。

B. 高效液相色譜儀流動相選擇應該遵循什麼樣的原則

1．流動相的性質要求
一個理想的液相色譜流動相溶劑應具有低粘度、與檢測器兼容性好、易於得到純品和低毒性等特徵。
選擇流動相時應考慮以下幾個方面：

①流動相應不改變填料的任何性質。低交聯度的離子交換樹脂和排阻色譜填料有時遇到某些有機相會溶脹或收縮，從而改變色譜柱填床的性質。鹼性流動相不能用於硅膠柱系統。酸性流動相不能用於氧化鋁、氧化鎂等吸附劑的柱系統。

②純度。色譜柱的壽命與大量流動相通過有關，特別是當溶劑所含雜質在柱上積累時。

③必須與檢測器匹配。使用UV檢測器時，所用流動相在檢測波長下應沒有吸收，或吸收很小。當使用示差折光檢測器時，應選擇折光系數與樣品差別較大的溶劑作流動相，以提高靈敏度。

④粘度要低（應<2cp）。高粘度溶劑會影響溶質的擴散、傳質，降低柱效，還會使柱壓降增加，使分離時間延長。最好選擇沸點在100℃以下的流動相。

⑤對樣品的溶解度要適宜。如果溶解度欠佳，樣品會在柱頭沉澱，不但影響了純化分離，且會使柱子惡化。

⑥樣品易於回收。應選用揮發性溶劑。

2．流動相的pH值

採用反相色譜法分離弱酸（3≤pKa≤7）或弱鹼（7≤pKa≤8）樣品時，通過調節流動相的pH值，以抑制樣品組分的解離，增加組分在固定相上的保留，並改善峰形的技術稱為反相離子抑制技術。對於弱酸，流動相的pH值越小，組分的k值越大，當pH值遠遠小於弱酸的pKa值時，弱酸主要以分子形式存在；對弱鹼，情況相反。分析弱酸樣品時，通常在流動相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和1%醋酸溶液；分析弱鹼樣品時，通常在流動相中加入少量弱鹼，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和30mmol/L三乙胺溶液。

註：流動相中加入有機胺可以減弱鹼性溶質與殘余硅醇基的強相互作用，減輕或消除峰拖尾現象。所以在這種情況下有機胺（如三乙胺）又稱為減尾劑或除尾劑。

流動相選擇方法
1：由強到弱： 一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或緩沖溶液)進行試驗，這樣可以很快地得到分離結果，然後根據出峰情況調整有機溶劑(乙腈或甲醇)的比例。
2： 三倍規則 ：每減少10%的有機溶劑(甲醇或乙腈)的量，保留因子約增加3倍，此為三倍規則。這是一個聰明而又省力的辦法。調整的過程中，注意觀察各個峰的分離情況。
3： 粗調轉微調：當分離達到一定程度，應將有機溶劑10%的改變數調整為5%，並據此規則逐漸降低調整率，直至各組分的分離情況不再改變。

C. 液相色譜所用流動相使用時應注意哪些問題

1、流動相恢復到室溫後使用。流動相溫度與室溫相差時，流動相在恢復到室溫前，基線水平很難穩定，特別是發生漂移，也容易產生氣泡等現象。水與有機溶劑混合時，混合液變化大，往往會與室溫相差很大，務必注意。

2、做HPLC流動相的試劑應用HPLC級的、水應用二次蒸餾水，水相流動相需經常更換，防止長菌變質。使用去離子水、針劑水、純凈水（炊用）並不合適、尤其是做梯度洗脫時，水中的不純物會成為鬼峰，從而干擾分析結果。

3、流動相的pH值過高或過低，流動相使用純水，使用高濃度磷酸鹽緩沖溶液，使用離子對試劑等，均可能造成色譜柱填料被化學破壞，這種對色譜柱固定相及鍵合相的破壞通常是不可修復的。

4、用緩沖鹽做流動相時，在使用前和使用後都要用水清洗流路，絕對禁止將緩沖溶液留在流路中靜置或更長時間。

5、在更換兩種互不相容的流動相時，中間要用異丙醇溶液清洗過渡。例如：先用甲醇水做流動相，然後再用正己烷做流動相時，一定要先用異丙醇溶液沖洗甲醇水，然後用正己烷沖洗異丙醇，反之也是一樣。在更換流動相時還要考慮色譜柱是否更換。

D. 離子交換層析中流出物質順序是什麼

若用離子交換層析分離物質，以蛋白質為例，離子交換層析中，基質是由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。帶有正電荷的稱之陰離子交換樹脂；而帶有負電荷的稱之陽離子樹脂。離子交換層析同樣可以用於蛋白質的分離純化。

由於蛋白質也有等電點，當蛋白質處於不同的pH條件下，其帶電狀況也不同。陰離子交換基質結合帶有負電荷的蛋白質，所以這類蛋白質被留在柱子上，然後通過提高洗脫液中的鹽濃度等措施，將吸附在柱子上的蛋白質洗脫下來。結合較弱的蛋白質首先被洗脫下來。

反之陽離子交換基質結合帶有正電荷的蛋白質，結合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來。

(4)離子交換樹脂的流動相擴展閱讀：

對於離子交換纖維素要用流水洗去少量碎的不易沉澱的顆粒，以保證有較好的均勻度，對於已溶脹好的產品則不必經這一步驟。

溶脹的交換劑使用前要用稀酸或稀鹼處理，使之成為帶H+或OH-的交換劑型。陰離子交換劑常用「鹼-酸-鹼」處理，使最終轉為-OH-型或鹽型交換劑；對於陽離子交換劑則用「酸-鹼-酸」處理，使最終轉為-H-型交換劑。

梯度不要上升太快，要恰好使移動的區帶在快到柱末端時達到解吸狀態。目的物的過早解吸，會引起區帶擴散；而目的物的過晚解吸會使峰形過寬。

E. 陽離子交換色譜流動相不能重現是什麼原因

陽離子交換色譜流動線不能從事這個是原因是因為它里邊兒混動著，然後你需要給他重新連接一下。

F. 離子交換色譜法的原理、裝置及應用是什麼

一、原理：離子抄交換色譜（ion exchange chromatography，IEC）以離子交換樹脂作為固定相，樹脂上具有固定離子基團及可交換的離子基團。當流動相帶著組分電離生成的離子通過固定相時，組分離子與樹脂上可交換的離子基團進行可逆變換。根據組分離子對樹脂親合力不同而得到分離。

二、裝置：

1、分離柱：裝有離子交換樹脂，如陽離子交換樹脂、陰離子交換樹脂或螯合離子交換樹脂。

2、抑制柱和柱後衍生作用：常用的檢測器不僅能檢測樣品離子，而且也對移動相中的離子有響應，所以必須消除移動相離子的干擾。

3、檢測器：分為通用型和專用型。通用型檢測器對存在於檢測池中的所有離子都有響應。離子色譜中最常用的電導檢測器就是通用型的一種。

三、應用：

離子色譜主要用於測定各種離子的含量，特別適於測定水溶液中低濃度的陰離子，例如飲用水水質分析，高純水的離子分析，礦泉水、雨水、各種廢水和電廠水的分析，紙漿和漂白液的分析，食品分析，生物體液(尿和血等)中的離子測定，以及鋼鐵工業、環境保護等方面的應用。

G. 分配色譜，吸附色譜和離子交換色譜各是什麼它們的區別

吸附色譜
吸附色譜利用固定相吸附中對物質分子吸附能力的差異實現對混合物的分離，吸附色譜的色譜過程是流動相分子與物質分子競爭固定相吸附中心的過程
吸附色譜的分配系數表達式如下：
向左轉|向右轉
其中Xa表示被吸附於固定相活性中心的組分分子含量，Xm表示游離於流動相中的組分分子含量。分配系數對於計算待分離物質組分的保留時間有很重要的意義。
分配色譜
分配色譜利用固定相與流動相之間對待分離組分溶解度的差異來實現分離。分配色譜的固定相一般為液相的溶劑，依靠圖布、鍵合、吸附等手段分布於色譜柱或者擔體表面。分配色譜過程本質上是組分分子在固定相和流動相之間不斷達到溶解平衡的過程。
分配色譜的狹義分配系數表達式如下：
向左轉|向右轉
式中Cs代表組分分子在固定相液體中的溶解度，Cm代表組分分子在流動相中的溶解度。
離子交換色譜
離子交換色譜利用被分離組分與固定相之間發生離子交換的能力差異來實現分離。離子交換色譜的固定相一般為離子交換樹脂，樹脂分子結構中存在許多可以電離的活性中心，待分離組分中的離子會與這些活性中心發生離子交換，形成離子交換平衡，從而在流動相與固定相之間形成分配。固定相的固有離子與待分離組分中的離子之間相互爭奪固定相中的離子交換中心，並隨著流動相的運動而運動，最終實現分離。
離子交換色譜的分配系數又叫做選擇系數，其表達式為：
向左轉|向右轉

H. 在離子交換色譜操作中，怎樣選擇離子交換樹脂

需要考慮哪些因素？
顆粒尺寸：
樹脂一般是顆粒狀的固體，離子交換樹脂顆粒的尺寸是非常重要的一個因素，樹脂顆粒太大，反應速度就比較慢一些，樹脂顆粒小，反應的速度就快一些，但是樹脂的顆粒太小，液體通過時的阻力就會增大，所以一般樹脂的尺寸都是經過嚴格的篩選之後，才能夠確定，一般樹脂的顆粒尺寸在0.4-06mm左右。

交聯度：
樹脂中含交聯劑的重量稱為離子交換樹脂的交聯度，一般以百分比表示。樹脂的交聯度與樹脂的再生、密度、選擇性、耐用性都是息息相關的，交聯度越高，樹脂的再生就比較困難、密度就越高、選擇性更強、耐用性也好一些，交聯度越低則相反。一般樹脂的交聯度在4-14%之間，交聯度為7%左右的性能是比較理想的。

耐熱性：
樹脂無論是儲存還是使用，都需要考慮到溫度的問題，不同的樹脂因為使用的材質不同，具有不同的耐溫性，一般超純水設備樹脂可耐100℃或更高些的溫度，而H型應在100~120℃下使用。苯乙烯系陰樹脂、強鹼性陰離子交換樹脂的使用溫度不超過50~60℃，弱鹼性陰離子交換樹脂可在80℃下使用，丙烯酸系強鹼性陰樹脂的使用溫度應低於38℃。

交換容量：
離子交換樹脂的交換容量，簡單來說就是樹脂能夠交換多少離子，一般單位是meq/g(干樹脂)或 meq/mL(濕樹脂)，交換容量可以分為三種，分別是「總交換容量」、「工作交換容量」和「再生交換容量」

I. 簡述hplc級流動相使用前如何處理

一、基質（擔體）

HPLC填料可以是陶瓷性質的無機物基質，也可以是有機聚合物基質。無機物基質主要是硅膠和氧化鋁。無機物基質剛性大，在溶劑中不容易膨脹。有機聚合物基質主要有交聯苯乙烯-二乙烯苯、聚甲基丙烯酸酯。有機聚合物基質剛性小、易壓縮，溶劑或溶質容易滲入有機基質中，導致填料顆粒膨脹，結果減少傳質，最終使柱效降低。

1．基質的種類

1）硅膠

硅膠是HPLC填料中最普遍的基質。除具有高強度外，還提供一個表面，可以通過成熟的硅烷化技術鍵合上各種配基，製成反相、離子交換、疏水作用、親水作用或分子排阻色譜用填料。硅膠基質填料適用於廣泛的極性和非極性溶劑。缺點是在鹼性水溶性流動相中不穩定。通常，硅膠基質的填料推薦的常規分析pH范圍為2~8。

硅膠的主要性能參數有：

①平均粒度及其分布。
②平均孔徑及其分布。與比表面積成反比。
③比表面積。在液固吸附色譜法中，硅膠的比表面積越大，溶質的k值越大。
④含碳量及表面覆蓋度（率）。在反相色譜法中，含碳量越大，溶質的k值越大。
⑤含水量及表面活性。在液固吸附色譜法中，硅膠的含水量越小，其表面硅醇基的活性越強，對溶質的吸附作用越大。
⑥端基封尾。在反相色譜法中，主要影響鹼性化合物的峰形。
⑦幾何形狀。硅膠可分為無定形全多孔硅膠和球形全多孔硅膠，前者價格較便宜，缺點是渦流擴散項及柱滲透性差；後者無此缺點。
⑧硅膠純度。對稱柱填料使用高純度硅膠，柱效高，壽命長，鹼性成份不拖尾。

2）氧化鋁

具有與硅膠相同的良好物理性質，也能耐較大的pH范圍。它也是剛性的，不會在溶劑中收縮或膨脹。但與硅膠不同的是，氧化鋁鍵合相在水性流動相中不穩定。不過現在已經出現了在水相中穩定的氧化鋁鍵合相，並顯示出優秀的pH穩定性。

3）聚合物

以高交聯度的苯乙烯-二乙烯苯或聚甲基丙烯酸酯為基質的填料是用於普通壓力下的HPLC，它們的壓力限度比無機填料低。苯乙烯-二乙烯苯基質疏水性強。使用任何流動相，在整個pH范圍內穩定，可以用NaOH或強鹼來清洗色譜柱。甲基丙烯酸酯基質本質上比苯乙烯-二乙烯苯疏水性更強，但它可以通過適當的功能基修飾變成親水性的。這種基質不如苯乙烯-二乙烯苯那樣耐酸鹼，但也可以承受在pH13下反復沖洗。

所有聚合物基質在流動相發生變化時都會出現膨脹或收縮。用於HPLC的高交聯度聚合物填料，其膨脹和收縮要有限制。溶劑或小分子容易滲入聚合物基質中，因為小分子在聚合物基質中的傳質比在陶瓷性基質中慢，所以造成小分子在這種基質中柱效低。對於大分子像蛋白質或合成的高聚物，聚合物基質的效能比得上陶瓷性基質。因此，聚合物基質廣泛用於分離大分子物質。

2．基質的選擇

硅膠基質的填料被用於大部分的HPLC分析，尤其是小分子量的被分析物，聚合物填料用於大分子量的被分析物質，主要用來製成分子排阻和離子交換柱。

二、化學鍵合固定相

將有機官能團通過化學反應共價鍵合到硅膠表面的游離羥基上而形成的固定相稱為化學鍵合相。這類固定相的突出特點是耐溶劑沖洗，並且可以通過改變鍵合相有機官能團的類型來改變分離的選擇性。

1．鍵合相的性質

目前，化學鍵合相廣泛採用微粒多孔硅膠為基體，用烷烴二甲基氯硅烷或烷氧基硅烷與硅膠表面的游離硅醇基反應，形成Si-O-Si-C鍵形的單分子膜而製得。硅膠表面的硅醇基密度約為5個/nm2，由於空間位阻效應（不可能將較大的有機官能團鍵合到全部硅醇基上）和其它因素的影響，使得大約有40~50%的硅醇基未反應。

殘余的硅醇基對鍵合相的性能有很大影響，特別是對非極性鍵合相，它可以減小鍵合相表面的疏水性，對極性溶質（特別是鹼性化合物）產生次級化學吸附，從而使保留機制復雜化（使溶質在兩相間的平衡速度減慢，降低了鍵合相填料的穩定性。結果使鹼性組分的峰形拖尾）。為盡量減少殘余硅醇基，一般在鍵合反應後，要用三甲基氯硅烷(TMCS)等進行鈍化處理，稱封端（或稱封尾、封頂，end-capping），以提高鍵合相的穩定性。另一方面，也有些ODS填料是不封尾的，以使其與水系流動相有更好的"濕潤"性能。

由於不同生產廠家所用的硅膠、硅烷化試劑和反應條件不同，因此具有相同鍵合基團的鍵合相，其表面有機官能團的鍵合量往往差別很大，使其產品性能有很大的不同。鍵合相的鍵合量常用含碳量(C%)來表示，也可以用覆蓋度來表示。所謂覆蓋度是指參與反應的硅醇基數目占硅膠表面硅醇基總數的比例。

pH值對以硅膠為基質的鍵合相的穩定性有很大的影響，一般來說，硅膠鍵合相應在pH=2~8的介質中使用。

2．鍵合相的種類

化學鍵合相按鍵合官能團的極性分為極性和非極性鍵合相兩種。

常用的極性鍵合相主要有氰基(-CN)、氨基(-NH2)和二醇基(DIOL)鍵合相。極性鍵合相常用作正相色譜，混合物在極性鍵合相上的分離主要是基於極性鍵合基團與溶質分子間的氫鍵作用，極性強的組分保留值較大。極性鍵合相有時也可作反相色譜的固定相。

常用的非極性鍵合相主要有各種烷基(C1~C18)和苯基、苯甲基等，以C18應用最廣。非極性鍵合相的烷基鏈長對樣品容量、溶質的保留值和分離選擇性都有影響，一般來說，樣品容量隨烷基鏈長增加而增大，且長鏈烷基可使溶質的保留值增大，並常常可改善分離的選擇性；但短鏈烷基鍵合相具有較高的覆蓋度，分離極性化合物時可得到對稱性較好的色譜峰。苯基鍵合相與短鏈烷基鍵合相的性質相似。

另外C18柱穩定性較高，這是由於長的烷基鏈保護了硅膠基質的緣故，但C18基團空間體積較大，使有效孔徑變小，分離大分子化合物時柱效較低。

3．固定相的選擇

分離中等極性和極性較強的化合物可選擇極性鍵合相。氰基鍵合相對雙鍵異構體或含雙鍵數不等的環狀化合物的分離有較好的選擇性。氨基鍵合相具有較強的氫鍵結合能力，對某些多官能團化合物如甾體、強心甙等有較好的分離能力；氨基鍵合相上的氨基能與糖類分子中的羥基產生選擇性相互作用，故被廣泛用於糖類的分析，但它不能用於分離羰基化合物，如甾酮、還原糖等，因為它們之間會發生反應生成Schiff 鹼。二醇基鍵合相適用於分離有機酸、甾體和蛋白質。

分離非極性和極性較弱的化合物可選擇非極性鍵合相。利用特殊的反相色譜技術，例如反相離子抑制技術和反相離子對色譜法等，非極性鍵合相也可用於分離離子型或可離子化的化合物。ODS(octadecyl silane)是應用最為廣泛的非極性鍵合相，它對各種類型的化合物都有很強的適應能力。短鏈烷基鍵合相能用於極性化合物的分離，而苯基鍵合相適用於分離芳香化合物。
另外，美國葯典對色譜法規定較嚴，它規定了柱的長度，填料的種類和粒度，填料分類也較詳細，這樣使色譜圖易於重現；而中國葯典僅規定填料種類，未規定柱的長度和粒度，這使檢驗人員難於重現實驗，在某些情況下還浪費時間和試劑。
三、流動相

1．流動相的性質要求

一個理想的液相色譜流動相溶劑應具有低粘度、與檢測器兼容性好、易於得到純品和低毒性等特徵。

選好填料（固定相）後，強溶劑使溶質在填料表面的吸附減少，相應的容量因子k降低；而較弱的溶劑使溶質在填料表面吸附增加，相應的容量因子k升高。因此，k值是流動相組成的函數。塔板數N一般與流動相的粘度成反比。所以選擇流動相時應考慮以下幾個方面：

①流動相應不改變填料的任何性質。低交聯度的離子交換樹脂和排阻色譜填料有時遇到某些有機相會溶脹或收縮，從而改變色譜柱填床的性質。鹼性流動相不能用於硅膠柱系統。酸性流動相不能用於氧化鋁、氧化鎂等吸附劑的柱系統。
②純度。色譜柱的壽命與大量流動相通過有關，特別是當溶劑所含雜質在柱上積累時。
③必須與檢測器匹配。使用UV檢測器時，所用流動相在檢測波長下應沒有吸收，或吸收很小。當使用示差折光檢測器時，應選擇折光系數與樣品差別較大的溶劑作流動相，以提高靈敏度。
④粘度要低（應<2cp）。高粘度溶劑會影響溶質的擴散、傳質，降低柱效，還會使柱壓降增加，使分離時間延長。最好選擇沸點在100℃以下的流動相。
⑤對樣品的溶解度要適宜。如果溶解度欠佳，樣品會在柱頭沉澱，不但影響了純化分離，且會使柱子惡化。
⑥樣品易於回收。應選用揮發性溶劑。

2．流動相的選擇

在化學鍵合相色譜法中，溶劑的洗脫能力直接與它的極性相關。在正相色譜中，溶劑的強度隨極性的增強而增加；在反相色譜中，溶劑的強度隨極性的增強而減弱。
正相色譜的流動相通常採用烷烴加適量極性調整劑。

反相色譜的流動相通常以水作基礎溶劑，再加入一定量的能與水互溶的極性調整劑，如甲醇、乙腈、四氫呋喃等。極性調整劑的性質及其所佔比例對溶質的保留值和分離選擇性有顯著影響。一般情況下，甲醇-水系統已能滿足多數樣品的分離要求，且流動相粘度小、價格低，是反相色譜最常用的流動相。但Snyder則推薦採用乙腈-水系統做初始實驗，因為與甲醇相比，乙腈的溶劑強度較高且粘度較小，並可滿足在紫外185~205nm處檢測的要求，因此，綜合來看，乙腈-水系統要優於甲醇-水系統。

在分離含極性差別較大的多組分樣品時，為了使各組分均有合適的k值並分離良好，也需採用梯度洗脫技術。

反相色譜中，如果要在相同的時間內分離同一組樣品，甲醇/水作為沖洗劑時其沖洗強度配比與乙腈/水或四氫呋喃/水的沖洗強度配比有如下關系：

C乙腈＝0.32C 2甲醇＋0.57C甲醇
C四氫呋喃＝0.66C甲醇

C為不同有機溶劑與水混合的體積百分含量。100%甲醇的沖洗強度相當於89%的乙腈/水或66%的四氫呋喃/水的沖洗強度。

3．流動相的pH值

採用反相色譜法分離弱酸（3≤pKa≤7）或弱鹼（7≤pKa≤8）樣品時，通過調節流動相的pH值，以抑制樣品組分的解離，增加組分在固定相上的保留，並改善峰形的技術稱為反相離子抑制技術。對於弱酸，流動相的pH值越小，組分的k值越大，當pH值遠遠小於弱酸的pKa值時，弱酸主要以分子形式存在；對弱鹼，情況相反。分析弱酸樣品時，通常在流動相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和1%醋酸溶液；分析弱鹼樣品時，通常在流動相中加入少量弱鹼，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和30mmol/L三乙胺溶液。

註：流動相中加入有機胺可以減弱鹼性溶質與殘余硅醇基的強相互作用，減輕或消除峰拖尾現象。所以在這種情況下有機胺（如三乙胺）又稱為減尾劑或除尾劑。

4．流動相的脫氣

HPLC所用流動相必須預先脫氣，否則容易在系統內逸出氣泡，影響泵的工作。氣泡還會影響柱的分離效率，影響檢測器的靈敏度、基線穩定性，甚至使無法檢測。（雜訊增大，基線不穩，突然跳動）。此外，溶解在流動相中的氧還可能與樣品、流動相甚至固定相（如烷基胺）反應。溶解氣體還會引起溶劑pH的變化，對分離或分析結果帶來誤差。

溶解氧能與某些溶劑（如甲醇、四氫呋喃）形成有紫外吸收的絡合物，此絡合物會提高背景吸收（特別是在260nm以下），並導致檢測靈敏度的輕微降低，但更重要的是，會在梯度淋洗時造成基線漂移或形成鬼峰（假峰）。在熒光檢測中，溶解氧在一定條件下還會引起淬滅現象，特別是對芳香烴、脂肪醛、酮等。在某些情況下，熒光響應可降低達95%。在電化學檢測中（特別是還原電化學法），氧的影響更大。

除去流動相中的溶解氧將大大提高UV檢測器的性能，也將改善在一些熒光檢測應用中的靈敏度。常用的脫氣方法有：加熱煮沸、抽真空、超聲、吹氦等。對混合溶劑，若採用抽氣或煮沸法，則需要考慮低沸點溶劑揮發造成的組成變化。超聲脫氣比較好，10~20分鍾的超聲處理對許多有機溶劑或有機溶劑/水混合液的脫氣是足夠了（一般500ml溶液需超聲20~30min方可），此法不影響溶劑組成。超聲時應注意避免溶劑瓶與超聲槽底部或壁接觸，以免玻璃瓶破裂，容器內液面不要高出水面太多。

離線（系統外）脫氣法不能維持溶劑的脫氣狀態，在你停止脫氣後，氣體立即開始回到溶劑中。在1~4小時內，溶劑又將被環境氣體所飽和。

在線（系統內）脫氣法無此缺點。最常用的在線脫氣法為鼓泡，即在色譜操作前和進行時，將惰性氣體噴入溶劑中。嚴格來說，此方法不能將溶劑脫氣，它只是用一種低溶解度的惰性氣體（通常是氦）將空氣替換出來。此外還有在線脫氣機。

一般說來有機溶劑中的氣體易脫除，而水溶液中的氣體較頑固。在溶液中吹氦是相當有效的脫氣方法，這種連續脫氣法在電化學檢測時經常使用。但氦氣昂貴，難於普及。

5．流動相的濾過

所有溶劑使用前都必須經0.45µm（或0.22µm）濾過，以除去雜質微粒，色譜純試劑也不例外（除非在標簽上標明"已濾過"）。

用濾膜過濾時，特別要注意分清有機相（脂溶性）濾膜和水相（水溶性）濾膜。有機相濾膜一般用於過濾有機溶劑，過濾水溶液時流速低或濾不動。水相濾膜只能用於過濾水溶液，嚴禁用於有機溶劑，否則濾膜會被溶解！溶有濾膜的溶劑不得用於HPLC。對於混合流動相，可在混合前分別濾過，如需混合後濾過，首選有機相濾膜。現在已有混合型濾膜出售。

6．流動相的貯存

流動相一般貯存於玻璃、聚四氟乙烯或不銹鋼容器內，不能貯存在塑料容器中。因許多有機溶劑如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑劑，導致溶劑受污染。這種被污染的溶劑如用於HPLC系統，可能造成柱效降低。貯存容器一定要蓋嚴，防止溶劑揮發引起組成變化，也防止氧和二氧化碳溶入流動相。

磷酸鹽、乙酸鹽緩沖液很易長霉，應盡量新鮮配製使用，不要貯存。如確需貯存，可在冰箱內冷藏，並在3天內使用，用前應重新濾過。容器應定期清洗，特別是盛水、緩沖液和混合溶液的瓶子，以除去底部的雜質沉澱和可能生長的微生物。因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子無此現象。

7．鹵代有機溶劑應特別注意的問題

鹵代溶劑可能含有微量的酸性雜質，能與HPLC系統中的不銹鋼反應。鹵代溶劑與水的混合物比較容易分解，不能存放太久。鹵代溶劑（如CCl4、CHCl3等）與各種醚類（如乙醚、二異丙醚、四氫呋喃等）混合後，可能會反應生成一些對不銹鋼有較大腐蝕性的產物，這種混合流動相應盡量不採用，或新鮮配製。此外，鹵代溶劑（如CH2Cl2）與一些反應性有機溶劑（如乙腈）混合靜置時，還會產生結晶。總之，鹵代溶劑最好新鮮配製使用。如果是和乾燥的飽和烷烴混合，則不會產生類似問題。

8．HPLC用水

HPLC應用中要求超純水，如檢測器基線的校正和反相柱的洗脫。

進行HPLC、GC、電泳和熒光分析，或在涉及組織培養時，沒有有機物污染是非常重要的。測高錳酸鉀顏色保留時間的定性方法反應慢，對很低水平的有機物（對HPLC可能還是太高了）不夠靈敏，特別是不能定量。總有機碳(TOC)分析儀（把有機物氧化成CO2，測游離的CO2）常用於I類（NCCLS）水中低濃度有機物的測定。

I類水標准：
NCCLS ASTM
電阻率，MΩ•cm，25℃，最小 10.0 18.0
硅酸鹽，mg/L，最大 0.05 0.003
微粒，µm濾器 0.22 0.2
微生物，CFU/ml 10 分三檔
美國葯典24版（2000年）要求TOC＜0.5 mg/L（用標准蔗糖溶液1.19 mg/L），電導率在室溫pH 6時≤2.4 µS/cm（即≥0.42 MΩ•cm）。HPLC級水增加吸收特性：在1cm池中，用超純水作空白，在190nm、200nm和250~400nm的吸收度分別不得過0.01、0.01和0.05。增加不揮發物，≤3ppm（中國葯典純水≤10ppm）。

J. 離子交換色譜法的分離原理

離子交換色譜（ion exchange chromatography，IEC）以離子交換樹脂作為固定相，樹脂上具有固定離回子基團及可交換的答離子基團。當流動相帶著組分電離生成的離子通過固定相時，組分離子與樹脂上可交換的離子基團進行可逆變換。根據組分離子對樹脂親合力不同而得到分離。
陽離子交換:
陰離子交換:
式中"－－"表示在固定相上，Kxy和Kzm是交換反應的平衡常數，Z+和X-代表被分析的組分離子。M+和Y-表示樹脂上可交換的離子團。
離子交換反應的平衡常數分別為：
陽離子交換：
陰離子交換：
平衡常數K值越大，表示組分的離子與離子交換樹脂的相互作用越強。由於不同的物質在溶劑中離解後，對離子交換中心具有不同的親合力，因此具有不同的平衡常數。親合力大的，在柱中的停留時間長，具有高的保留值。