糖苷水相纯化技术

① 怎样从酵母中提取蔗糖酶

菌体自溶法/机械破碎法/超声波破碎法

② 双水相萃取技术的应用

双水相萃取技术已广泛应用于生物化学、细胞生物学、生物化工和食品化工等领域，回并取得了答许多成功的范例，主要是分离蛋白质 ，酶，病毒，脊髓病毒和线病毒的纯化，核酸，DNA的分离，干扰素，细胞组织，抗生素，多糖，色素，抗体等。
此外双水相还可用于稀有金属/贵金属分离，传统的稀有金属/贵金属溶剂萃取方法存在着溶剂污染环境，对人体有害，运行成本高，工艺复杂等缺点。双水相技术萃取技术引入到该领域，无疑是金属分离的一种新技术。
目前，用此法来提纯的酶已达数十种，其分离过程也达到相当规模，I-Horng Pan等人利用PEG1500/ NaH2PO4体系从Trichoderma koningii发酵液中分离纯化β-木糖苷酶，该酶主要分配在下相，下相酶活回收率96.3%，纯化倍数33；

③ 求实验室胡萝卜多糖提取方案，要具体的条件步骤

由于胡萝卜主要的多糖类型为果胶，因此根据果胶的特殊性质可以依次采用水提、CDTA(或
EDTA)、弱碱螯合等方式从胡萝卜中提取，分别得到水溶性果胶、CDTA
螯合果胶和弱碱螯合果胶等不同性质的多糖，同时可采用超声、微波、酶解等方法辅助提取，提高多糖得率。
不同提取方法获得胡萝卜多糖的相对分子质量存在一定差异，一般都小于50万， 有少数报道胡萝卜多糖相对分子质量超过了50 万。

④ 基因组dna提取的原理

1.溶液I—溶菌液：
溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。
葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。
EDTA：
(1)螯合Mg2+、Ca2+等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用(DNase作用时需要一定的金属离子作辅基);
(2)EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。
2.溶液II-NaOH-SDS液：NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。但当pH>12或pH<3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。 在溶液II中的NaOH浓度为0.2mo1/L，加抽提液时，该系统的pH就高达12.6， 因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。
SDS：
SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：
(1)溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。
(2)解聚细胞中的核蛋白。
(3)SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R+-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。 但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中 (用RNase去除RNA时)受到干扰。
3. 溶液III--3mol/L NaAc(pH4.8)溶液：
NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8，必须加入大量的冰醋酸。 所以该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液。用pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提液，调回pH至中性， 使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的3mol/L NaAc有利于变性的大分子染色体DNA、 RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合.

⑤ 虎眼万年青多糖的分离纯化及性质研究

这是我转载的，不知对你有没有帮助
1 前言

多糖是存在于自然界的醛糖和（或）酮糖通过糖苷键连接在一起的聚合物。多糖是一切有生命的有机体必不可少的成分，它与维持生命的种种生理机能有着密切的联系。近年来，植物、海洋生物及菌类等来源的多糖已作为有生物活性的天然产物中的一个重要类型出现，各种多糖所具有的抗肿瘤、免疫、抗凝血、降血糖和抗病毒活性已相继被发现。多糖具有复杂的结构，这是因为它具有许多不同单糖残基、不同的连接位置和不同类型的糖苷键，能形成具有不同的构象、不同的相对分子质量，以及链内和链间氢键的二级结构。

对多糖的研究，最早是在20世纪40年代，但其作为广谱免疫促进剂而引起人们的极大重视则是在60年代,经过40余年的不断发展,人们对多糖这一类重要生命物质产生了新的认识, 使这一学科成为目前生命科学中研究最活跃的领域之一[1]。越来越多的研究发现多糖对人体具有极大的利用价值,按其来源可分为三类: 动物多糖、植物多糖和微生物多糖。其中植物多糖如人参、黄芩、刺五加、芦荟等所含多糖均具有显著的药用功效, 如免疫增强作用, 抗肿瘤作用,抗辐射用等。据文献[2]报道,已有近100种植物的多糖被分离提取出来。这类多糖来源广泛且没有细胞毒性, 应用于生物体毒副作用小,因此对植物多糖的研究已成为医药界的热门领域。

多糖(polysaccharides,PS)又称多聚糖。其存在于动物、高等植物、微生物(细菌和真菌)及海藻等机体中。多糖具有复杂、多方面的生物活性和功能,可作为广谱免疫促进剂，具有免疫调节功能，如多糖能治疗风湿病、慢性病毒性肝炎、癌症等免疫系统疾病，甚至能抗 AIDS 病毒[3]；还具有抗感染、抗放射、抗凝血、降血糖、降血脂作用；促进核酸与蛋白质的生物合成作用；能控制细胞分裂和分化，调节细胞的生长与衰老，而且多糖作为药物其毒性极小，因而多糖的研究已引起人们的极大兴趣。多糖分子量在数万或数百万，植物多糖包括淀粉、纤维素、葡聚糖(如香菇多糖)、果聚糖树胶、粘液质、粘胶脂(如琼脂)等，其中有些免疫激活多糖是癌细胞抑制剂，但特异性较差。20 世纪80 年代，德国的Franz G 等研究组最为活跃，证明许多植物多糖、真菌多糖有抗肿瘤活性。这包括已用于临床的香菇多糖(Lentinan)、云芝多糖(Ps-K，Krestin)、猪苓多糖等。

多糖在医药上还是一种很好的佐剂。近年来又发现多糖的糖链在分子生物学中具有决定性作用。此外它还能控制细胞的分裂和分化，调节细胞的生长和衰老。多糖在食品工业、发酵工业及石油工业上也有着广泛的应用。越来越多的植物多糖成分获得了新的开发，其在食品领域中的应用价值得到了发展和证实，为食品工业的快速发展注入了新鲜的活力。近年来，随着人们对多糖及糖结合物在生命科学中作用的认识，以及多糖研究技术的迅速发展和改进，多糖研究异军突起，国际科学界视多糖的研究为生命科学的前沿领域，甚至提出21世纪是多糖的世纪[4]。许多植物多糖具有免疫调节活性，能够增强机体巨噬细胞、淋巴细胞等免疫系统的功能及激活或促进抗体、补体的生成和干扰素的诱生；多糖也可以用于糖尿病的防治，促进胃溃疡愈合和修复，具有抗辐射、降血脂等多种功效。因此，多糖及其衍生物作为生物效应调节剂而成为近年来天然药物的研究热点之一。

因此，对多糖的分离纯化研究具有重要的现实意义。本篇论文主要研究醇沉分级、柱层析等。

2实验部分

2.1主要试剂与仪器

Sephadex DEAE 系列，Pharmacia公司

唾液淀粉酶，美国Sigma公司

SDS凝胶

Coomassie Blue试剂

β-葡萄糖基-Yarive试剂

其它试剂均为分析纯

PD 10 柱， Amersham harmacia Biotech 公司

自动流分收集器

RE52CS型旋转蒸发仪，上海医械专机厂

6010型紫外-可见分光光度计，Angel上海分析仪器公司

2690型高效液相色谱仪，美国Waters公司
2.2 实验方法fficeffice" />

2.2.1 除淀粉

将虎眼万年青粗多糖配成20%水溶液，经唾液淀粉酶37℃酶解除淀粉。

2.2.2 除蛋白

Sevage法除蛋白质：样品水溶液按4：1体积比加入氯仿、正丁醇（比例5：1），离心法（10000rpm、20min）除去形成凝胶状的蛋白质，反复多次（3次）至蛋白质除尽为止。除蛋白的效果用茚三酮反应检测，结果呈阴性（或双缩脲试验）；同时在200～280 nm处测定除蛋白后样品的紫外吸收曲线来检测效果，除掉蛋白质的多糖溶液在260～280nm的紫外吸收峰消失，说明多糖不含有蛋白。

2.2.3 除盐

将以上处理液采用半透膜，通过逆向流水透析除去低聚糖等小分子杂质，用蒸馏水透析48h。

2.2.4 醇沉分级

粗多糖15g+250mlH2O加热溶解，冷却，加入40％乙醇沉淀，搅拌，放置，抽滤，得沉淀（OC-1），用40％的乙醇共沉淀3次，合并滤液，浓缩。

取上浓缩液用60％乙醇沉淀，搅拌溶解，放置，抽滤，得沉淀（OC-2），滤液再用60％的乙醇共沉淀3次，合并沉淀。得滤液（60％醇溶液）（OC-3）。

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2.2.5柱分离fficeffice" />

60％乙醇沉淀（OC-2）溶于热水后与Sephadex DEAE树脂在一个烧杯中混合。平衡后，将树脂置于分液漏斗中并用0.5mol/L NH4HCO3溶液洗涤，分成两个组分：0.5mol/L NH4HCO3溶液洗脱液（OC-2－1）和结合在树脂上的组分（OC-2－2）。

0.5mol/L NH4HCO3溶液洗脱液（OC-2－1）蒸干后溶解在水中，上DEAE柱（4.5×12.0），然后用0.2mol/L NH4HCO3溶液等度洗脱，测定各洗脱液的OD值，用收集管数对OD值绘制洗脱曲线。将同一峰的组分合并，产生7个组分：OC-2－1－a(未结合部分)，OC-2－1－b, OC-2－1－c, OC-2－1－d, OC-2－1－e, OC-2－1－f(1mol/L NH4HCO3洗脱液), OC-2－1－g(1 mol/L乙酸钠洗脱液)。

上述不同组分用UV分光光度计在215和280nm波长下测定吸光度OD值。

减压60℃以下将各组分蒸干，然后用PD 10柱（葡聚糖凝胶层析柱Sephadex G-25M）除去盐和小分子。

用60％醇沉部分热水溶解上DEAE树脂柱，用不同浓度的NH4HCO3：0.2M、0.25M、0.4M、0.5M、1.0M

⑥ β-葡聚糖酶纯化、性质及编码基因

10.2.2.1 β-葡聚糖酶的纯化和酶学性质

葡聚糖酶按照水解支链的类型分为a-葡聚糖酶或β-葡聚糖酶。a-葡聚糖酶或β-葡聚糖酶按照作用的糖苷键类型的不同，又可分为β（或a）-1，2葡聚糖酶，β（或a）-1，3葡聚糖酶，β（或a）-1，4葡聚糖酶和β（或a）-1，6葡聚糖酶。β-葡聚糖酶属于水解酶类，按照水解的作用方式（水解发生在胞外或是胞内）可以分为内切β-葡聚糖酶和外切β-葡聚糖酶两种类型。β-葡聚糖酶活性能力是根据水解最后的产物是单聚体还是二聚体而定义的。内切β-葡聚糖酶的活性通常比外切β-葡聚糖酶的活性要高一些，并且内切β-葡聚糖酶形成的低聚糖要多于外切β-葡聚糖酶。对β-葡聚糖酶尤其是β-1，3葡聚糖酶有较多的文献报道，β-1，6葡聚糖酶在微生物中很少被发现。大部分的外切葡聚糖酶表现有β-1，3葡聚糖酶和β-1，6葡聚糖酶的活性（Yamamoto et al.，1975；Vazquez de Aldana et al.，1991）。

木霉和粘帚霉的β-葡聚糖酶包括内切β-葡聚糖酶和外切β-葡聚糖酶。由于每种酶都有不同的成分、性质和Mr值，阻碍了这些酶之间的协同作用和调节作用（表10.2）。因为酶所含有的不同成分是来源于不同的菌株，所以不能确定这些不同的酶是不同基因的产物还是基因在翻译之后修饰的产物。因为产酶条件的不同，所以估算Mr值也有很多不同的方法。试验显示哈茨木霉CECT内切β-1，3葡聚糖酶与内切β-1，6葡聚糖酶的抗体与其他木霉菌株产生的β-葡聚糖酶会发生凝集作用（Rey et al.，2001），表明木霉中至少存在这两种酶。不同的β-葡聚糖酶编码基因的分离是确定木霉产生多少种β-葡聚糖酶的前提条件。

大部分研究采用色谱分析技术来提纯β-葡聚糖酶。Dubordieu等（1985）从哈茨木霉的商品化酶制剂中分离到两个外切β-1，3葡聚糖酶、1个内切β-1，6葡聚糖酶和1个β-葡聚糖酶单体。在这两个外切β-1，3葡聚糖酶中，一个酶的酶活性主要是由分子量大小为40kDa的蛋白构成的，此酶能降解灰霉病的β-1，3 葡聚糖和β-1，6葡聚糖。利用色谱分析法也从钩状木霉粗提物中分馏到了两种酶，一种是淀粉葡萄糖苷酶，无葡聚糖酶活性，一种是β-葡聚糖酶，没有淀粉葡萄糖苷酶活性。β-葡聚糖酶是由两个外切β-1，3葡聚糖酶和一个内切β-1，3葡聚糖酶组成的，它们的等电点pI分别为5.25，4.95和4.20（Thomas et al.，1983）。1977年，Bielecki和Galas从钩状木霉的另一个商品化制剂（名叫“Onozuka”）中分离纯化出两个β-1，3葡聚糖酶：一个是酸性但没有裂解细胞壁活性的水解海带多糖（β-1，3 葡聚糖），另一个对酿酒酵母有细胞壁裂解活性（Bielecki et al.，1977）。De Vies和Wessels（1973）从一株寄生在真菌中的绿色木霉里分离纯化出一种外切β-1，3葡聚糖酶，但是文章里仅仅描述了这个酶产生原生质体的能力。Tang-arone等（1989）比较了双孢菇糖提取物里长枝木霉产生的两种不同的β-葡聚糖酶。研究人员将从钩状木霉中分离的海带多糖稀释80倍后，发现其Km值低于担子菌细胞壁产生的β-葡聚糖酶的Km值，认为海带多糖中葡聚糖酶的作用影响器官的形成（Griffin，1994）。

近年来研究最多的是哈茨木霉CECT2413在真菌寄生物中产生的β-葡聚糖酶。大部分研究是采用等电法从哈茨木霉中分离一种基本同工酶和至少三种酸性同工酶（De la Cruz et al.，1995b）。通常说的β-1，3葡聚糖酶BGN13.1是以石耳多糖为介质采用吸附法纯化得到的纯物质。BGN13.1的分子量是78kDa且不能被糖化。这种酶在酿酒酵母细胞壁和海带多糖细胞壁中表现出最大的酶活性（海带多糖的Km值是3.3mg/mL）。这个酶属于内切β-1，3葡聚糖酶。BGN13.1 这个酶只对木霉具有专一性，因为抗血清反应表明：这个酶与从真菌和植物中提取的β-葡聚糖酶没有发生交叉反应。同样的，这个酶与从哈茨木霉中提取的β-1，3葡聚糖酶也不发生抗血清反应。哈茨木霉CECT2413至少产生两种内切 β-1，6 葡聚糖酶，纯化后大小分别为51kDa和43kDa（De la Cruz et al.，1995b）。还有研究将一些木霉（绿色木霉、长枝木霉、里氏木霉、康宁木霉、绿木霉）的培养物采用Western进行杂交，杂交结果表明这些木霉在相同条件下都产生BGN16.2（Rey et al.，2001）。

从哈茨木霉培养物上清液中发现的多种葡聚糖酶具有不同的催化活性、分子量和基因特性。但是对这些酶是由单基因调控还是由多基因调控目前仍不确定。Noronha等（1996）发现了另一株哈茨木霉在寄生真菌细胞壁或在几丁质平板上培养时均产生β-1，3葡聚糖酶。从这株哈茨木霉中纯化到一个酸性的内切β-1，3葡聚糖酶，分子量是36kDa，对海带多糖有水解活性。其他研究者描述哈茨木霉能产生两个分子量为32kDa和78kDa的外切β-1，3葡聚糖酶（Kitamoto et al.，1993；Lorito et al.，1994），也有人从一株里氏木霉（Bamforth，1980）中发现了一个外切β-1，3 葡聚糖酶，分子量为70kDa。从哈茨木霉和里氏木霉中发现的这些β-1，3葡聚糖酶大多是外切酶，水解通常发生在β-1，3位置，很少发生在β-1，6位置。从哈茨木霉CECT2413 中克隆到两个葡聚糖酶基因；一个是内切β-1，3葡聚糖酶，基因编码的蛋白质大小为78kDa（表10.2）；另一个是内切β-1，6葡聚糖酶，基因编码的蛋白质大小为43kDa。β-1，3葡聚糖酶基因的克隆表明了木霉菌株CECT2413主要具有β-1，3葡聚糖酶活性。该基因的克隆通过检测纯化蛋白的氨基酸序列得到。Southern杂交表明哈茨木霉β-1，3葡聚糖酶基因都是bgn13.1的单拷贝，哈茨木霉基因所编码的蛋白由728个氨基酸组成，优于N端的34个早前体氨基酸序列，该蛋白序列被一个KEX2肽酶分开，然后终止于KR（De la Cruz et al.，1995b）。在酵母里表达时，这个早前体氨基酸序列才被合成和分泌（Lora et al.，1995）。将早前体氨基酸序列和其他的β-葡聚糖酶进行氨基酸序列同源性比较，结果发现原先假定的活性部位能够识别谷氨酸。但是没有证据表明这个连接酶的分离同纤维素酶和葡聚糖酶一样。在烟草Ⅰ类几丁质酶中，带有半胱氨酸的N末端对几丁质的连接位点很重要，N末端的侧链是9～10 bp长度的非完全正向重复序列。以上表明这些区域来自一个普通的原始基因且是经过转化得到的（Shinshi et al.，1990）。通过放线菌的水平基因交换法明确了黄色粘球菌基因的结合位点和催化位点，这一方法被证明可行（Quillet，1995）。一些葡聚糖酶结合位点的转座源可以解释在一些菌中葡聚糖酶基因缺失的原因，例如木霉中β-葡聚糖酶基因的缺失。

将bgn13.1基因的序列与a或β-葡聚糖酶的基因序列进行同源性比较，结果发现同源性很低。因此确定这个基因编码的蛋白代表了一类新的β-1，3葡聚糖酶。来源于细菌、酵母、丝状真菌和植物的bgnl3.1线性序列的保守区域不同于其他来源的bgn13.1（De la Cruz et al.，1995b）。但是用玉米叶斑病的β-1，3葡聚糖酶基因就能检测到限制性同源性。这也可以从60余个葡聚糖酶基因的系统发育树上看出限制性同源性。从一些文献中也可以看出由 bgn13.1 形成的外群体和其他的 β-葡聚糖酶编码基因（Barnett et al.，1991）或β-1，6葡聚糖酶编码基因（De la Cruz et al.，1995b）在亲缘关系上比较远。但是由bgn13.1形成的外群体和木霉纤维素酶的亲缘关系比较近（表10.1）。

表10.2 从木霉中纯化的葡聚糖酶性质

注：a为mg/mL；b为μmol葡萄糖/（min.mg蛋白质）；ND为未描述；Gn为葡萄糖链的长度。

哈茨木霉CECT 2413的胰蛋白酶纯化后，根据其氨基酸序列设计兼并引物克隆了β-1，6葡聚糖酶的编码基因。相反的，对哈茨木霉bgn13.1基因，Southern 杂交分析的结果表明存在3个相同的基因拷贝（Lora et al.，1995）。蛋白序列分析表明来自酿酒酵母（Muthukumar et al.，1993；San Segundo et al.，1993）的EXG1（分布在耐热分生孢子里的外切β-1，3葡聚糖酶）和念珠菌的 SPR1（外切 β-1，3葡聚糖酶）有部分同源性（Chambers et al.，1993）。检测其蛋白序列的保守区域，发现外切葡聚糖酶催化区域的来源和内切β-葡聚糖酶的来源一样，且推测蛋白序列中含有糖基化基团。但是比较经En-doH处理后的蛋白Mr值和经 SDS-PAGE电泳后的蛋白迁移带值，发现从哈茨木霉CECT2413中纯化的第二个内切β-1，6葡聚糖酶内切肽序列几乎没有糖基化基团（De la Cruz et al.，1995a）。高雯等（2008）在哈茨木霉LTR-2中克隆出了内切β-1，3葡聚糖酶基因glu。该基因由2289个核苷酸残基组成，含有一个开放阅读框架，可以编码762个氨基酸，翻译后的氨基酸序列含有两个 β-1，3葡聚糖酶的保守区 RVVYIPPGTY和AASQNKVAYF。该基因与已发表的木霉β-1，3葡聚糖酶基因有较高的同源性，其中与哈茨木霉bgn3.1和绿木霉bgn13.1的同源性均达到93%以上。该序列已经提交GenBank，登录号为EF176582。表10.3列出了目前已克隆的木霉菌葡聚糖酶基因。

10.2.2.2 β-葡聚糖酶的调控和功能

和其他的一些丝状真菌一样（Griffin，1994），木霉和粘帚霉（De la Cruz et al.，1993）也是通过诱导和代谢产生β-葡聚糖酶。问题是像β-1，3葡聚糖这样的大分子是如何被催化和诱导的，答案仍然是未知的。人们根据生化和分子生物学方法对纤维素系统中酶的诱导和催化进行了推测，这两种方法一直认为是附着分生孢子的外切葡聚糖酶首先攻击了β-1，3葡聚糖分子（Kubicek et al.，1987 a；Kubicek et al.，1993）。菌丝体释放的二糖进一步促进了葡聚糖酶的生物合成。生长在不同碳源中的绿木霉或生长在寄主细胞壁中的粘绿木霉的培养基上清液中都有β-葡聚糖酶活性、几丁质酶活性、脂肪酶活性和蛋白酶活性。几丁质也能诱导长枝木霉（Tangarone et al.，1989）和玉米叶斑病菌（Schaeffer et al.，1994）产生β-1，3葡聚糖酶。

在自然界中真菌细胞壁中的几丁质酶和葡聚糖酶经常同时产生，同时诱导几丁质酶和葡聚糖酶的底物，而单个酶单独出现的情况并不多见（Lorito et al.，1994；表10.4）。酶对底物的相对活性是多种多样的，但是β-葡聚糖酶的最高活性是在寄主细胞壁中生长时产生的（Van Tilbura et al.，1993）。培养了8d的样品做SDS-PAGE电泳，分析电泳结果表明胞外蛋白的出现原因是诱导机制，蛋白的失活、降解和所检测到的酶活都是由于不同活性的酶在不同的作用时间诱导的结果（Van Tilbura et al.，1993）。在另外一些真菌中，酶失活的机理是由于内源蛋白的合成导致蛋白酶解和糖组成的转移（Friebi et al.，1975；Santos et al.，1978b）。不同的酶被不同的真菌细胞壁诱导后被发现和木霉的寄生能力相关（Sivan et al.，1989）。然而Ridout等（1986）发现生长在离体细胞壁中的蛋白属性不同于在植物病原真菌产生拮抗作用时产生的蛋白。

表10.3 已克隆的木霉菌葡聚糖酶基因

注：NCBI表示此行为从该网站获取数据。

表10.4 哈茨木霉CECT2413在不同碳源培养基上培养时产生的水解酶活性

注：C.W.为细胞壁；B.c为灰葡萄孢菌；P.c为马铃薯晚疫病；R.s为立枯丝核菌；T.h为哈茨木霉。

（De la Cruz，et al.，1993）

对一些重要的β-葡聚糖酶已经研究的很详细。De la Cruz等（1993，1995b）发现哈茨木酶CECT2413在不同的碳源上被几丁质、黑曲霉多糖（a-1，3和a-1，4葡聚糖）、石耳多糖（β-1，6葡聚糖）、真菌细胞壁、葡萄糖胁迫等条件诱导以后能产生外切β-1，3葡聚糖酶和外切β-1，6葡聚糖酶（表10.4）。无论是RNA干扰还是蛋白质合成抑制酶的诱导，都离不开酶合成中的表达和调控。在很多菌株中（长枝木霉、绿色木霉、康宁木霉、里氏木霉和粘绿木霉）观察到酶相似的表达和调控。在大多数情况下，当有2%葡萄糖存在的条件下一般能观察到β-葡聚糖酶的活性（Rey et al.，2001）（表10.5）。

表10.5 在不同碳源条件下木霉产生的β-1，6葡聚糖酶的活性

注：Bot.为灰霉；P.spp为青霉；P.c.为马铃薯晚疫病；S.c.为酿酒酵母；C.W.为细胞壁。

（Rey et al.，2001）

然而，当不同的β-葡聚糖酶同工酶被单独研究的时候就获得了一组不同的调控模式（De la Cruz et al.，1995b）。在几丁质、海带多糖、石耳多糖存在的条件下检测到四个同工酶，它们都是在真菌细胞壁胞外产生的内切β-1，3葡聚糖酶。BGN13.1的转录是由内切β-1，3葡聚糖酶基因编码得到，而并非葡萄糖胁迫产生。在有2%葡萄糖存在的条件下能检测到BGN13.1的活性（表10.6）。当在真菌细胞壁中生长时，虽然这个内切β-1，3葡聚糖酶单独存在时不能产生透明水解圈，但是它能阻止病原真菌和其他的水解酶相结合。因为这个内切β-1，3葡聚糖酶的特殊诱导作用和裂解活性，这个酶被认为是木霉对抗一些病原真菌的拮抗酶，然而它在腐生植物里的作用还没有被发现（De la Cruz et al.，1995b）。

表10.6 哈茨木霉CECT2413产生的两种β-葡聚糖酶和两种几丁质酶在不同底物条件下的不同调控作用

注：N 为northern杂交实验；W为western杂交实验；A为凝胶活性；R.s.为R.solani；S.c.为S.cerevisiae；C.W.为细胞壁；ND为未做。

（De la Cruz et al.，1995b；Gelgado et al.，2000；Gelgado et al.，2002）

在有葡萄糖存在的条件下，哈茨木霉CECT2413的内切β-1，6 葡聚糖酶编码基因可诱导细胞壁产生聚合物，从这个内切β-1，6葡聚糖酶的8000个基因里仅获得了一个cD-NA基因，且mRNA的翻译水平很低，说明该基因的表达很微弱（表10.6）。当内切β-1，6葡聚糖II浓度较高时（当浓度为25mg/mL时，抑制率为70%～80%），将它放在酵母细胞壁中培养，此酶能产生透明圈，而且这个酶能阻止其他真菌与其他裂解酶的结合（De la Cruz et al.，1995a）。

β-葡聚糖酶的调控规则如上所述，一些学者也研究了β-葡聚糖酶的构成。Del Rey等（1979）将绿木霉在葡萄糖培养基上培养，采用破壁提取法获得了β-1，3葡聚糖酶和β-1，6葡聚糖酶。如果不破除细胞壁，要么不能产生β-葡聚糖酶，要么就是β-1，6葡聚糖酶的产量很低。作者认为这种现象表明这些β-1，6 葡聚糖酶和形态基因有关。Kubicek（1982）也支持上述观点，他描述了拟康氏木霉和黄绿木霉β-1，3葡聚糖酶的构成。β-1，3葡聚糖酶的活性和培养基β-葡聚糖酶的释放量有关。这表明β-1，3葡聚糖酶的形成与β-葡萄糖和β-葡聚糖酶之间的转换有关。然而，在拟康氏木霉中和细胞壁结合的β-葡聚糖酶活性主要是由3种同工酶决定的，但是这三种酶的作用是相同的还是各不相同的至今尚不明确（Kubicek，1982）。在青霉菌中，与细胞壁结合的β-1，3葡聚糖酶Ⅱ和Ⅲ的作用是促进细胞壁的生长和延伸，而β-1，3葡聚糖酶I的作用是促进葡聚糖的流动和分生孢子的形成（Santos et al.，1978a，b）。综上所述，酶与细胞壁的结合对形态基因的建成并非是必需的。里氏木霉细胞壁和血浆膜的最外层是β-葡聚糖酶，但是它的作用是水解纤维素（Cummings et al.，1996）。

真菌的β-葡聚糖酶有各种不同的作用，包括营养（表10.7）和抑真菌作用。哈茨木霉P1产的78kDa的β-1，3葡聚糖酶有抑真菌活性，它能帮助内切几丁质酶和几丁质-β-1，4壳聚糖酶阻止灰霉病孢子的萌发和萌发管的延长。当蛋白质浓度是10～20μg/mL时能彻底地抑制病原菌的孢子萌发和萌发管的延长。Clarkson（1992）描述了哈茨木霉β-1，3葡聚糖酶的抑菌作用。另外，从绿木霉中分离的β-1，3葡聚糖酶和β-1，4葡聚糖酶能破坏真菌细胞壁的完整并导致细胞质渗漏（Jeffries et al.，1994）。

表10.7 不同的木霉和病原菌在双重培养基上对峙培养的β-1，3和β-1，6葡聚糖酶活性

注：+为致病菌培养1～4d过度生长或死亡；±为培养4～10d；-为培养10d后病原菌不生长或不死亡。

（Rey et al.，2001）

β-葡聚糖酶是木霉和粘帚霉细胞壁的组分之一，如同葡聚糖裂解酶的作用一样（De la Cruz et al.，1993，1995b）。目前仍不是很清楚它们的细胞壁是如何克服裂解酶的作用的。有一种解释认为是酵母成分对外界失活而造成的（Adans et al.，1993；Manocha et al.，1988）。细胞壁结构组分的出现抑制了裂解酶。例如，a-葡聚糖链的可折叠性质使它能抵制裂解酶（Kuhn et al.，1990）。其他成分例如结构蛋白也能起到保护作用。Goldman等（1994）和Vasseur等（1995）分离了3个基因编码的蛋白质，分子量大小分别为69kDa，37kDa和15.6kDa。假定15.6kDa蛋白的氨基酸序列在丝氨酸和丙氨酸的结构蛋白里也有，那么就证明该葡聚糖能够抑制水解酶。另外，黑色素的出现也为裂解酶提供了保护（Bull，1970）。

许多β-葡聚糖酶和真菌的自溶有关系。但是这些酶的重要作用还没有完全被弄清楚。例如在细胞壁组分更新中的作用、细胞在营养缺乏条件下的生存、与杀菌剂相互作用干扰细胞壁的合成等方面。一些丝状真菌在碳源受限的条件下形态基因发生改变，同时β-葡聚糖酶的一些裂解酶迅速增加都被认为是为β-葡聚糖酶提供能量。在一般的生长过程中，β-1，3葡聚糖酶和β-1，6葡聚糖酶在菌体自溶和细胞壁延伸时充当结构葡聚糖的角色（Santos et al.，1977，1978a，b）。

⑦ 总糖及还原糖提取分离与纯化方法有哪些

1、采用间接法测定桔梗多糖的含量.运用蒽酮-硫酸法测定桔梗总糖(包括多糖和还原性的单糖)的含量,分别采用3,5-二硝基水杨酸法(DNS)、间接碘
量法、菲林滴定法测定还原糖的含量.总糖含量与还原糖含量之差即为多糖的含量.三种方法测得的桔梗多糖的含量分别为95.55%、96.01%、
95.75%.结果显示三种方法测得的值相近,但是综合实验成本、设备、操作及影响测定的因素等多方面考虑,选用蒽酮-硫酸法与DNS法相结合测定桔梗多
糖的含量.
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2、采用传统的水煮醇沉法提取桔梗多糖,分别考察了提取温度、提取时间、料液比、提取次数对桔梗多糖提取率的影响,在单因素实验的基础上采用了四因素三水
平正交试验来优化桔梗多糖的提取工艺.正交试验结果表明,桔梗多糖提取的最佳工艺条件为：提取温度为80℃,提取时间为2h,提取次数为2次,料液比为
1：25.通过3次平行验证实验得出在该方案下桔梗多糖的提取率为42.51%.
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3、采用Sevag法、三氯乙酸法、三氯乙酸-正丁醇法3种方法分别对桔梗多糖进行脱蛋白研究,以蛋白脱除率和多糖损失率为衡量指标,结果显示Sevag
法除蛋白效果较好,其工艺条件为：多糖：氯仿：正丁醇=25：5：1,剧烈振摇20min.脱色方法采用H2O2氧化法,脱色条件为：多糖
液：H2O2=4：1,以浓氨水或0.1%NaOH调pH值为8.8,37℃保温12h.采用Sephadex G-25柱层析法脱盐及小分子物质.
\x094、纯化后的桔梗多糖采用DEAE-纤维素52进行分离主要得到三种组分：PGPN、PGPA1、PGPA3.三种组分经过Sephadex
G-100柱层析进一步分离后均得到单一对称的洗脱峰.利用Sephadex
G-100柱层析、旋光度测定法、紫外分光光度法对三种多糖进行纯度鉴定得出三种多糖都为均一的多糖,且都不含蛋白质和核酸.利用Sephadex
G-200柱层析测得三种多糖的分子量分别为10233、4677、23442.
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5、采用薄层色谱法(TLC)对桔梗多糖的单糖组成进行了分析,TLC图谱显示PGPN的单糖组成中含有果糖,还含有葡萄糖和半乳糖中的一种或者两种皆
有；PGPA1是由半乳糖和果糖组成的；PGPA3是由半乳糖和木糖组成的.IR光谱显示PGPN的单糖是由呋喃糖和吡喃糖共同组成的；PGPA1的单糖
也是由呋喃糖和吡喃糖共同组成的；PGPA3的单糖是由吡喃糖组成的,糖苷键类型为α-型,可能含有β-型糖苷键.1H-NMR图谱显示PGPN的糖苷键
类型均为α-型,PGPA1糖苷键类型均为β-型；PGPA3的糖苷键类型既有α型也有β型.

⑧ 黄酮类化合物的提取方法有哪些

1、醇提取法

黄酮类化合物提取最常用一种方法，常用的有机溶剂主要有乙醇、乙醚、甲醇和乙酸乙酯等，其中乙醇是最常用的。

2、微波提取法

微波提取技术又称微波萃取技术，其最大的优点是耗能耗材少、无污染，尤其对特定的药材提取具有高选择性。

3、超临界萃取技术

超临界萃取是一种较广泛使用的药物提取、分离手段，其最大的优点是无有机溶剂残留，保证了提取成分的100%纯天然。

4、酶解法

酶解法是一种较好的辅助提取方法。酶具有高度的选择性，因此对不同提取材料，选择合适的酶对提取率影响较大。

5、膜分离提取法

膜分离技术也是一种常用的辅助提取技术，其中超滤法作为唯一能用于分子级别的分离方法广泛的应用于黄酮类化合物的提取分离。利用超滤技术分离纯化黄酮化合物最大的优点是操作简便、无需加热、不破坏活性成分的结构，纯化和浓缩一步完成，超滤装置还可反复使用。

(8)糖苷水相纯化技术扩展阅读

黄酮类化合物的颜色与分子中存在的交叉共轭体系及助色团（-OH）等的类型、数目及取代位置有关。一般来说，黄酮、黄酮醇及其苷类多呈灰黄至黄色，查尔酮为黄色至橙黄色，而二氢黄酮、二氢黄酮醇、异黄酮类等因不存在共轭体系或共轭很少，故不显色。

花色素及其苷元的颜色，因pH的不同而变，一般呈红（pH<7）、紫（7<8.5）、蓝（PH>8.5）等颜色。

黄酮苷元一般难溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有机溶剂，易溶于稀碱液。黄酮类化合物的羟基糖苷化后，水溶性相应加大，而在有机溶剂中的溶解度相应减少。黄酮苷一般易溶于水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、吡啶等溶剂，难溶于乙醚、三氯甲烷、苯等有机溶剂。

黄酮类化合物因分子中多有酚羟基而呈酸性，故可溶于碱性水溶液、吡啶、甲酰胺及二甲基甲酰胺中。有些黄酮类化合物在紫外光（254nm或365nm）下呈不同颜色的荧光，氨蒸汽或碳酸钠溶液处理后荧光更为明显。多数黄酮类化合物可与铝盐、镁盐、铅盐或锆盐生成有色的络合物