纯化水细菌内毒素检测凝胶法

B. 细菌内毒素国家药典是怎么检测的

10版国家药典
检测内毒素可以用凝胶法
凝胶法是通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。
鲎试剂灵敏度复核试验

在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。

以上摘自2010版中国药典《细菌内毒素检查法》

C. 中国药典和美国药典中的细菌内毒素检测法的不同点是什么

1、细菌内毒素工作标准品（CSE）

CP： 对CSE的用途及效价进行定义“细菌内毒素工作标准品中每1ng细菌内毒素的效价应不小于2EU，不大于50EU”
USP：未提到CSE

2、细菌内毒素检查用水

CP ： 与灵敏度为0.03EU/ml或更高灵敏度的鲎试剂在37±1℃条件下24小时不产生凝集反应的灭菌注射用水；
USP：与鲎试剂在限定的灵敏度下不发生反应的灭菌注射用水或其它水。

3、实验用具的准备

CP：实验所用器皿需经处理，除去可能存在的外源性内毒素，常用的方法是250℃下干烤至少1小时，也可用其它确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。

USP：使用经验证的除热原程序对所有玻璃器皿和遇热稳定的材料在热空气烘箱中进行除热原，常用的最低温度和最少的时间是250℃下30分钟。

4、内毒素标准品贮备液和标准品溶液的制备

CP： 未提到

USP：RSE的效价定为10,000USP EU/支，用5ml鲎试剂检查用水复溶1支RSE的全部内容物，用漩涡混合器间歇混合30分钟，并用此原液作系列稀释，将原液置于冰柜中保存不超过14天，作以后的稀释之用，在使用前用漩涡混合器强力混合不少于3分钟，在作下一步稀释前需对前面的稀释液混合不少于30秒，不要贮存稀释液，因为没有数据能证明其不会因为吸附作用而失去活性。

5、供试品溶液的制备

CP：|某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提 用LRW复溶或稀释药品或抽提医疗器械，某些物质可能更适于用其它水性溶液来溶解、稀释或抽提。
对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品需调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般要求供试品溶液的pH值在6.0-8.0的范围内。

USP：用LRW复溶或稀释药品或抽提医疗器械，某些物质可能更适于用其它水性溶液来溶解、稀释或抽提。

6、内毒素限值的建立

CP：药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定：L=K/M
L 为供试品的细菌内毒素限值，一般以 EU /ml、EU / mg 或 EU / U （活性 单位）表示； K 为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以 EU / ( kg · h ）表示，注 射剂 K = 5EU/(kg•h )

放射性药品注射剂 K=2.5EU / （kg· h ) ， 鞘内用注射剂 K = 0.2EU / （kg· h ) ； M 为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以 ml / ( kg · h ）、mg / ( kg · h ） 或 U / ( kg · h ）表示，人均体重按 60kg 计算，人体表面积按 1.62m2 计算。

注射时间若不足 1 小时，按 1 小时计算。供试品每平方米体表面积剂量乘以 0.027 即可转换为 每千克体重剂量（M）。

USP：非经肠道药品的内毒素限值，以剂量定义，等于K/M
除了鞘内给药以外的任何给药途径，K均为5 USP-EU/kg，鞘内给药时，K为0.2 USP-EU/kg，对于非鞘内给药放射性药品，内毒素限值的计算为175/V，V为以mL为单位的最大推荐剂量

对于鞘内给药的放射性药品，其内毒素限值为14/V，对于按以每平方体表面积计算的给药剂量（通常是抗肿瘤药品），计算公式为K/M，其中K=5EU/kg，M为（最大剂量/m2/小时×1.80m2)/70kg。

7、灵敏度复核实验

CP：当最大浓度2.0λ管为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性时，实验方为有效，按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc）：λc=lg-1(ΣX/4)

USP：|浓度最低的标准品溶液的所有重复管均为阴性，实验方为有效。
用下式计算终点浓度的对数值的平均值，然后再计算该平均值的反对数：终点浓度的几何平均值= antilog(Σe/f)

Σe是稀释系列的终点浓度的对数值之和，f为重复管数，反应终点浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的测定值。

8、凝胶法限量实验：

CP：溶液制备以添加了内毒素的溶液为“供试品溶液’。---USP：为“经稀释的供试品溶液。

CP：使用稀释倍数为MVD并且已经排除干扰的供试品液来制备溶液A和B。----USP；使用稀释倍数不超过MVD的稀释液来制备溶液A和B

CP：在复试中，溶液A需做4支平行管，当所有平行管都为阴性时，供试品溶液符合规定
------------USP：在复试中，如果溶液A的两支平行管均为阴性，供试品溶液符合规定

USP：如果供试品溶液以不超过MVD的某个稀释倍数稀释，检测结果为阳性时，可进一步稀释供试品溶液但不能超过MVD，再重新进行试验。------CP；无规定。

D. 细菌内毒素检测方法动态浊度法和凝胶法结果不一致

您好，同一样品采用动态浊度法检测和凝胶法检测内毒素结果相差很多的原因主要有:
1.动态浊度法比凝胶法灵敏很多，比如某个样品中内毒素限值为0.40EU，使用动态浊度法检测结果在0.35EU/ml左右，而使用凝胶法，当使用0.5EU的鲎试剂时，有可能检测结果会呈阳性!
2.动态浊度法和凝胶法实验过程中使用的内毒素标准品存在差别，由于判断实验结果的质控品的不一样，会使实验结果较大的误差!
根据要点的规定，当定量法和凝胶法的实验结果出现偏差时，以凝胶法的实验结果为准!
厦门市鲎试剂实验厂有限公司为您提供全方位的内毒素检测服务!
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E. 细菌内毒素的检测方法

鲎试剂法（利用鲎血液遇革兰氏阴性菌时会产生凝胶的原理）

F. 中国药典和美国药典中的细菌内毒素检测法的不同点比较

中国药典和美国药典中的细菌内毒素检测法的不同点比较

1、细菌内毒素工作标准品（CSE）

CP 对CSE的用途及效价进行定义“细菌内毒素工作标准品中每1ng细菌内毒素的效价应不小于2EU，不大于50EU”

USP未提

2、细菌内毒素检查用水

CP ： 与灵敏度为0.03EU/ml或更高灵敏度的鲎试剂在37±1℃条件下24小时不产生凝集反应的灭菌注射用水

USP：与鲎试剂在限定的灵敏度下不发生反应的灭菌注射用水或其它水。

CP：用于细菌内毒素定量测定用的细菌内毒素检查用水，内毒素含量应小于0.005EU/ml。

USP： 未提到。

3、实验用具的准备

CP：实验所用器皿需要经处理，除去可能存在的外源性内毒素，常用的方法是250℃下干烤至少1小时，也可用其它确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。

USP：使用经验证的除热原程序对所有玻璃器皿和遇热稳定的材料在热空气烘箱中进行除热原，常用的最低温度和最少的时间是250℃下30分钟。

(6)纯化水细菌内毒素检测凝胶法扩展阅读

细菌内毒素检查法的注意事项：

在细菌内毒素检查方法的建立中，计算内毒素限值L、MVD和MVC时，需要注意最大人用剂量、产品规格、鲎试剂的灵敏度等重要的参数，因为计算错误会导致后续的所有努力均告失败。常见的问题有：

(1)临床用药剂量确定不正确，仅用常规用药剂量，未考虑临床可能的人体最大用药剂量和给药途径，在限值计算公式L=K/M中，由于对K值及M值的定义模糊，使K值及M值赋值不准确，最终导致限值计算错误。

例如，某注射剂临床成人每次静脉滴注给药40-80mg，婴儿(三个月以上)静脉滴注给药每次10-20mg。

按成人(体重60kg)剂量计算限值为3.75EU/mg，而婴儿体重仅为5kg左右，计算限值约为1.25EU/mg，如果不考虑临床每公斤体重最大用药剂量，细菌内毒素限值就会出现较大的差别。

(2)有的申报品种细菌内毒素限值不是根据临床用量计算出来，而是根据同品种热原检查的剂量推算出来的，造成限值错误。

(3)有的品种细菌内毒素限值从国外药典抄来，没有考虑该品种国内上市的临床使用剂量及中国人与国外人均体重等的差异，也造成限值确定不正确。

(4)错误的计算日给药剂量(一日内多次给药)。

(5)在品种规格(浓度)发生变化时，计算MVD没有进行调整。

(6)建立方法时所用的最大给药剂量已经超出了临床所用剂量等。

G. 细菌内毒素的检验方式有什么

细菌内毒素检查法是判断供试品中细菌内毒素是否符合规定。 内毒素(Endotoxin)即革兰氏阴性菌细胞壁的脂多糖，其毒性成分为类脂A。菌体死亡崩解后释放出来。细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。

H. 2010版药典关于凝胶法细菌内毒素检查与2005版药典有哪些不同

没有什么不同，要说不同有两点：1、反对数计算公式的表示方式原来lg-1→antilg；2、检查法（1）凝胶限量度试验→凝胶限度试验