超滤细胞内含物

A. 超滤和反渗透有什么区别

1、使用膜清洗不同

超滤：超滤用的膜可以通过反洗来有效的清洗膜面，以保持其高流速。

反渗透：反渗透用的膜不能反洗。

2、原理不同

超滤：超滤是一种加压膜分离技术，即在一定的压力下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜，而使大分子溶质不能透过，留在膜的一边，从而使大分子物质得到了部分的纯化。

超滤原理也是一种膜分离过程原理，超滤利用一种压力活性膜，在外界推动力(压力)作用下截留水中胶体、颗粒和分子量相对较高的物质，而水和小的溶质颗粒透过膜的分离过程。

反渗透：把相同体积的稀溶液（如淡水）和浓液（如海水或盐水）分别置于一容器的两侧，中间用半透膜阻隔，稀溶液中的溶剂将自然的穿过半透膜，向浓溶液侧流动，浓溶液侧的液面会比稀溶液的液面高出一定高度，形成一个压力差，达到渗透平衡状态，

此种压力差即为渗透压，渗透压的大小决定于浓液的种类，浓度和温度，与半透膜的性质无关。若在浓溶液侧施加一个大于渗透压的压力时，浓溶液中的溶剂会向稀溶液流动，此种溶剂的流动方向与原来渗透的方向相反，这一过程称为反渗透。

3、优点不同

超滤：超滤技术的优点是操作简便，成本低廉，不需增加任何化学试剂，尤其是超滤技术的实验条件温和，与蒸发、冷冻干燥相比没有相的变化，而且不引起温度、pH的变化，因而可以防止生物大分子的变性、失活和自溶。

反渗透：压力是反渗透分离过程的主动力，不经过能量密集交换的相变，能耗低；反渗透不需要大量的沉淀剂和吸附剂，运行成本低；反渗透分离工程设计和操作简单，建设周期短；反渗透净化效率高，环境友好。

B. 为什么超滤膜净水器更健康

RO膜反渗透纯水机往往作为卖家的重点宣传，因为其工艺比超滤净水器复杂，售价和后期维护成本都远远高于超滤净水器。但是，我们真的需要RO膜反渗透纯水机吗？其实RO膜反渗透纯水根本不应该作为家庭饮用水的，作为工业用水才更符合其使命，但因为有利可图商家的误导加上大部分家庭对纯水和净水的理解不够透彻，因此RO膜反渗透纯水机现在大行其道。
RO膜反渗透纯水机，广告总是如何宣传我们的自来水是多么的不安全，通过TDS测试值让你感觉纯水是多么的高大上。TDS是溶解性固体总量，包括矿物质。TDS仅能测出水中的可导电物质，原TDS在17的纯水经电解水机电解后所得碱性水的TDS值大约就在300左右，而且无法测出细菌、病毒等物质。有些品牌瓶装的矿泉水TDS就很高，你能说它不合格？然而恰恰相反。而且纯水是死水，并不是生命之水。广告总是宣传人体所需的矿物质,95%以上是通过食物摄取的。可是这里有个漏洞，95%并不是全部，并且剩下的5%可能食物中根本吃不来或者很少，这种危害是慢性的。
纯净水进入人体后，因为它不含各种正负离子，所以溶解性能很强，这样不仅可以把各种有害废物和有害微量元素溶解，并排出体外。同时，也可以溶解人体非常需要的各种必需微量元素，而被排出体外。纯净水的分子结构，经过净水器处理后会发生重排现象，使纯水分子的结构变为极度串联和线团化。这种水分子，不易通过细胞膜，会导致身体内有益的生命相关元素向体外流失。有些敏感的人感觉越喝越渴，越渴越想喝。长期喝纯净水会感觉无力。这对正在长身体的青少年有比较突出的副作用。为此，上海市已明确规定，限制中小学生饮用纯净水。
超滤净水器发展多年，现在基本所有品牌除了山寨产品质量几乎没有差别，0.01的过滤精度，加上碳吸附除味，使得超滤净水器的过滤精度和口感达到稳定程度，各个厂家几乎没有什么卖点，无非新产品可以更方便地更换滤芯，这种产品的滤芯可能不通用价格又很贵，这不仅增加了购买成本而且增加了后期维护成本。
我们买净水器主要是过滤水质和提升口感，自来水厂的水出厂时本身就是合格的，大多是出厂之后的二次污染，尤其是高层供水系统属于三次污染，但是重金属超标在自来水中是罕见的，主要是杂质、颜色和口感方面的，除了不能过滤矿物质，超滤净水器在功能上和RO膜反渗透相差无几，然而，这恰恰是RO膜反渗透纯水机作为饮用水的劣势。
超滤净水器应该作为普及的家庭产品，然而，由于产品没有差异性加上没有利润可图，消费者正在受到商家的误导而越来越多地购买RO膜反渗透纯水机，这是很可悲的事情

C. 其实超滤膜过滤出来的水,和烧开的自来水有什么区别..

一、水的微量元素含量不同

超滤膜过滤出来的水在过滤的过程中虽然去掉了胶体、悬专浮物等大属分子有机物，但是也去除了一些微量元素，自来水只进行了粗过滤和杀菌，所以超滤膜过滤出来的水中的锌等微量元素远远低于自来水。

二、水的处理过程不同

超滤膜过滤是一种筛分的过程，以超滤膜为过滤介质，在一定的压力下，超滤膜表面密布的许多细小的微孔只允许水及小分子物质通过，而体积大于膜孔径的物质则被留下成为浓缩液，从而实现了对水的净化。

烧开的自来水是一种灭菌除垢的过程，自来水经过粗过滤和灭菌去掉了悬浮物杂质和细菌等有害物质，随后自来水经煮沸后除垢并进一步灭菌。

(3)超滤细胞内含物扩展阅读

超滤膜的材质很多，包括：聚偏氟乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚丙烯腈、聚氯乙烯等。当超滤用于水处理时，其材质的化学稳定性和亲水性是两个最重要的性质。

化学稳定性决定了材料在酸碱、氧化剂、微生物等的作用下的寿命，它还直接关系到清洗可以采取的方法，亲水性则决定了膜材料对水中有机污染物的吸附程度，主要影响膜的通量。

D. 什么是超滤液

循环血液经过肾小球毛细血管时，血浆中的水和小分子溶质，包括少量分子量较小的血浆蛋白，可以滤入肾小囊的囊腔而形成滤过液。这种滤过液就是超滤液。

尿液首先在肾脏，通过肾小球滤过，形成超滤液，人体每天正常生成的超滤液可以达到180升。超滤液进入肾小管后，称为小管液，那么肾小管和集合管可以把人体大部分的水分和各种溶质重吸收回血液，称之为重吸收。

除此以外，肾小管和集合管还有分泌的功能，可以将某些物质分泌入小管腔内，称为分泌。经过肾小管和集合管的重吸收和分泌，人体正常每天生成的尿液只有1.5升。

(4)超滤细胞内含物扩展阅读：

超滤技术：

超滤是一种加压膜分离技术，即在一定的压力下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜，而使大分子溶质不能透过，留在膜的一边，从而使大分子物质得到了部分的纯化。超滤原理也是一种膜分离过程原理.

超滤利用一种压力活性膜，在外界推动力(压力)作用下截留水中胶体、颗粒和分子量相对较高的物质，而水和小的溶质颗粒透过膜的分离过程。通过膜表面的微孔筛选可截留分子量为3x10000—1x10000的物质。当被处理水借助于外界压力的作用以一定的流速通过膜表面时.

水分子和分子量小于300—500的溶质透过膜，而大于膜孔的微粒、大分子等由于筛分作用被截留，从而使水得到净化。也就是说，当水通过超滤膜后，可将水中含有的大部分胶体硅除去，同时可去除大量的有机物等。

超滤原理并不复杂。在超滤过程中，由于被截留的杂质在膜表面上不断积累，会产生浓差极化现象，当膜面溶质浓度达到某一极限时即生成凝胶层，使膜的透水量急剧下降，这使得超滤的应用受到一定程度的限制。

为此，需通过试验进行研究，以确定最佳的工艺和运行条件，最大限度地减轻浓差极化的影响，使超滤成为一种可靠的反渗透预处理方法。

超滤是一种膜分离技术，(UItrafil-tration 简称UF)。能够将溶液净化，分离或者浓缩。超滤是介于微滤与纳滤之间，且三者之间无明显的分界线。一般来说，超滤膜的孔径在0.05 um–1 nm之间，操作压力为0.1–0.5 Mpa。

主要用于截留去除水中的悬浮物、胶体、微粒、细菌和病毒等大分子物质。超滤膜根据膜材料，可分为有机膜和无机膜。按膜的外型，又可分为：平板式、管式、毛细管式、中空纤维和多孔式。目前家用超滤净水器，多以中空膜为主。

超滤膜的工作以筛分机理为主，以工作压力和膜的孔径大小来进行水的净化处理。以中空纤维为例。

以进水方式可分为外压式：原水从膜丝外进入，净水从膜丝内制取。反之则为内压式。内压式的工作压力较外压式要低。超滤膜在饮用水深度处理，工业用超纯水和溶液浓缩分离等许多领域中，得到了广泛应用。

参考资料资料：网络-原尿

参考资料资料：网络-超滤技术

E. 生物大分子分离方法和理论依据

一般的有:
层析
电泳
离子交换器

F. 透析，微滤，超滤，纳滤，反渗透，电渗析，渗透气化等膜分离技术各自的特点

1.透析（dialysis）是通过小分来子经过半源透膜扩散到水（或缓冲液）的原理；
2.微滤适用于细胞、细菌和微粒子的分离，在生物分离中，广泛用于菌体的分离和浓缩，目标物质的大小范围为0.01-10 μm，一般用于预处理；
3.超滤技术的优点是没有相的转变，无需添加任何强烈的化学物质，可以在低温下操作，过滤速度较快，便于无菌处理等，一般用于预处理；
4.纳滤 特点是能截留小分子的有机物并可同时透析出盐，集浓缩与透析于一体；
操作压力低，因为无机盐能通过纳米滤膜而透析，使得纳米过滤的渗透压远比反渗透为低，所以纳米过滤所需的外加压力比反渗透低得多；
5.反渗透法具有设备构型紧凑，占地面积小、单位体积产水量及能量消耗少等优点；
6.电渗析的特点时可以同时对电解质水溶液起淡化、浓缩、分离、提纯作用、可以用于蔗糖等非电解质的提纯，以除去其中的电解质、在原理上，电渗析器是一个带有隔膜的电解池，可以利用电极上的氧化还原效率高；
7.渗透气化对共沸物系和近沸物系等难分物系的分离, 显示特有的优越性。

G. 如何提取细胞膜（动物细胞）上的蛋白质

NRC Institute for Biological Sciences
Triton X-114 extraction protocol (Hydrophobic protein preparation)

Ressuspend cells in Solution A (dil 1/8) and add 15 μl of mammalian cocktail proteases inhibitor (Sigma).
Add 1 third of the volume of solution B
Incubate on ice for 1 hour with frequent vortexing.
Centrifuge at 10 000g for 10 minutes at 4°C to pellet unbroken cells and nuclei.
Transfer supernatant in clean eppendorfs then incubate at 30°C for 3 minutes (until sln is cloudy).
Centrifuge at 1 300g for 10 minutes at room temperature.
Transfer Aqueous phase in new eppendorf (but keep detergent phase at room temperature).
Add X volume of triton X-114 to Aqueous phase:

Vol of Aq phase = X vol of triton X-114
24.6
Shake well then incubate 3 minutes at 30°C (until cloudy) then transfer on top of detergent phase slowly.
Centrifuge at 1 300g for 10 minutes at room temperature.
Remove Aqueous phase with pipette down to detergent interphase.
Precipitate hydrophobic protein (detergent phase) with 10X volume of acetone. Place overnight at -20°C.
Pellet proteins by centrifugation at max speed for 10 minutes at 4°C. Ressuspend proteins in IEF sln (7M urea, 2M thiourea, 4% CHAPS, 1% DTT) then precipitate protein again with 10 volume of acetone. Place 5-10 min at -20°C.
Pellet proteins by centrifugation at max speed for 10 minutes at 4°C. Air dry pellet then dissolve protein in IEF solution
Solution:

Solution A: 80 mM Tris-HCl, pH 7.4 ; 1,2M NaCl

0,63 g Tris-HCl
3,51 g NaCl
Dissolve in 30 ml of water
Adjust pH to 7.4
Adjust volume to 50 ml with water
Solution B: 40 mM Tris-HCl, pH 7.4 ; 600 mM NaCl ; 4% triton X-114

5 ml of sln A
Add triton to have a final concentration off 4%

4% x 10 ml = ml
[triton X114]
Adjust volume to 10 ml with water

H. 如何进行蛋白超滤设备选型

如何进行蛋白超滤设备选型？在分离分析特别是蛋白质分离分析中，层析是相当重要、且相当常见的一种技术，其原理较为复杂，对人员的要求相对较高，这里只能做一个相对简单的介绍。
一、 吸附层析
1、 吸附柱层析
吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相，以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱的一种层析方法。
2、 薄层层析
薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法。这种层析方法是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层，然后按纸层析操作进行展层。
3、 聚酰胺薄膜层析
聚酰胺对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键。这种氢键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。层析时，展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键。因此选择适当的展层剂使分离在聚酰胺膜表面发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的连续过程，就能导致分离物质达到分离目的。
二、 离子交换层析
离子交换层析是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。离子交换剂是由基质、电荷基团和反离子构成的。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。`
三、 凝胶过滤
凝胶过滤又叫分子筛层析，其原因是凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排除在外部。当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。
四、 亲和层析
亲和层析的原理与众所周知的抗原一抗体、激素一受体和酶一底物等特异性反应的机理相类似，每对反应物之间都有一定的亲和力。正如在酶与底物的反应中，特异的废物(S')才能和一定的酶(E)结合，产生复合物(E－S')一样。在亲和层析中是特异的配体才能和一定的生命大分子之间具有亲和力，并产生复合物。而亲和层析与酶一底物反应不同的是，前者进行反应时，配体(类似底物)是固相存在；后者进行反应时，底物呈液相存在。实质上亲和层析是把具有识别能力的配体L(对酶的配体可以是类似底物、抑制剂或辅基等)以共价键的方式固化到含有活化基团的基质M(如活化琼脂糖等)上，制成亲和吸附剂M－L，或者叫做固相载体。而固化后的配体仍保持束缚特异物质的能力。因此，当把围相载体装人小层析柱(几毫升到几十毫升床体积)后，让欲分离的样品液通过该柱。这时样品中对配体有亲和力的物质S就可借助静电引力、范德瓦尔力，以及结构互补效应等作用吸附到固相载体上，而无亲和力或非特异吸附的物质则被起始缓冲液洗涤出来，并形成了第一个层析峰。然后，恰当地改变起始缓冲 液的PH值、或增加离子强度、或加人抑③剂等因子，即可把物质S从固相载体上解离下来，并形成了第M个层析峰(见图6－2)。显然，通过这一操作程序就可把有效成分与杂质满意地分离开。如果样品液中存在两个以上的物质与固相载体具有亲和力(其大小有差异)时，采用选择性缓冲液进行洗脱，也可以将它们分离开。用过的固相载体经再生处理后，可以重复使用。
上面介绍的亲和层析法亦称特异性配体亲和层析法。除此之外，还有一种亲和层析法叫通用性配体亲和层析法。这两种亲和层析法相比，前者的配体一般为复杂的生命大分子物质(如抗体、受体和酶的类似底物等)，它具有较强的吸附选择性和较大的结合力。而后者的配体则一般为简单的小分子物质(如金属、染料，以及氨基酸等)，它成本低廉、具有较高的吸附容量，通过改善吸附和脱附条件可提高层析的分辨率。
五、 聚焦层析
聚焦层析也是一种柱层析。因此，它和另外的层析一样，照例具有流动相，其流动相为 多缓冲剂，固定相为多缓冲交换剂。
聚焦层析原理可以从PH梯度溶液的形成、蛋白质的行为和聚焦效应三方面来阐述。
1、PH梯度溶液的形成
在离子交换层析中，PH梯度溶液的形成是靠梯度混合仪实现的。例如，当使用阴离子 剂进行层析时，制备PH由高到低呈线性变化的梯度溶液的方法是，在梯度仪的混合室(这层析柱者)中装高PH溶液，而在另一室装低PH极限溶液，然后打开层析柱的下端出口，让洗脱液连续不断地流过柱体。这时从柱的上部到下部溶液的PH值是由高到低变化的。而在聚焦层析中，当洗脱液流进多缓冲交换剂时，由于交换剂带具有缓冲能力的电荷基团，故PH梯度溶液可以自动形成。例如，当柱中装阴离子交换剂PBE94(作固定相)时，先用起始缓冲液(配方见表了一2)平衡到PHg，再用含PH6的多缓冲剂物质(作流动相)的淋洗液通过柱体，这时多缓冲剂中酸性最强的组分与碱性阴离子交换对结合发生中和作用。随着淋洗液的不断加人，住内每点的PH值从高到低逐渐下降。照此处理J段时间，从层析柱顶部到底部就形成了PH6～9的梯度。聚焦层析柱中的PH梯度溶液是在淋洗过程中自动形成的，但是随着淋洗的进行，PH梯度会逐渐向下迁移，从底部流出液的PH却由9逐渐降至6，并最后恒定于此值，这时层析柱的PH梯度也就消失了。
2．蛋白质的行为
蛋白质所带电荷取决于它的等电点(PI)和层析柱中的PH值。当柱中的PH低于蛋白质的PI时，蛋白质带正电荷，且不与阴离于交换剂结合。而随着洗脱剂向前移动，固定相中的PH值是随着淋洗时间延长而变化的。当蛋白质移动至环境PH高于其PI时，蛋白质由带正电行变为带负电荷，并与阴离子交换剂结合。由于洗脱剂的通过，蛋白质周围的环境PH 再次低于PI时，它又带正电荷，并从交换剂解吸下来。随着洗脱液向柱底的迁移，上述过程将反复进行，于是各种蛋白质就在各自的等电点被洗下来，从而达到了分离的目的。
不同蛋白质具有不同的等电点，它们在被离子交换剂结合以前，移动之距离是不同的，洗脱出来的先后次序是按等电点排列的。

供静脉注射的25%人胎盘血白蛋白（即胎白）通常是用硫酸铵盐析法、透析脱盐、真空浓缩等工艺制备的，该工艺流程硫酸铵耗量大，能源消耗多，操作时间长，透析过程易产生污染。改用超滤工艺后，平均回收率可达97.18%；吸附损失为1.69%；透过损失为1.23%；截留率为98.77%。大幅度提高了白蛋白的产量和质量，每年可节省硫酸铵6.2吨，自来水16000吨。目前国外生产超滤膜和超滤装置最有名的厂家是美国的Milipore公司和德国的Sartorius公司。
随着现代生物技术的发展, 通过基因工程生产蛋白质药物在治疗人类面临的重大疾病如癌症等方面展示出巨大的潜力. 为满足生物技术产品工业化生产的需要, 开发高通量、低成本、高效的分离纯化方法已引起人们的高度关注. 超滤技术由于具有通量高, 操作条件温和, 易于放大等特点, 特别适合生物活性大分子的分离. 在生物技术领域, 超滤技术目前已广泛应用于细胞收集分离、除菌消毒、缓冲液置换、分级( fract ionatio n) 、脱盐及浓缩[ 1] . 近年来越来越多的研究表明, 通过选择适当的膜或膜表面改性,以及对分离过程进行优化, 充分利用和调控膜—蛋白质以及蛋白质—蛋白质之间的静电相互作用, 可以实现分子量相近的两种蛋白质的高选择性超滤分离[2- 7] .

为克服常规蛋白质超滤分离过程优化中存在的实验蛋白质消耗多、工作量大、费时以及费用高等缺点, 我们相继开发了脉冲进样技术( Pulsed sampleinject ion technique ) [8]和参数连续变化超滤技术( Parameter scanning ultraf ilt ration) [9]. 并以此为基础, 结合载体相超滤技术( Carrier phase ult rafil—t rat ion) [10]进一步提出了一种蛋白质超滤分离快速优化新方法[11], 实现了人血浆白蛋白—免疫球蛋白[12]、人源化单克隆抗体( A lemtuzumab) 单体— 二聚体[13]的超滤分离过程快速优化和高选择性分离,并在膜的筛选及其适用性快速评估方面展现出巨大的潜力. 该方法的主要特征是与AKTA Prime 系统联用, 采用脉动进样技术显著减少了蛋白质的用量;而利用双缓冲体系( 类似梯度洗脱) 的参数连续变化超滤技术, 在pH 或离子强度连续变化的情况下考查pH 或离子强度对蛋白质透过率或截留率的影响, 进一步缩短了实验时间, 降低了蛋白质的用量,极大地减少了实验量, 加快了过程优化进程; 另外,载体相超滤技术的应用则可保证超滤分离自始至终在设定的条件下进行, 从而最大限度地保证超滤过程的稳定性.
2012-02-25
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I. 肾小球超滤什么意思

肾小球超滤就是肾小球处于一个高滤过，高灌注状态， 病变早期往往表现为一个超滤状态

J. 蛋白质层析、超滤常用技术手段

在分离分析特别是蛋白质分离分析中，层析是相当重要、且相当常见的一种技术，其原理较为复杂，对人员的要求相对较高，这里只能做一个相对简单的介绍。
一、 吸附层析
1、 吸附柱层析
吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相，以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱的一种层析方法。
2、 薄层层析
薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法。这种层析方法是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层，然后按纸层析操作进行展层。
3、 聚酰胺薄膜层析
聚酰胺对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键。这种氢键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。层析时，展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键。因此选择适当的展层剂使分离在聚酰胺膜表面发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的连续过程，就能导致分离物质达到分离目的。
二、 离子交换层析
离子交换层析是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。离子交换剂是由基质、电荷基团和反离子构成的。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。`
三、 凝胶过滤
凝胶过滤又叫分子筛层析，其原因是凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排除在外部。当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。
四、 亲和层析
亲和层析的原理与众所周知的抗原一抗体、激素一受体和酶一底物等特异性反应的机理相类似，每对反应物之间都有一定的亲和力。正如在酶与底物的反应中，特异的废物(S')才能和一定的酶(E)结合，产生复合物(E－S')一样。在亲和层析中是特异的配体才能和一定的生命大分子之间具有亲和力，并产生复合物。而亲和层析与酶一底物反应不同的是，前者进行反应时，配体(类似底物)是固相存在；后者进行反应时，底物呈液相存在。实质上亲和层析是把具有识别能力的配体L(对酶的配体可以是类似底物、抑制剂或辅基等)以共价键的方式固化到含有活化基团的基质M(如活化琼脂糖等)上，制成亲和吸附剂M－L，或者叫做固相载体。而固化后的配体仍保持束缚特异物质的能力。因此，当把围相载体装人小层析柱(几毫升到几十毫升床体积)后，让欲分离的样品液通过该柱。这时样品中对配体有亲和力的物质S就可借助静电引力、范德瓦尔力，以及结构互补效应等作用吸附到固相载体上，而无亲和力或非特异吸附的物质则被起始缓冲液洗涤出来，并形成了第一个层析峰。然后，恰当地改变起始缓冲 液的PH值、或增加离子强度、或加人抑③剂等因子，即可把物质S从固相载体上解离下来，并形成了第M个层析峰(见图6－2)。显然，通过这一操作程序就可把有效成分与杂质满意地分离开。如果样品液中存在两个以上的物质与固相载体具有亲和力(其大小有差异)时，采用选择性缓冲液进行洗脱，也可以将它们分离开。用过的固相载体经再生处理后，可以重复使用。
上面介绍的亲和层析法亦称特异性配体亲和层析法。除此之外，还有一种亲和层析法叫通用性配体亲和层析法。这两种亲和层析法相比，前者的配体一般为复杂的生命大分子物质(如抗体、受体和酶的类似底物等)，它具有较强的吸附选择性和较大的结合力。而后者的配体则一般为简单的小分子物质(如金属、染料，以及氨基酸等)，它成本低廉、具有较高的吸附容量，通过改善吸附和脱附条件可提高层析的分辨率。
五、 聚焦层析
聚焦层析也是一种柱层析。因此，它和另外的层析一样，照例具有流动相，其流动相为多缓冲剂，固定相为多缓冲交换剂。
聚焦层析原理可以从PH梯度溶液的形成、蛋白质的行为和聚焦效应三方面来阐述。
1、PH梯度溶液的形成
在离子交换层析中，PH梯度溶液的形成是靠梯度混合仪实现的。例如，当使用阴离子 剂进行层析时，制备PH由高到低呈线性变化的梯度溶液的方法是，在梯度仪的混合室(这层析柱者)中装高PH溶液，而在另一室装低PH极限溶液，然后打开层析柱的下端出口，让洗脱液连续不断地流过柱体。这时从柱的上部到下部溶液的PH值是由高到低变化的。而在聚焦层析中，当洗脱液流进多缓冲交换剂时，由于交换剂带具有缓冲能力的电荷基团，故PH梯度溶液可以自动形成。例如，当柱中装阴离子交换剂PBE94(作固定相)时，先用起始缓冲液(配方见表了一2)平衡到PHg，再用含PH6的多缓冲剂物质(作流动相)的淋洗液通过柱体，这时多缓冲剂中酸性最强的组分与碱性阴离子交换对结合发生中和作用。随着淋洗液的不断加人，住内每点的PH值从高到低逐渐下降。照此处理J段时间，从层析柱顶部到底部就形成了PH6～9的梯度。聚焦层析柱中的PH梯度溶液是在淋洗过程中自动形成的，但是随着淋洗的进行，PH梯度会逐渐向下迁移，从底部流出液的PH却由9逐渐降至6，并最后恒定于此值，这时层析柱的PH梯度也就消失了。
2．蛋白质的行为
蛋白质所带电荷取决于它的等电点(PI)和层析柱中的PH值。当柱中的PH低于蛋白质的PI时，蛋白质带正电荷，且不与阴离于交换剂结合。而随着洗脱剂向前移动，固定相中的PH值是随着淋洗时间延长而变化的。当蛋白质移动至环境PH高于其PI时，蛋白质由带正电行变为带负电荷，并与阴离子交换剂结合。由于洗脱剂的通过，蛋白质周围的环境PH 再次低于PI时，它又带正电荷，并从交换剂解吸下来。随着洗脱液向柱底的迁移，上述过程将反复进行，于是各种蛋白质就在各自的等电点被洗下来，从而达到了分离的目的。
不同蛋白质具有不同的等电点，它们在被离子交换剂结合以前，移动之距离是不同的，洗脱出来的先后次序是按等电点排列的。

供静脉注射的25%人胎盘血白蛋白（即胎白）通常是用硫酸铵盐析法、透析脱盐、真空浓缩等工艺制备的，该工艺流程硫酸铵耗量大，能源消耗多，操作时间长，透析过程易产生污染。改用超滤工艺后，平均回收率可达97.18%；吸附损失为1.69%；透过损失为1.23%；截留率为98.77%。大幅度提高了白蛋白的产量和质量，每年可节省硫酸铵6.2吨，自来水16000吨。目前国外生产超滤膜和超滤装置最有名的厂家是美国的Milipore公司和德国的Sartorius公司。
随着现代生物技术的发展, 通过基因工程生产蛋白质药物在治疗人类面临的重大疾病如癌症等方面展示出巨大的潜力. 为满足生物技术产品工业化生产的需要, 开发高通量、低成本、高效的分离纯化方法已引起人们的高度关注. 超滤技术由于具有通量高, 操作条件温和, 易于放大等特点, 特别适合生物活性大分子的分离. 在生物技术领域, 超滤技术目前已广泛应用于细胞收集分离、除菌消毒、缓冲液置换、分级( fract ionatio n) 、脱盐及浓缩[ 1] . 近年来越来越多的研究表明, 通过选择适当的膜或膜表面改性,以及对分离过程进行优化, 充分利用和调控膜—蛋白质以及蛋白质—蛋白质之间的静电相互作用, 可以实现分子量相近的两种蛋白质的高选择性超滤分离[2- 7] .

为克服常规蛋白质超滤分离过程优化中存在的实验蛋白质消耗多、工作量大、费时以及费用高等缺点, 我们相继开发了脉冲进样技术( Pulsed sampleinject ion technique ) [8]和参数连续变化超滤技术( Parameter scanning ultraf ilt ration) [9]. 并以此为基础, 结合载体相超滤技术( Carrier phase ult rafil—t rat ion) [10]进一步提出了一种蛋白质超滤分离快速优化新方法[11], 实现了人血浆白蛋白—免疫球蛋白[12]、人源化单克隆抗体( A lemtuzumab) 单体— 二聚体[13]的超滤分离过程快速优化和高选择性分离,并在膜的筛选及其适用性快速评估方面展现出巨大的潜力. 该方法的主要特征是与AKTA Prime 系统联用, 采用脉动进样技术显著减少了蛋白质的用量;而利用双缓冲体系( 类似梯度洗脱) 的参数连续变化超滤技术, 在pH 或离子强度连续变化的情况下考查pH 或离子强度对蛋白质透过率或截留率的影响, 进一步缩短了实验时间, 降低了蛋白质的用量,极大地减少了实验量, 加快了过程优化进程; 另外,载体相超滤技术的应用则可保证超滤分离自始至终在设定的条件下进行, 从而最大限度地保证超滤过程的稳定性.