stv6型无菌检查薄膜过滤器

A. 包装材料的微生物限度也是做6天吗

微生物限度

1. 包装材料的大肠埃希菌检查？

2. 根据包装材料的不同，大肠埃希菌的检查方法大致有两种，一种是将浸提液合并后，取

3. 一部分，接种胆盐乳糖培养基进行检查；另一种是将浸提液合并后，薄膜过滤，然后按规定

4. 的方法检验。

5. 2. 抗真菌品的微生物限度检查法

6. 这类产品的霉菌和酵母菌计数方法需要进行调整，可以根据产品剂型的不同，选择薄膜

7. 过滤法或培养基稀释法等方法。

8. 3. 为什么在日常样品检测中还需要做阳性对照（国外不需要）？

9. 为了确保每一次检测对可能存在的微生物都是有效的。

10. 4. 对于同一个品种，典为什么不规定统一的检测方法？

11. 本版典进行过这样的尝试，也有某些品种已经收载了统一的检测方法，如用头孢

12. 类抗生素的无菌检查。之所以没有大量收载，主要是由于检测方法还没有经过必要的复核。

13. 将微生物检验的统一方法收载在品种的各论项下，始终是努力的方向。

14. 5. 梭菌检查中需置厌氧条件下培养48小时，是否指在厌氧培养箱中？

15. 需要在厌氧培养装置中进行培养，未必一定是厌氧培养箱。

16. 6. 控制菌检查方法验证时，采用多种方法均未检出控制菌，如何处理？

17. 在确保所使用的各种方法都没有错误的情况下，如果仍无法使试验菌生长，则应该采用

18. 薄膜过滤法进行检查。理由是该方法能够最大程度地去除产品的抑菌作用。

19. 7. 常规的监督抽样检品（包括原料）在进行微生物限度检查时，是否一定要进行活螨检查

20. 并在原始记录与报告书中体现？

21. 需要进行检查。可以在原始记录中体现，报告书上可以不出现，除非当发现有活螨检出。

22. 8. 包材微生物限度检查规定了合格质量水平，通常产量下取样8个，要求8个瓶子均符

23. 合规定，如何进行？

24. 每个瓶子分别进行实验。

25. 9. 大肠埃希菌具体操作规程？

26. 参见中国品检验标准操作规程。

27. 10. 动物组织及动物类原材的提取物入，是否需要检沙门菌？

28. 需要进行沙门菌检查。

29. 11. 关于中国典菌落计数结果的判断还存在疑义，望能举例说明。

30. 不清楚所指的存在疑义是指哪方面。2010年版对结果报告进行了较大篇幅的修订，目

31. 前的规定应该比05版更为清晰、明确。

32. 12. 需做沙门菌检验样品量的确定？

33. 10g（ml）用于样品计数检验和其他控制菌检查，10g（ml）用于沙门菌检查，10g（ml）

34. 用于沙门菌检查的阳性对照。需要进行沙门菌检查的样品，检验用量应为30g（ml）。

35. 13. 日常的实验室装备能否达到梭菌无氧的培养要求？

36. 完全可以。可以采用厌氧培养盒（罐）。

37. 14. 如果一个产品有两个规格，是否可以取其中之一做阳性对照？

38. 每个规格均需进行阳性对照。

39. 15. 细菌数为100g/g的，样品稀释级只做1:10,1:100的倍数就可以了吗？

40. 可以。

41. 16. 培养时间3天，5天，可理解为72小时，120小时吗？

42. 可以。这样更为严谨。

43. 17. 中国品检验标准操作规范“已做验证试验的供试品，在检查时刻不必再做阳性对照”

44. 如何理解？

45. 该标准操作规范中在无菌检查法中规定“供试品无菌检查应进行阳性对照试验”，表明

46. 不论是否进行了方法验证，在产品的每一次检验过程中，还必须进行阳性对照。

47. 在控制菌检查的大肠埃希菌项下，指出“已做验证试验的供试品，在该供试品检查时不必再

48. 作阳性对照”。该规定仅适用方法验证与供试品检查同时开展的情况。2005年版典和2010

49. 年版典在控制菌检查中均对阳性对照试验有明确规定，“进行供试品控制菌检查时，应做

50. 阳性对照试验。”产品检验中应以典规定为准。

51. 18. 无菌检查和微生物限度检查中，产品中规定的溶解液是否可以换成其他的溶液？

52. 可以。

53. 19. 制剂通则中，没有微生物检查项目的，是否可不进行微生物项目检测？

54. 可以。主要是二部制剂通则中口服片剂、胶囊剂、丸剂和颗粒剂。

55. 20. 在细菌、霉菌和酵母菌计数中，适用性检查细菌是培养48小时，霉菌和酵母菌是培养

56. 72小时，供试品检查中细菌是培养3天，霉菌和酵母菌是培养5天，那方法验证中应

57. 参照哪个时间进行培养。

58. 应按照供试品检验时的条件，即细菌3天，霉菌和酵母菌5天。

59. 21. 测定纯化水微生物限度时，每张滤膜过滤量是多少合适？需要先稀释吗？过滤完后需不

60. 需要冲洗？假如我取10ml纯化水通过双杯体封闭式薄膜过滤器过滤，每张滤膜上的计

61. 数是以5ml为单位还是10ml为单位？

62. 过滤量应以培养后出现的微生物数不超过100cfu/膜为标准。一般可不稀释。不需要冲

63. 洗。每张滤膜的过滤量为5ml。

64. 22. 2010典中关于纯化水的微生物限度是：细菌、霉菌及酵母菌总数每1ml不得过100

65. 个。这句话的意思是细菌总数每1ml不得过100个，霉菌及酵母菌总数不得过100个，

66. 还是细菌+霉菌+酵母菌总数每1ml不得过100个。如果是三者总数的话，那细菌总数
    

B. 什么是无菌检查法

无菌检查法
信息来源：中国药典2000年版二部附录 更新时间：2006-12-10 0:26:46
标题 无菌检查法
附录序号 附录ⅩⅢ
内容全文 B. 无菌检查法
无菌检查法系指检查药品与敷料是否无菌的一种方法。
无菌检查的全部过程应严格遵守无菌操作，防止微生物的污染。
生物制品应按卫生部《生物制品制造及检定规程》中有关无菌检查的规定办理。
培养基及其制备方法
1.需气菌、厌气菌培养基(硫乙醇酸盐液体培养基)
酪胨（胰酶水解）
15g
氯化钠
2.5g
葡萄糖
5g
新鲜配制的0.1％刃天青溶液
1.0ml
L－胱氨酸
0.5g
(或新鲜配制的0.2％亚甲蓝溶液 0.5ml)
硫乙醇酸钠
0.5g
琼酯
0.5～0.7g
(或硫乙醇酸0.3ml)
水
1000ml
酵母浸出粉
5g
除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分加入水内，微温溶解后，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，按量加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.1±0.2，分装，115℃灭菌30分钟。
在无菌检查接种前, 培养基指示剂氧化层的颜色不得超过培养基深度约1/5。否则,须经水浴煮沸加热, 只限加热一次。
2.霉菌培养基
胨
5g
磷酸氢二钾（K2HPO4)
1g
酵母浸出粉
2g
硫酸镁（MgSO4·7H2O）
0.5g
葡萄糖
20g
蒸馏水
1000ml
除葡萄糖外，取上述成分加入水内，微温溶解后，调节pH约6.8，煮沸,加葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节pH值使灭菌后为6.4±0.2，分装，115℃灭菌20分钟。
3.选择性培养基
(1) 对氨基苯甲酸培养基(用于磺胺类药物的无菌检查)
照上述需气菌、厌气菌培养基及霉菌培养基的处方及制法，各加对氨基苯甲酸0.125g，溶解后摇匀，分装，115℃灭菌30分钟。
(2) 吐温培养基(用于油剂药品的无菌检查)
照上述需气菌、厌气菌培养基及霉菌培养基的处方及制法，各加10ml的吐温80，摇匀后，分装，115℃灭菌30分钟。
4.营养肉汤培养基
胨
10g
肉浸液
1000ml
氯化钠
5g
取胨与氯化钠，加入肉浸液内，微温溶解后，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，115℃灭菌30分钟。
5.营养琼脂培养基
照上述营养肉汤培养基的处方及制法，加入15～20g琼脂，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，115℃灭菌30分钟。
6.0.5％葡萄糖肉汤培养基
胨
10g
葡萄糖
5g
氯化钠
5g
肉浸液
1000ml
取胨与氯化钠加入肉浸液内，微温溶解后，调节pH为弱碱性，煮沸，加葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2， 分装，115℃灭菌30分钟。
7.霉菌琼脂培养基
照霉菌培养基的处方及制法，加入15～20g琼脂，调节pH值使灭菌后为6.4±0.2，分装，115℃灭菌20分钟，趁热斜放使凝固成斜面。
上述培养基分别按15ml与40ml分装于试管中，装量约为试管高度的2/5，在115℃灭菌30分钟。细菌培养基经30～35℃培养48小时，霉菌培养基经20～25℃培养72小时后，应无菌生长。
培养基的质量应通过灵敏度检查。
培养基灵敏度检查法
1.菌种
(1)藤黄微球菌(Micrococcus Lutea)[CMCC(B)28001]

(2)生孢梭菌(Clostridium sporogenes)[CMCC(B)64941]
(3)白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001]
2.操作
取藤黄微球菌的营养琼脂斜面和白色念珠菌的霉菌琼脂斜面的新鲜培养物分别用0.9％灭菌氯化钠溶液制成均匀的菌悬液;将生孢梭菌的不含琼脂需气菌、厌气菌培养基的新鲜培养物,吸入灭菌离心管，离心，弃去上清液，菌体用0.9％灭菌氯化钠溶液制成均匀菌悬液。分别取上述菌悬液用0.9％灭菌氯化钠溶液稀释至与细菌浊度标 准管相同的浓度，然后，作10倍系列稀释并计数。

将藤黄微球菌1:10<5>～1:10<8>菌液、生孢梭菌1:10<6>～1:10<9>菌液、白色念珠菌1:10<5>～1:10<8>菌液各1ml,分别接种至9ml试验培养基中,每个稀释度至少接种3管,以未接种的培养基管作对照，细菌试验管置30～35℃培养3天,白色念珠菌试验管置20～25℃培养5天。逐日记录结果。
3.结果判定
以接种后培养基管数的2/3以上呈现生长的最高稀释度为该培养基的灵敏度（且接种菌量均应小于10个），三次试验中，以两次达到的最高灵敏度为判定标准。
需气菌、厌气菌培养基灵敏度为藤黄微球菌1:10<6>；生孢梭菌1:10<7>，霉菌培养基灵敏度为白色念珠菌1:10<6>。
[附注]
肉浸液制备法
取新鲜牛肉，除去肌腱及脂肪，切细，绞碎后,每1000g加水3000ml，充分拌匀，在2～10℃浸泡20～24小时，煮沸1小时，滤过，压干肉渣，补足液量，分装，121℃灭菌30分钟，置冷暗处备用。也可用牛肉浸出粉3g，加水1000ml,配成溶液代替。
对照用菌液
1.金黄色葡萄球菌（Staphylococcus
aureus）菌液
取金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]的营养琼脂斜面新鲜培养物1白金耳，接种至需气菌、厌气菌培养基内,在30～35℃培养16～18小时后，用0.9％灭菌氯化钠溶液稀释成1:10<6>。
2.生孢梭菌（Clostridium sporogenes）菌液
取生孢梭菌[CMCC(B)64941]的需气菌、厌气菌培养基新鲜培养物1白金耳,再接种至相同培养基内，在30～35℃培养18～24小时，用0.9％灭菌氯化钠溶液稀释至1:10<6>。
3.白色念珠菌（Candida albicans）菌液
取白色念珠菌[CMCC(F)98001]的霉菌琼脂培养基斜面新鲜培养物1白金耳,接种至霉菌培养基内，在20～25℃培养24小时后，用0.9％灭菌氯化钠溶液稀释至1:10<5>。
检查法
1. 直接接种法
(1) 供试品如为注射液、供角膜创伤及手术用的滴眼剂或灭菌溶液, 任取供试品2支（瓶）以上，用适当消毒液清洁供试品容器的外表面后,以无菌操作吸取规定接种量的供试品溶液，分别接种于需气菌、厌气菌培养基5管，其中1管接种对照用菌液1ml，供作阳性对照；取1支需气菌、厌气菌培养基管作阴性对照, 另接种于霉菌培养基2管，供试品溶液的每管接种量与培养基的分装量，应根据供试品的装量,按下列规定取用：
供试品装量
每管接种量
培养基分装量
2ml或2ml以下
0.5ml
15ml
2ml以上至20ml
1.0ml
15ml
20ml以上
5.0ml
40ml
接种后轻轻摇动,使匀。需气菌、厌气菌培养基在30～35℃培养5日, 霉菌培养基在20～25℃培养7日，抗生素类药品均培养7日，放射性药品培养5～7日。培养期间应逐日检查是否有菌生长（阳性对照在24小时内应有细菌生长）；如在加入供试品溶液后，培养基出现浑浊或沉淀，经培养后不能从外观上判断时,可取该培养液转种入另1支相同的培养基中或斜面培养基上，培养48～72小时后，观察是否再现浑浊或在斜面上有无菌落生长，并在转种的同时，取培养液少量，涂片制成染色标本，用显微镜观察是否有菌生长。
(2) 供试品如为注射用灭菌粉末或无菌冻干品，照该药品项下的规定或按该药品剂量项下的溶剂用量，加入灭菌水或0.9％灭菌氯化钠溶液,使内容物溶解成均匀的供试品溶液，取规定接种量的供试品溶液，接种于上述培养基中。
(3) 供试品如为供直接分装成注射用无菌粉末的原料药，按各该药品项下的规定制成溶液，依法接种于培养基中。
(4) 供试品如为外科敷料，取供试品2个包装，以无菌操作拆开包装,于不同部位剪取约1cm×3cm的样品，分别接种于40ml培养基中。
(5) 供试品如有抑菌作用或含有抑菌物质时，可选用适宜的培养基，或种入较大量的培养基中，使该供试品稀释至不具有抑菌使用的浓度；或照下述“薄膜过滤法”处理并接种于培养基中。
(6) 供试品如为抗生素药品,取该品种正文中最大规格量的供试品不少于2瓶(支)。原料药按制剂规格项下,取最大规格量2份，分别加入足够使青霉素灭活的无菌青霉素酶溶液适量，摇匀，分别等量接种于每管装量为40ml的培养基中。
(7) 供试品如为放射性药品，取供试品1瓶(支)，以每管接种量为0.2ml，接种于每管装量为7.5ml的培养基中。
2. 薄膜过滤法
(1)供试品如为抗生素药品，取该品种正文中最大规格量的供试品不少于2瓶(支)。原料药按制剂规格项下取最大规格量2份, 分别按该药品项下规定的方法处理后, 加入0.9％灭菌氯化钠溶液至少100ml或其他适宜的溶剂中, 摇匀, 以无菌操作加入装有直径约50mm、孔径不大于0.45±0.02μm微孔滤膜的薄膜过滤器内,减压抽干后,用0.9％灭菌氯化钠溶液或其他适宜的溶剂冲洗滤膜3次,每次至少100ml；取出滤膜,分成4片, 取3片分别放在3管各40ml需气菌、厌气菌培养基中, 其中1管接种对照用菌液1ml,供作阳性对照, 另1片放在霉菌培养基管中。取1支需气菌、厌气菌培养基管作阴性对照。

(2) 供试品如为抗厌氧菌药品，取规定量的供试品，按上述方法经薄膜过滤器处理后，取出滤膜，分成4片，其中3片放在3管需气菌、厌气菌培养基管中，1管接种生孢梭菌对照用菌液1ml，供作阳性对照。另1片放在霉菌培养基管中。 取1支需气菌、厌气菌培养基管作阴性对照。
(3) 供试品如为抗真菌药品，取规定量的供试品,按上述方法经薄膜过滤器处理后,取出滤膜,分成4片，取2片分别放在2管需气菌、厌气菌培养基管中；2片分别放在2管霉菌培养基管中,其中1管接种白色念珠菌对照用菌液1ml，供作阳性对照。取1支需气菌、厌气菌培养基管作阴性对照。
结果判断
当阳性对照管显浑浊并确有细菌生长，阴性对照管阴性时,可根据观察所得的结果判定：如需气菌、厌气菌及霉菌培养管均为澄清或虽显浑浊但经证明并非有菌生长,均应判为供试品合格；如需气菌、厌气菌及霉菌培养管中任何1管显浑浊并确证为有菌生长，应重新取样，分别依法倍量复试，除阳性对照管外，其他各管均不得有菌生长，否则应判为供试品不合格。

C. 无菌要检验方法须进行方法学验证吗

微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法.检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查. 微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度 100级的单向流空气区域内进行.检验全过程必须严格遵守无菌操作,防止再污染,防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出.单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证. 供试品检查时,如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂,应证明其有效性及对微生物无毒性. 除另有规定外,本检查法中细菌及控制菌培养温度为30℃～35℃；霉菌、酵母菌培养温度为23℃～28℃. 检验结果以 1g、1ml、10g、10ml或10cm2 为单位报告,特殊品种可以最小包装单位报告. 检验量检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml 或cm2）. 除另有规定外,一般供试品的检验量为10g 或10ml；膜剂为100cm2；贵重品、微量包装品的检验量可以酌减.要求检查沙门菌的供试品,其检验量应增加20g 或20ml（其中10g或10ml用于阳性对照试验）. 检验时,应从2 个以上最小包装单位中抽取供试品,膜剂还不得少于4 片. 一般应随机抽取不少于检验用量（两个以上最小包装单位）的3 倍量供试品. 供试液的制备根据供试品的理化特性与生物学特性,采取适宜的方法制备供试液.供试液制备若需加温时,应均匀加热,且温度不应超过45℃.供试液从制备至加入检验用培养基,不得超过1 小时. 除另有规定外,常用的供试液制备方法如下. 1.液体供试品取供试品10ml,加pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,混匀,作为1∶10 的供试液.油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80 使供试品分散均匀.水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液. 2.固体、半固体或黏稠性供试品取供试品10g,加pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,用匀浆仪或其他适宜的方法,混匀,作为1∶10 的供试液.必要时加适量的无菌聚山梨酯80,并置水浴中适当加温使供试品分散均匀. 3.需用特殊供试液制备方法的供试品 (1)非水溶性供试品方法1 取供试品5g（或5ml）,加至含溶化的（温度不超过45℃）5g 司盘80、3g 单硬脂酸甘油酯、10g 聚山梨酯80 无菌混合物的烧杯中,用无菌玻棒搅拌成团后,慢慢加入45℃的pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,边加边搅拌,使供试品充分乳化,作为1∶20 的供试液. 方法2 取供试品10g,加至含20ml 无菌十四烷酸异丙酯（采用薄膜过滤法过滤除菌.选用孔径为0.22μm的脂溶性滤膜,在140℃干热灭菌2小时）和无菌玻璃珠的适宜容器中,必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量,充分振摇,使供试品溶解.然后加入45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml,振摇5～10 分钟,萃取,静置使油水明显分层,取其水层作为1∶10 的供试液. (2)膜剂供试品取供试品100cm2,剪碎,加100ml 的pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（必要时可增加稀释液）,浸泡,振摇,作为1∶10 的供试液. (3)肠溶及结肠溶制剂供试品取供试品10g,加pH6.8 无菌磷酸盐缓冲液（用于肠溶制剂）或pH7.6 无菌磷酸盐缓冲液（用于结肠溶制剂）至100ml,置45℃水浴中,振摇,使溶解,作为1∶10 的供试液. (4)气雾剂、喷雾剂供试品取规定量供试品,置冰冻室冷冻约1 小时,取出,迅速消毒供试品开启部位,用无菌钢锥在该部位钻一小孔,放至室温,并轻轻转动容器,使抛射剂缓缓全部释出.用无菌器吸出全部液,加至适量的pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（若含非水溶性成分,加适量的无菌聚山梨酯80）中,混匀,取相当于10g或10ml 的供试品,再稀释成1∶10 的供试液. (5)贴剂供试品取规定量供试品,去掉贴剂的保护层,放置在无菌玻璃或塑料片上,粘贴面朝上.用适宜的无菌多孔材料（如无菌纱布）覆盖贴剂的粘贴面以避免贴剂粘贴在一起.然后将其置于适宜体积并含有表面活性剂（如聚山梨酯80 或卵磷脂）的稀释剂中,用力振荡至少30 分钟,制成供试液.贴剂也可以其他适宜的方法制备成供试液. (6)具抑菌活性的供试品当供试品有抑菌活性时,采用下列方法进行处理,以消除供试液的抑菌活性后,再依法检查.常用的方法如下. ①培养基稀释法 取规定量的供试液,至较大量的培养基中,使单位体积内的供试品含量减少,至不含抑菌作用.测定细菌、霉菌及酵母菌的菌数时,取同稀释级的供试液2ml,每1ml 供试液可等量分注多个平皿,倾注琼脂培养基,混匀,凝固,培养,计数.每1ml 供试液所注的平皿中生长的菌数之和即为1ml的菌落数,计算每1ml 供试液的平均菌落数,按平皿法计数规则报告菌数；控制菌检查时,可加大增菌培养基的用量. ②离心沉淀法 取一定量的供试液, 500 转/分钟离心3 分钟,取全部上清液混合,用于细菌检查. ③薄膜过滤法 见细菌、霉菌及酵母菌计数项下的“薄膜过滤法”. ④中和法 凡含汞、砷或防腐剂等具有抑菌作用的供试品,可用适宜的中和剂或灭活剂消除其抑菌成分.中和剂或灭活剂可加在所用的稀释液或培养基中. 细菌、霉菌及酵母菌计数计数培养基的适用性检查细菌、霉菌及酵母菌计数用的培养基应进行培养基的适用性检查,成品培养基、由脱水培养基或按培养基处方配制的培养基均应检查. 菌种 试验用菌株的传代次数不得超过5 代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0 代）.并采用适宜的菌种保藏技术进行保存,以保证试验菌株的生物学特性. 大肠埃希菌（Escherichia coli）〔CMCC（B） 44 102〕金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）〔CMCC（B） 26 003〕枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）〔CMCC（B） 63 501〕白色念珠菌（Candida albicans）〔CMCC（F） 98 001〕黑曲霉（Aspergillus niger）〔CMCC（F） 98 003〕菌液制备 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中,培养18～24 小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中,培养24～48 小时.上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml 含菌数为50～100cfu 的菌悬液.接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中,培养5～7 天,加入3～5ml 含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80 的0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱.然后,采用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内,用含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80 的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml 含孢子数50～100cfu 的孢子悬液. 菌悬液在室温下放置应在2 小时内使用,若保存在2～8℃可在24 小时内使用.黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃,在验证过的贮存期内使用. 适用性检查 取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各50～100cfu,分别注入无菌平皿中,立即倾注营养琼脂培养基,每株试验菌平行制备2 个平皿,混匀,凝固,置30～35℃培养48 小时,计数；取白色念珠菌、黑曲霉各50～100cfu,分别注入无菌平皿中,立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基,每株试验菌平行制备2个平皿,混匀,凝固,置23～28℃培养72 小时,计数；取白色念珠菌50～100cfu,注入无菌平皿中,立即倾注酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基,平行制备2 个平皿,混匀,凝固,置23～28℃培养72 小时,计数.同时,用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验. 结果判定 被检培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值大于70%,且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致,判该培养基的适用性检查符合规定. 计数方法的验证当建立产品的微生物限度检查法时,应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证,以确认所采用的方法适合于该产品的细菌、霉菌及酵母菌数的测定.若产品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时,计数方法应重新验证. 验证时,按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法及下列要求进行.对各试验菌的回收率应逐一进行验证. 菌种及菌液制备 同计数培养基的适用性检查. 验证方法 验证试验至少应进行3 次独立的平行试验,并分别计算各试验菌每次试验的回收率. （1）试验组 平皿法计数时,取试验可能用的最低稀释级供试液1ml 和50～100 cfu 试验菌,分别注入平皿中,立即倾注琼脂培养基,每株试验菌平行制备2个平皿,按平皿法测定其菌数.薄膜过滤法计数时,取规定量试验可能用的最低稀释级供试液,过滤,冲洗,在最后一次的冲洗液中加入50～100cfu 试验菌,过滤,按薄膜过滤法测定其菌数. （2）菌液组 测定所加的试验菌数. （3）供试品对照组 取规定量供试液,按菌落计数方法测定供试品本底菌数. （4）稀释剂对照组 若供试液制备需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时,应增加稀释剂对照组,以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度.试验时,可用相应的稀释液替代供试品,加入试验菌,使最终菌浓度为每1ml 供试液含50～100cfu,按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数. 结果判断 在3 次独立的平行试验中,稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于70%.若试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）均不低于70%,照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数；若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%,应采用培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法、中和法（表1）等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性,并重新进行方法验证. 表1 常见干扰物的中和剂或灭活方法干扰物 可选用的中和剂或灭活方法 戊二醛 亚硫酸氢钠 酚类、乙醇、吸附物 稀释法 醛类 稀释法、甘氨酸、硫代硫酸盐 季铵类化合物（QACs）、对羟基苯甲酸酯 卵磷脂、聚山梨酯 汞类制剂 亚硫酸氢纳、巯基乙酸盐、硫代硫酸盐 双胍类化合物 卵磷脂 干扰物 可选用的中和剂或灭活方法 干扰物 可选用的中和剂或灭活方法 卤化物 硫代硫酸盐 乙二胺四乙酸（EDTA） 镁或钙离子 磺胺类 对氨基苯甲酸 ?-内酰胺类抗生素 ?-内酰胺酶 若没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作用,那么验证试验中微生物回收的失败可看成是因供试品的抗菌活性引起的,同时表明该供试品不能被试验菌污染.但是,供试品也可能仅对试验用菌株具有抑制作用,而对其他菌株没有抑制作用.因此,根据供试品须符合的微生物限度标准和菌数报告规则,在不影响检验结果判断的前提 下,应采用能使微生物生长的更高稀释级的供试液进行方法验证试验.若验证试验符合要求,应以该稀释级供试液作为最低稀释级的供试液进行供试品检验. 计数方法验证时,采用上述方法若还存在一株或多株试验菌的回收率达不到要求,那么选择回收情况最接近要求的方法和试验条件进行供试品的检验. 验证试验也可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进行. 供试品检查计数方法包括平皿法和薄膜过滤法.检查时,按已验证的计数方法进行供试品的细菌、霉菌及酵母菌菌数的测定. 按计数方法的验证试验确认的程序进行供试液制备.用稀释液稀释成1∶10、1∶102、1∶103等稀释级的供试液. 1.平皿法根据菌数报告规则取相应稀释级的供试液1ml,置直径90mm 的无菌平皿中,注入15～20ml 温度不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基,混匀,凝固,倒置培养.每稀释级每种培养基至少制备2 个平板. 阴性对照试验 取试验用的稀释液1ml,置无菌平皿中,注入培养基,凝固,倒置培养.每种计数用的培养基各制备2 个平板,均不得有菌生长. 培养和计数 除另有规定外,细菌培养3 天,霉菌、酵母菌培养5 天.逐日观察菌落生长情况；点计菌落数.必要时,可适当延长培养时间至7 天进行菌落计数并报告.菌落蔓延生长成片的平板不宜计数.点计菌落数后,计算各稀释级供试液的平均菌落数,按菌数报告规则报告菌数.若同稀释级两个平板的菌落平均数不小于15,则两个平板的菌落数不能相差1 倍或以上. 一般营养琼脂培养基用于细菌计数；玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌及酵母菌计数；酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数.在特殊情况下,若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌、玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌,则应分别点计霉菌和酵母菌、细菌菌落数.然后将营养琼脂培养基上的霉菌和酵母菌数或玫瑰红钠琼脂培养基上的细菌数,与玫瑰红钠琼脂培养基中的霉菌和酵母菌数或营养琼脂培养基中的细菌数进行比较,以菌落数高的培养基中的菌数为计数结果. 含蜂蜜、王浆的液体制剂,用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌数,用酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基测定酵母菌数,合并计数. 菌数报告规则 细菌、酵母菌宜选取平均菌落数小于300cfu、霉菌宜选取平均菌落数小于100cfu 的稀释级,作为菌数报告（取两位有效数字）的依据.以最高的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告1g、1mL 或10cm2 供试品中所含的菌数. 如各稀释级的平板均无菌落生长,或仅最低稀释级的平板有菌落生长,但平均菌落数小于1 时,以＜1 乘以最低稀释倍数的值报告菌数. 2.薄膜过滤法采用薄膜过滤法,滤膜孔径应不大于0.45μm,直径一般为50mm,若采用其它直径的滤膜,冲洗量应进行相应的调整.选择滤膜材质时应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分被截留.滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌.使用时,应保证滤膜在过滤前后的完整性.水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜.油类供试品,其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥.为发挥滤膜的最大过滤效率,应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面.供试液经薄膜过滤后,若需要用冲洗液冲洗滤膜,每张滤膜每次冲洗量不超过100ml,总冲洗量不得超过1000ml,以避免滤膜上的微生物受损伤. 取相当于每张滤膜含1g、1ml 或10cm2 供试品的供试液,加至适量的稀释剂中,混匀,过滤；若供试品每1g、1ml 或10cm2 所含的菌数较多时,可取适宜稀释级的供试液1ml 进行试验.用pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或其他适宜的冲洗液冲洗滤膜,冲洗方法和冲洗量同“计数方法的验证”.冲洗后取出滤膜,菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养.每种培养基至少制备一张滤膜. 阴性对照试验 取试验用的稀释液1ml 照上述薄膜过滤法操作,作为阴性对照.阴性对照不得有菌生长. 培养和计数 培养条件和计数方法同平皿法,每片滤膜上的菌落数应不超过100 个. 菌数报告规则 以相当于1g、1ml 或10cm2 供试品的菌落数报告菌数；若滤膜上无菌落生长,以

D. 纯化水检测需要哪些仪器.设备

基本都是颜色反复应不需制要太多的仪器设备，硝酸盐、不挥发物、重金属检查：水浴锅；微生物限度检查：洁净操作台、薄膜过滤器（抽滤泵）、恒温培养箱2个。净得瑞纯化水设备系统采用RO及EDI纯化水工艺，产水水质满足客户的生产用水要求，符合GMP、FDA等认证要求。
水浴锅主要用于实验室中蒸馏，干燥，浓缩，及温渍化学药品或生物制品，也可用于恒温加热和其它温度试验，是生物、遗传、病毒、水产、环保、医药、卫生、化验室、分析室、教育科研的必备工具。
薄膜过滤器，放式两用无菌检查薄膜滤器。该产品具有两种培养方法通用性的特点。设计合理，滤器过滤部分采用玻璃材质，化学性能稳定，密封度强，有效防止外源性污染，确保菌检成功率。
恒温培养箱又称隔水式电热细胞（霉菌）培养箱，供医疗卫生、医药工业、生物化学、工业生产及农业科学等科研部门作细菌培养、育种、发酵及其他恒温试验用。

E. 中国药典无菌检查法的供试品的无菌检查

检验数量是指一次试验所用供试品最小包装容器的数量。除另有规定外，出厂产品按表1规定；上市产品监督检验按表2、表3规定。表1、表2、表3中最少检验数量不包括阳性对照试验的供试品用量。一般情况下，供试品无菌检查若采用薄膜过滤法，应增加1/2的最小检验数量作阳性对照用；若采用直接接种法，应增加供试品1支（或瓶）作阳性对照用。
（注：《中国药典》2010版三部附录ⅩⅡA无菌检查法为“抽验数量 系指一次试验所用供试品最小包装容器的数量（支或瓶），成品每亚批均应进行无菌检查。除另有规定外，原液、半成品和成品按表1规定，上市产品监督检验按表2规定。 ”） 是指一次试验所用的供试品总量（g或ml）。除另有规定外，每份培养基接种的供试品量按表2、表3规定。若每支（瓶）供试品的装量按规定足够接种两份培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基。采用薄膜过滤法时，检验量应不少于直接接种法的总接种量，只要供试品特性允许，应将所有容器内的全部内容物过滤。
（注：《中国药典》2010版三部附录ⅩⅡA无菌检查法为“接种量 系指每个最小包装的最少取样量（ml或g），接种供试品量按表3规定。若采用直接接种法，按接种量要求等量分别接种至硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基中(两种培养基的接种支（瓶）数之比为2:1);若采用薄膜过滤法，应采用三联薄膜过滤器，其中两联假如硫乙醇酸盐流体培养基，一联加入改良马丁培养基。只要供试品特性允许，应将所有容器内的全部内容物过滤。”） 应根据供试品特性选择阳性对照菌：无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌；抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌；抗厌氧菌的供试品，以生孢梭菌为对照菌；抗真菌的供试品，以白色念珠菌为对照菌。阳性对照试验的菌液制备同方法验证试验，加菌量小于100cfu，供试品用量同供试品无菌检查每份培养基接种的样品量。阳性对照管培养48～72小时应生长良好。
（注：《中国药典》2010版三部附录ⅩⅡA无菌检查法为“以金黄色葡萄球菌为阳性对照菌。供试品用量同供试品无菌检查每份培养基接种的样品量。阳性对照的菌液制备同培养基灵敏度检查项下金黄色葡萄球菌菌液制备方法，加菌量小于100cfu。阳性对照也可在供试品无菌检查14天后，取其中一份硫乙醇酸盐流体培养基，加入小于100cfu阳性对照菌，作为阳性对照。阳性对照置30℃～35℃培养48～72小时应生长良好。”） 供试品无菌检查时，应取相应溶剂和稀释液、冲洗液同法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。
无菌试验过程中，若需使用表面活性剂、灭活剂、中和剂等试剂，应证明其有效性，且对微生物无毒性。
无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法。只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法。供试品无菌检查所采用的检查方法和检验条件应与验证的方法相同。
操作时，用适宜的消毒液对供试品容器表面进行彻底消毒，如果供试品容器内有一定的真空度，可用适宜的无菌器材（如带有除菌过滤器的针头）向容器内导入无菌空气，再按无菌操作起开容器取出内容物。

F. 生物制品的无菌检查法的实验原理，准备工作及操作步骤

1. 目的：建立无菌检查的标准操作规程，确保检验结果的准确性。 2. 范围：适用于本厂质监科化验室对本厂生产的注射剂进行无菌检查。3. 责任：化验员有责任按本操作规程操作，并对检验结果负责。4. 定义：无菌检查法系指检查药品是否无菌的一种方法。5.内容：5. 1无菌操作设备：无菌操作室或超净工作台，无菌衣、口罩、帽子、消毒鞋、酒精灯等。5.1.1无菌室分无菌操作室和缓冲间。在缓冲间内应有洗手盆、干手器、无菌衣放置架及挂钩、拖鞋等。无菌操作室应具有空气除菌过滤的层流装置，局部洁净度100级超净工作台。缓冲间及操作室内均设置能达到空气消毒的紫外光灯和照明灯，操作室或工作台应保持空气正压。5.1.2无菌室应每周和每次操作前用0.1％新洁尔灭或2％甲酚液擦拭操作台及可能污染的死角，开动无菌空气过滤器及紫外光灯杀菌1小时。在每次操作完毕，同样用2％甲酚或0.1％新洁尔灭溶液擦拭工作台面，用紫外光灯杀菌半小 时。5.1.3无菌室的无菌程度检查：无菌室在消毒处理后，无菌试验前及操作过程中需检查空气中菌落数。取直径90mm双碟，在接种室内点燃酒精灯，在酒精灯旁，以无菌操作，将双碟半开注入溶化的营养琼脂培养基约20ml，制成平板：在35-37℃预培养48小时，证明无菌后将3个平板以无菌方式带入无菌操作间的洁净区域左、中、右各放1个；打开碟盖扣置，平板在空气中暴露30分钟后将盖盖好，置35-37℃培养48小时，取出检查，3个平板上生长的菌落数相加总数不得超过10个。 无菌操作台面或超净工作台应定期请有关部门检测其洁净度，应达到100级（一般用尘埃粒子计数仪），检测尘埃粒径≤5μm的粒数不得超过3.5个／升；空气流量应控制在0.75-1.0m3/s；细菌菌落数平均<1个，可根据无菌状况定期置换过滤器。5.1.4无菌室内应准备好盛有消毒用5％甲酚的玻璃缸、酒精灯、火柴、镊子、75％酒精棉及拖鞋等。5.2仪器、用具：5.2.1真空泵、恒温培养箱、生物显微镜、托盘天平（精度0.1g）、抽滤瓶（500ml）、 三角瓶（100、500 ml）、移液管（1、10ml）、注射器（要求规格）、试管、双碟（9cm）、注射针、镊子、剪刀、白金耳、橡皮管、纱布、棉花（原棉）、不锈钢吸管筒、接种环、微孔滤膜（直径约5cm），孔径应在0.45±0.02μm )载玻片、洒精灯、取样勺、吸耳球、喷雾瓶。5.2.2用具的包扎：5.2.2.1移液管在移液管上端管内,松松地塞进少许原棉,然后放入不锈钢灭菌筒内。5.2.2.2试管在管口塞上纱布棉塞。5.2.2.3无菌衣、裤、帽、口罩将洗净的衣裤、帽子、口罩配套后装入布袋，扎紧袋口，再用牛皮纸包好。5.2.2.4注射器洗涤干净的注射器及注射针头装配好后，放入垫有纱布的带盖容器内（饭 第3页/共7页盒）一层层放好，上面盖上纱布，然后盖上容器的盖子，用牛皮纸包好。5.2.2.5滤器 将检验合格后微孔滤膜先有水中浸泡湿润，取出后固定在细菌过滤器的滤板上，滤板下、滤膜上均用耐高温垫圈垫好，上好滤器。在灭菌前滤器的螺勿拧太紧，滤器上口用8层纱布及牛皮纸包扎，装妥后放入容器内，再将盛滤器的容器盖好盖子，用牛皮纸包扎。5.2.3用具的灭菌：将包扎好的用具，在121±0.5℃蒸汽灭菌柜中灭菌30分钟，物品取出时切勿立即置冷处，以免急速冷却灭菌物品内蒸汽冷凝造成负压，易致染菌，应置温箱或或加温烘干。5.3培养基、试剂：5.3.1一般采用商品干燥培养基，临用时按照使用说明书进行配制，需注意培养基的pH值应符合规定，否则必须校正后，灭菌使用。使用前，按要求分装灭菌好的细菌培养基须经30-35℃培养48小时，真菌培养基须经20-25℃培养72小时，证明无菌生长后方可使用。 制备的需气菌、厌气菌培养基应半个月内用完，在供试品接种前，培养基指示剂氧化层的颜色不得超过培养基深度约1/5，否则须经水浴煮沸加热，只限加热一次。5.3.2革兰氏碘液：先用3-5ml蒸馏水溶解2.0g碘化钾，再加入1.0g碘片，搅拌溶解后，加蒸馏水稀释至300ml，摇匀。置密闭棕色瓶中备用。5.3.3结晶紫染色液：将结紫1.0g溶解于20ml95%乙醇中后，与80ml1%草酸铵溶液相混合，静置48小时使用。此液稳定，置密闭的棕色瓶中可储存数月。5.3.4沙黄染色液：将0.2g沙黄溶解于10ml95%乙醇中，待完全溶解后再加蒸馏水至100ml。5.3.5生理盐水：称取9g氯化钠，加水1000ml溶解，分装后于121±0.5℃湿热灭菌30分钟。供作稀释剂用。 第4页/共7页5.3.6 75%乙醇量取无水乙醇75ml,加水稀释至100ml，摇匀，即得。5.3.7 0.1%新洁尔灭：量取5%新洁尔灭20ml，加水稀释至约1000ml，摇匀，即得。5.4培养基灵敏度检查：5.4.1新购的干燥培养基或采用不同牌号原材料的新鲜培养基，其质量均应符合灵敏度检查要求。 (1)取藤黄微球菌[Micrococcus luteus CMCC（B） 28001］的营养琼脂斜面和白色念珠菌[Candida albicans CMCC（F）98001］的真菌培养基琼脂斜面的新鲜培养物，分别用0.9%无菌氯化钠溶液制成均匀的菌悬液；取生孢梭菌[Clostridium sporogenes CMCC（B）64941]不含琼脂的需气、厌气培养基新鲜培养物，用灭菌毛细管将其吸至灭菌离心管内，离心，弃去上清液，沉淀菌体用0.9%无菌氯化钠溶液制成均匀菌悬液。然后以10倍系列稀释后，制成1ml中含10-100个菌并计数。 (2)取藤黄微球菌、生孢梭菌的需气、厌气培养基新鲜培养物，白色念珠菌的真菌培养基琼脂斜面的新鲜培养物，取接种至霉菌培养基内，20-25℃用0.9%无菌氯化钠溶液作10倍稀释，制成1ml中含10-100个菌并计数。 将藤黄微球菌的上述(1)或(2)的稀释液各1ml，分别接种至每管装量为9ml的需气、厌气菌培养基3管，生孢梭菌的上述(1)或(2)的稀释液各1ml，分别接种至每管装量为12ml的需气、厌气菌培养基3管，白色念珠菌的上述(1)或(2)的稀释液各1ml，接种至每管装量为9ml的真菌培养基3管，以未接种的培养基作对照，按规定的温度培养5天并逐日记录结果。结果判定：以每株菌接种后的培养基不得少于2管呈现生长，即该培养基的灵敏度检查符合要求。5.4.2配制的培养基应在凉暗处保存，一般不得超过2周，临用前细菌和霉菌培养基分别经30-35℃和20-25℃培养不少于48小时和72小时，证明无菌生长后方可使用。5.4.3需气菌、厌气菌培养基在试管中装量高度不得少于7Cm，其指示剂氧化层不得超过培养基深度的1／5，否则须经水浴煮沸10分钟，但只限加热一次。 第5页/共7页无菌试验培养时间结束时，指示剂氧化层应不超过培养基深度的1／2。5.5对照用菌液的制备：5.5.1试验用菌种、菌种的复苏、菌种的接种与保存等均应按照“抗生素微生物检定法”标准操作规程项下操作。5.5.2金黄色葡萄球菌菌液用接种环取金黄色葡萄球菌[Staphy-lococcus aureus CMCC（B）26003]的营养琼脂斜面新鲜培养物少许，接种至营养肉汤培养基内，在30-35℃培养16-18小时后，用灭菌生理盐水稀释成1:1065.5.3生孢梭菌菌液用接种环取生孢梭菌[CMCC（B）64941]的需气菌、厌气菌培养基新鲜培养物1白金耳，接种至相同培养基内，在30-35℃培养18-24小时后，用灭菌生理盐水稀释成1:106。5.5.4白色念珠菌菌液用接种环取白色念珠菌[CMCC（F）98001]的真菌琼脂培养基斜面新鲜培养物1白金耳，接种至真菌培养基内，在20-25℃培养24小时后，用灭菌生理盐水稀释成1:105。5.5.5上述制备的菌液，一般当日使用。5.6进入无菌室的操作要点：5.6.1根据试验程序,将用具物品搬入缓冲间,打开紫外光灯和空气过滤装置并使其工作1小时以上。5.6.2操作人员用肥皂水刷洗双手,关闭缓冲间紫外光灯,进入缓冲间内,关闭第一层门,用2%来苏尔或0.1%新洁尔灭溶液洗双手,用消毒毛巾擦干,换上无菌衣、帽、口罩及消毒鞋。5.6.3关闭无菌室内紫外光灯，进入第二层门并将用具搬至无菌室内，关闭无菌室门。5.6.4凡进入无菌室后不应再外出取物品，因此，在每次试验中所用物品必须计划好，并准备好备用物品。从进入第一层门直至无菌室内，随操作人员的进入应喷雾2%来苏尔或0.1 %新洁尔灭溶液。5.7检查法：5.7.1无菌检查法包括：直接接种法和薄膜过滤法。前者适用于非抗菌作用的供试品；后者适用于有抗菌作用的或大容量的供试品。5.7.2操作时，应先用0.1%新洁尔灭浸泡或擦拭容器表面后，以无菌的方法取 第6页/共7页内容物。5.7.3凡无菌检查中，均应取相应溶剂和稀释剂同法操作，作阴性对照。5.7.4供试品制备： 用灭菌镊取出注射器，在火焰旁将针芯插入针管并安上针头，盖为橡皮塞时，用注射器在已消毒好的橡皮塞中心位置刺入吸取药液。按规定须稀释或灭活的供试品，可直接或将瓶内供试液抽出至灭菌玻璃容器内进行灭活处理并稀释至规定的体积和浓度；抽取瓶中内容液体时，应将供试品倒置并使针头在液面下。5.7.5直接接种法：按规定量取供试品，以无菌操作将该供试品分别接种于需气菌、厌气菌培养基6管，其中1管接种金黄色葡萄球菌液1ml，作阳性对照，另接种于真菌培养基5管。轻轻摇动，使供试品与培养基混合。需气菌、厌气菌培养基管置30-35℃、真菌培养基管置20-25℃培养7日。在培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。阳性对照管在24小时内应有菌生长，如在加入供试品后，培养基出现浑浊，培养7天后，不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中或斜面培养基上继续培养，细菌培养2日，真菌培养3日，观察是否再出现浑浊或斜面有无菌生长，或用接种环取培养液涂片，染色，用显微镜观察是否有菌。5.7.6薄膜过滤法： 将微孔滤膜过滤装置、抽滤瓶、排气管与真空泵相连，真空泵可置无菌室外。取规定量供试品，按规定的方法处理后，加入0.9%无菌氯化钠溶液100ml中，混合后，通过装有孔径不大于0.45μm 的薄膜过滤器，减压抽干后，用0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜3次，每次至少100ml，取出滤膜分成3等份，分别加入上述二种培养基中，按规定温度和时间培养。阳性对照管应根据供试品特性加入相应对照菌液1ml（抗细菌药物，以金黄色葡萄球菌为对照菌；抗厌氧菌药物，以生孢梭菌为对照菌；抗真菌药物，以白色念珠菌为对照菌）。阳性对照管细菌应在培养24-48小时，真菌应在培养24-72小时有菌生长。5.8结果判断： 第7页/共7页当阳性对照管显浑浊并确有菌生长，阴性对照管呈阴性时，可根据观察所得的结果判定：如需气菌、厌气菌及真菌培养基管均为澄清或虽浑浊但经证明并非有菌生长，均应判为供试品合格；如需气菌、厌气菌及真菌培养基管中任何1管显浑浊并确证有菌生长，应重新取2倍量供试品，分别依法复试，除阳性对照管外，其他各管均不得有菌生长，否则应判为供试品不合格。6 培训6.1 培训对象：化验员。6.2 培训时间：二小时。7 记录 记录名称 保存部门 保存时间 无菌检验记录 质监科 药品有效期后一年 QF-01-007-00无 菌 检 验 记 录品 名： 批 号： 规 格： 检验日期： 年 月 日培养基名称需气、厌气菌培养基真菌培养基培养培养温度30—35℃20—25℃培养时间管 号1234512345培养天数及结果1234567结 论备 注 复核人： 检验人：

G. 无菌检查薄膜过滤器需要用0.22um滤膜吗

1、灭菌方法
培养基的灭菌方法主要有两种，高压除菌及0.22um微孔滤膜过滤除菌。与过滤相比，高压灭菌的工作强度小，成本较低，但易造成营养成分的流失，而且在多次加样（无菌谷氨酰胺溶液，无菌碳酸氢钠溶液等）过程中容易造成二次污染。大多数培养基采用0.1～0.2μm孔径的微孔滤膜进行过滤灭菌，并且已成为培养基除菌的发展方向，它可低限度地减少培养基的营养损失。
1.1 高压灭菌

某些培养基（如MEM）可进行高压灭菌，例如清大天一的MEM培养基中的MD605、MD609等。这类培养基一般不含有L-谷氨酰胺和碳酸氢钠，一般是在培养基高压灭菌后加入L-谷氨酰胺和碳酸氢钠的无菌的液体。另外可高压的谷氨酸盐（如L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）可代替L-谷氨酰胺。
可高压灭菌的培养基在121℃、15psi，15分钟的条件下完全可达到灭菌效果及营养成分的最小损失，不需将灭菌时间延长。为保证高压灭菌的效果，灭菌设备的验证很关键。
1.2 过滤灭菌
可供过滤灭菌使用的滤膜很多，其材料多为polyethersulphone（PES）、尼龙、多聚碳酸盐、醋酸纤维素、硝酸纤维素、PTFE、陶瓷等。一般情况下采取正压过滤，正压过滤较之负压过滤具有流速高、过滤快、不易污染，可避免蛋白质产生大量气泡等优点。一般使用过滤器可参照各供应商的产品说明书。
目前大多数实验室和制采用微孔滤膜滤器（如Zeiss滤器）或立式微孔滤器（Millipore、Pall）除菌。微孔滤膜滤器为不锈钢，中间可夹放0.22um滤膜。使用这种滤器最重要步骤是安装滤膜及无菌过滤过程。如在使用Zeiss滤器时，先要用培养用水将滤膜充分润湿，在安装滤膜时可在其上放置一层定性滤纸再固定。消毒时旋钮不要扭太紧，凡与空气接触部位都要包好（可用牛皮纸、纱布、无纺布等）；高压灭菌后，在无菌环境中立即将旋钮扭紧。过滤除菌结束后，要打开滤器，检查滤膜是否完整，如果滤膜破裂，需重新进行过滤除菌过程。立式微孔滤器可以选用不同的微孔滤柱体积，因为滤膜的折叠，膜面积显著增大，液体处理量大，而且不容易发生堵塞现象。

H. 生物制品的无菌检查法的实验原理，准备工作及操作步骤

文献资料 - 医学书籍 - 中国生物制品规程
生物制品无菌试验规程

生物制品不得含有杂菌（有专门规定者除外），灭活菌苗、疫苗不得含有活的本菌、本毒。在制造过程中应由制造部门按各制品制造及检定规程规定进行无菌试验，分装后的制品须经质量检定部门做最后检定。各种生物制品的无菌试验除有专门规定者外，均应按照本规程的规定进行。

1抽样

1.1原液及半成品

原液及半成品应每瓶分别进行无菌试验，其抽样量应至少为0.1%，但不得少于1.0ml。

1.1.1大罐稀释的制品抽样数量不得少于10ml。

1.1.2原液及半成品每开瓶一次，应如上法抽验。

1.2成品

每亚批均应进行无菌试验，样品应随机抽取，应具有代表性（包括分装过程的前、中、后样品）。

1.2.1分装量在100支（瓶）或以下者抽检不少于5支，101～500支（瓶）者抽检不少于10支（瓶），501～10000支（瓶）者抽检不少于20支（瓶，10001支（瓶）以上者抽检40支（瓶）。

1.2.2每瓶装量20ml以上的冻干血液制品，每柜冻干200瓶以下者抽检2瓶，200瓶及以上者抽检4瓶。6～20ml抽检量加倍。5ml和5ml以下者按1.2.1项抽检。

1.3凡规定需作支原体检查的制品，均应在半成品时按亚批进行检查，成品可不再做。

2无菌试验用培养基（培养基处方可附录1）

2.1检查制品中本菌是否存活应采用适于本菌发育生长的培养基（在半成品时检查，有专门规定者除外）。

2.2检查需氧性和厌氧性杂菌应采用硫乙醇酸盐培养基。检查不含汞类防腐剂制品中的需氧性和厌氧性杂菌时，该培养基中可不加硫乙醇酸盐。

检查霉菌和腐生菌应采用改良马丁培养基。

检查混浊制品可采用不含琼脂的硫乙醇酸盐培养基。检查活菌苗时可加大琼脂含量，做成斜面。

2.3检查支原体应采用猪胃消化液半固体或牛心消化液半固体培养基。

2.4生物制品无菌试验用培养基亦可用经检定合格的干燥培养基配制。

2.5无菌试验培养基的灵敏度，乙型溶血性链球菌（32210株）应达到10-8，短芽胞杆菌（7316株）和生孢子梭状芽胞杆菌（64941株）应达到10-7，白色念珠菌（ATCc 10231）和腊叶芽枝霉应达到10-6。

2.6生物制品无菌试验培养基由质量检定部门与培养基制造部门会同进行灵敏度试验。每当更换主要原材料时，应进行灵敏度试验，合格后方可应用（灵敏度试验法见附录2、3）。

2.7各生产单位的质量检定部门应定期抽检无菌试验培养基的灵敏度，检定所应定期抽检各所的无菌试验培养基。

3无菌试验方法

3.1无菌试验取样、移种等全部操作，应在无菌操作室内或无菌条件下进行，无菌操作室应经常保持清洁，在每次操作前，应彻底消毒。

3.2菌苗、疫苗、类毒素、抗毒素类制品及粘稠不易过滤的血液制品应用直接接种法进行无菌试验。人白蛋白及人丙种球蛋白（包括各种剂型及应用途径的制品）应用薄膜过滤法进行无菌试验，其他血液制品亦可用薄膜过滤法或直接接种法进行。

3.3直接接种法

3.3.1菌苗、疫苗、类毒素、抗毒素类制品

3.3.1.1每安瓿装量5.0ml以上者（不含5.0ml）取样不应少于1.0ml，装量在5.0ml以下者（含5.0ml）取样不得少于0.5ml，装量不足0.5ml者，全部吸取。

3.3.1.2含防腐剂的制品，接种量与培养基的比例：用苯酚或氯仿作防腐剂者至少为1:20，用汞作防腐剂者或制品内含有甲醛、抗生素者至少为1:50。先按此比例接种于硫乙醇酸盐培养基内增菌，于20～25℃培育3～4天后移种至硫乙醇酸盐培养基、适宜的琼脂斜面、改良马丁培养基各2管，每管0.5ml。将硫乙醇酸盐培养基、适宜的琼脂斜面各1管置30～35℃培育，其余各管置20～25℃培育，培育时间除有专门规定者外共为8天。

3.3.1.3不含防腐剂制品，装量在5.0ml以下者（包括5.0ml）每10支安瓿混合，装量在5.0ml以上者每7支安瓿混合，将混合后的样品直接接种一组培养基，分别置20～25℃、30～35℃培育，培育时间共为8天。

作者：天使也美丽 2006-2-24 16:39 回复此发言

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2 生物制品无菌试验规程

3.3.1.4支原体培养基临用时将半固体煮沸10～15分钟后，冷却到56℃左右，加入未灭能马血清或灭能小牛血清和酵母浸液（培养基、血清、酵母浸液之比为7:2:1），并可酌情加入适量青霉素或醋酸铊，充分摇匀，等冷至35～37℃时种入待检样品0.5～1.0ml，共接种2支培养基，置35～37℃培育14天。

3.3.1.5 混浊和接种后不能判定结果的制品，可取规定量的样品接种于不含琼脂的硫乙醇酸盐培养基（200ml）内进行增菌培养，3～4天后移种。培养基种类和支数、培育温度同3.3.1.2项，共培育8天后判定结果。

3.3.2血液制品

3.3.2.1取规定抽样数，按下列规定，从每瓶抽取样品，并全部接种完。

样品每瓶装量不足1.0ml者，抽取全量，1～20ml以下者（不含20ml），抽取1.0ml以上，每支装量为15ml的培养基，接种1.0ml。

样品每瓶装量以下者（不含）抽取5.0ml以上,100ml及以上者按15%抽样，每支装量为40ml的培养基，接种5.0ml。

应接种的培养基支数依取样的总量而定。接种硫乙醇酸盐培养基与改良马丁培养基支数之比为2:1。

接种后将硫乙醇酸盐培养基总支数的1/2置30～35℃培育，其余置20～25℃培育，改良马丁培养基置20～25℃培育，培育时间不少于14天。

3.4薄膜过滤法

滤膜孔径为0.22～0.3μm。

取规定抽检样品数，每瓶装量100ml及100ml以下者取全量，100ml以上者取半量加入灭菌薄膜过滤器内，加压或减压过滤。如为含汞防腐剂者，在样品过滤后，应用灭菌生理盐水或其他适宜溶剂冲洗滤膜3次，每次100ml。过滤后，无菌取出滤膜，分别放入硫乙醇酸盐培养基2支及改良马丁培养基1支（每支装量不少于40ml，高度不得低于7cm）。如果使用一个过滤装置，则将该膜剪成三等分，分别放入规定培养基中。将滤膜放入培养基后，一支硫乙醇酸盐培养基置30～35℃培育，其余各支培养基置20～25℃培育。培育时间不少于7天。

最好采用全封闭式一次性微孔过滤集菌器，要求每支培养器培养装量为100ml。

3.5检查厌氧性杂菌用培养基需加热驱氧者，必须冷却到45℃以下再行接种。

3.6冻干制品按使用说明书或瓶签规定的稀释量稀释后进行无菌试验。

4判定

4.1无杂菌生长判为合格（有专门规定者除外）。

4.2无菌试验发现杂菌生长，可复试。该制品量应加倍。若复试仍有同样杂菌生长，该制品判为不合格。如为不同杂菌生长，可第二次复试，复试样品为第一次复试量的2倍，若仍有杂菌生长该制品判为不合格。支原体阳性者不复试，该批制品判为不合格。

4.3成品无菌试验不合格的亚批数占整批的30%以上时，由质量检定部门会同有关部门根据具体情况，全部或部分废弃。

附录 1无菌试验培养基处方

1硫乙醇酸盐培养基

胰酪蛋白胨（或酪素胰酶消化液，以总氮计2000mg） 15g
酵母浸出粉（或酵母透析液200ml） 5g
葡萄糖
5g

氯化钠
2.5g

L-胱氨酸（或半胱氨酸盐酸盐）
0.5g

硫乙醇酸钠（或硫乙醇酸0.6ml）
0.5g

琼脂
0.65～0.75g

新鲜配制的0.1%刃天青溶液（或0.2%美蓝溶液0.5ml）
1.0ml

去离子水（或蒸馏水）
加至1000ml

最后pH7.1±0.2

2硫乙醇酸盐培养基（不含琼脂）

胰酪蛋白胨（或酪素胰酶消化液，以总氮计2000mg）
15g

酵母浸出粉（或酵母透析液200ml）
5g

葡萄糖
5g

氯化钠
2.5g

L-胱氨酸（或半胱氨酸盐酸盐）
0.5g

硫乙醇酸钠（或硫乙醇酸0.6ml）
0.5g

去离子水（或蒸馏水）
加至1000ml

最后pH7.1±0.2

3 改良马丁培养基

葡萄糖
20g

蛋白胨
5g

酵母浸出粉（或酵母透析液100ml） 2g

磷酸氢二钾
1g

硫酸镁（含7分子结晶水）
0.5g

去离子水（或蒸馏水）

I. 纯化水取样后多长时间内检验微生物

您的意思应该是说在纯化水微生物限度测试的取样中，是不是必须在洁净区的取样口进行。其实这种说法是错误的，主要是你取样的合法性，一般我们都按检验检测取样规程来操作，无菌瓶取样就可以了。
薄膜过滤法,计数,每1ml纯化水不得过100个,具体方法：
1、大肠菌群的检查：取含培养基10
ml的乳糖胆盐发酵管若干支,分别加入供试水样1 ml.另取乳糖胆盐发酵培养基管1支加1ml洗液为阴性对照组,于36±1℃培养18～24
h.阴性对照应无菌生长.供试品乳糖胆盐发酵管若无菌生长,或有菌生长但不产酸产气或产酸不产气,判该管未检出大肠菌群.
2、霉菌及酵母菌计数：纯化水取水样1ml,均做平行,并做阴性对照,经直径为50 mm、孔径0.45μm 的薄膜过滤器过滤,小心取出滤膜,菌面向上贴于玫瑰红钠培养基平板上,将培养皿倒置于培养箱中,于23～28℃培养5天（可延长到7天）,菌落计数；
细菌计数：纯化水取水样1 ml,并做阴性对照,经直径为50 mm、孔径0.45μm 的薄膜过滤器过滤,小心取出滤膜,菌面向上贴于营养琼脂培养基平板上,将培养皿倒置于培养箱中,于30～35℃培养72 h,菌落计数
3、判定标准：纯化水每片滤膜上微生物菌落总数不超过100 cfu,不得检出大肠菌群

J. 微生物薄膜过滤法，夹膜技巧

（1）验证试验方法：试验原理同前述薄膜过滤法。验证供试品对薄膜过滤法有抑细菌和抑真菌特性时，与实际的无菌检查相同，在同一型号的每个过滤器或过滤筒内过滤规定定量的供试品（容器数及每容器的过滤体积），用淋洗液淋洗滤膜至少3次，每次淋洗液体积为100ml，在最后一次淋洗液中，接入验证用菌种（接种量为10—100CFU）；另取一过滤器或滤筒，不过滤供试品，重复以上淋洗操作，作为阳性对照。根据具体情况，可将整张滤膜或半张滤膜转移至100ml的指定验证用培养基内，或将培养基加入到装有滤膜的滤筒内。分别对表中所列菌种及相应的培养基逐一进行验证，并将容器置于适当的温度下培养，培养时间不超过14d。如果使用新的滤膜或滤过器（包括不同厂家或批号、型号），则要按上述薄膜过滤法的要求做 , 组试验，即样品试验组、蛋白胨对照组和阳性对照组重新进行验证确认。
（2）验证结果评价：如果供试品培养基容器内的培养基内明显可见微生物生长（混浊），并且与阳性对照容器内的培养结果相似，则在无菌检查试验中必须要过滤与验证试验相等量的供试品、淋洗液，淋洗相同次数及使用同量的培养基。如果与阳性对照容器内的培养结果相比，供试品容器内微生物生长现象不明显，则说明该检验量在此检验条件下有抑菌作用。应增加淋洗次数，重复以上实验。也可通过更换过滤膜并使用中和剂来消除产品的抑菌作用。USP规定，如果已淋洗了5次，并且每次淋洗液体积达到500ml，仍无法中和膜上的残余抑菌性物质，那么在无菌检查试验中就采用此淋洗次数与淋洗量作为最终淋洗方法。