氨基酸分析仪阳离子交换柱

A. 什么是氨基酸的离子交换

离子交换层析 (ion exchange chromatography，简称ICE)是分析和制备样品混合物的液-固相层析方法，是基于待测物质的阳离子或阴离子和相对应的离子交换剂间的静电结合，即根据物质的酸碱性、极性等差异，通过离子间的吸附和脱吸附原理将电解质溶液各组分分开。它是从复杂混合物体系中分离性质极为相似的生物分子的有效手段之一。由于带电荷不同的各种物质对离子交换剂有不同亲和力，通过改变洗脱液的离子强度和pH值，控制这种亲和力，即可使这些物质依据亲和力大小顺序依次从层析柱中洗脱下来。

氨基酸是两性电解质，分子 上的净电荷取决于氨基酸的等电点和溶液的pH值，各种氨基酸分子结构不同，在同一pH值时所带电荷的性质(正、负)和多少不同，与离子交换树脂的亲和力有差异，因此可根据亲和力从小到大的顺序被洗脱液分别洗脱下来，达到分离的效果。

三、仪器与试剂

(一)实验器材

(1)玻璃层析柱

(2)试管

(3)移液管

(4)恒压洗脱瓶

(5)部分收集器

(6)水浴锅

(7)分光光度计

(8)电炉

(二)材料与试剂

(1)苯乙烯磺酸钠型树脂(100~200目)

(2)2mol/L盐酸溶液

(3)2mol/L氢氧化钠溶液

(4)标准氨基酸溶液：将天门冬氨酸和赖氨酸分别配成2mg/mL的0.1mol/L盐酸溶液。

(5)混合氨基酸溶液：将上述天门冬氨酸和赖氨酸溶液按1：4比例混合。

(6)柠檬酸-氢氧化钠-盐酸溶液(pH5.8，钠离子浓度0.45mol/L)：取柠檬酸14.25克、氢氧化钠9.30克分别溶于水后混合，加入浓盐酸5.25毫升，定容至500毫升;4℃冰箱保存。

(7)显色剂：2克水合茚三酮溶于95%乙醇中，加水至100毫升。

B. 全自动氨基酸分析仪的操作方法

测定样品中各种游离氨基酸含量，可以除去脂肪杂质后，直接上柱进行分析。
测定蛋白质的氨基酸组成时样品必须经酸水解，使蛋白质完全变成氨基酸后才上柱进行分析。 经过处理后的样品上柱进行分析。上柱的样品量根据所用自动分析仪的灵敏度来确定。一般为每种氨基酸0.1μmol 左右（水解样品干重为0.3mg 左右）。测定必须在pH5～5.5、100℃下进行，反应进行时间为10～15min，生成的紫色物质在570nm 波长下进行比色测定。而生成的黄色化合物在440nm 波长下进行比色测定。做一个氨基酸全分析一般只需1h 左右，同时可将几十个样品一起装入仪器，自动按序分析，最后自动计算给出精确的数据。仪器精确度在±1～3%。用阳离子交换柱分离及测定氨基酸所的如下图

C. 氨基酸分析仪的优缺点

采用经典的阳离子交换色谱分离、茚三酮柱后衍生法，对蛋白质水解液及各种游离氨基酸的组分含量进行分析。仪器基本结构同普通hplc相似，但针对氨基酸分析进行了细节优化（例如氮气保护、惰性管路、在线脱气、洗脱梯度及柱温梯度控制等等）
通常细分为两种系统：蛋白水解分析系统（钠盐系统）和游离氨基酸分析系统（锂盐系统），利用不同浓度和ph值的柠檬酸钠或柠檬酸锂进行梯度洗脱。其中钠盐系统一次最多分析约25种氨基酸，速度较快，基线平直度好；锂盐系统一次最多分析约50种氨基酸，速度较慢，基线一般不如钠盐系统好。
分析效果：从目前已知的氨基酸分析方法比较来看，除灵敏度（即最低检测限）比hplc柱前衍生方法稍低以外（hplc：<0.5pmol；氨基酸分析仪：<10pmol)，其他如分离度、重现性、操作简便性、运行成本等方面，都优于其他分析方法。

D. 在强酸型阳离子交换柱上天冬氨酸，组氨酸，亮氨酸等几种氨基酸的洗脱顺序及原因。

洗脱顺序先后依次是：天冬氨酸、亮氨酸、组氨酸。
原因：氨基酸与阳离子交换树回脂的静电引力大小答依次是 碱性氨基酸＞中性氨基酸＞酸性氨基酸，所以洗脱的顺序就先是酸性氨基酸，然后是中性氨基酸，最后是碱性氨基酸。
天冬氨酸属于酸性氨基酸，组氨酸属于碱性氨基酸，亮氨酸属于中性氨基酸。
详见《生物化学》王镜岩 第三版 上册 153页

E. 离子交换柱层析法分离氨基酸实验装柱有哪些注意事项

氨基酸的分离鉴定——纸层析法
一,实验目的
掌握氨基酸纸层析的方法和原理,学会分析待
测样品的氨基酸成分.
二,实验原理
纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析.滤纸纤维上的羟基具有亲水性,吸附一层水作为固定相,有机溶剂为流动相.当有机相流经固定相时,物质在两相间不断分配而得到分离.
溶质在滤纸上的移动速度用Rf值表示:
Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离
在一定的条件下某种物质的Rf值是常数.Rf值的大小与物质的结构,性质,溶剂系统,层析滤纸的质量和层析温度等因素有关.本实验利用纸层析法分离氨基酸.
三,实验器材
(1)大烧杯(5000mL):1只/组
(2)微量注射器(100 L):1只/ 组.
(3)喷雾器:公用.
(4)培养皿:1只/组.
(5)层析滤纸(长22cm,宽14cm的新华一号滤纸):1张/组.
(6)直尺,铅笔:自备.
(7)电吹风:1只/组.
(8)托盘,针,白线:1套/组.
(9)手套:1双/组.
(10)塑料薄膜:公用.
(11)小烧杯:50mL,1只/组.
四,实验试剂
(1)扩展剂:将4体积正丁醇和1体积冰醋酸放入分液漏斗中,与5体积水混合,充分振荡,静置后分层,弃去下层水层.
(2)氨基酸溶液:0.5%的已知氨基酸溶液3种(赖氨酸,苯丙氨酸,缬氨酸),0.5%的待测氨基酸液1种.
(3)显色剂:0.1%水合茚三酮正丁醇溶液.
实验试剂
五,实验操作
检查培养皿是否干燥,洁净;若否,将其洗净并置于干燥箱内120℃烘干.
(1)平衡:剪一大块塑料薄膜铺在桌面上,将层析缸或大烧杯到置于塑料薄膜上,再把盛有约20mL展层溶液的小烧杯置于倒置的层析缸或大烧杯中,用塑料薄膜密封起来,平衡20min.
(2)规划:带上手套,取宽约14cm,高约22cm的层析滤纸一张.在纸的下端距边缘2cm处轻轻用铅笔划一条平行于底边的直线A,在直线上做4个记号,记号之间间隔2cm,这就是原点的位置.另在距左边缘1cm处画一条平行于左边缘的直线B,在B线上以A,B两线的交点为原点标明刻度(以厘米为单位),参见左图.
(3)点样:用微量注射器分别取10mL左右的氨基酸样品(每取一个样之前都要用蒸馏水洗涤微量注射器,以免交叉污染),点在这四个位置上.挤一滴点一次,同一位置上需点2～3次,2～3mL/次,每点完一点,立刻用电吹风热风吹干后再点,以保证每点在纸上扩散的直径最大不超过3mm.每人须点4个样,其中3个是已知样,1个是待测样品.
(4)层析:用针,线将滤纸缝成筒状,纸的两侧
边缘不能接触且要保持平行,参见图3-3.向培养皿中加入扩展剂,使其液面高度达到1cm左右,将点好样的滤纸筒直立于培养皿中(点样的一端在下,扩展剂的液面在A线下约1cm),罩上大烧杯,仍用塑料薄膜密封.当扩展剂上升到A线时开始计时,每隔一定时间测定一下扩展剂上升的高度,填入表3-1中.当上升到15～18cm,取出滤纸,剪断连线,立即用铅笔描出溶剂前沿线,迅速用电吹风热风吹干.
(5)显色:用喷雾器在通风厨中向滤纸上均匀喷上0.1%茚三酮正丁醇溶液,然后立即用热风吹干,即可显出各层析斑点,参见左图.
(6)计算各种氨基酸的Rf值,并判断混合样品中都有哪些氨基酸,各人将自己的实验结果贴在实验报告上,见表3-2.
(7)以层析时间为横坐标,扩展剂上升高度为纵坐标画图,求出扩展剂上升到18cm时所需要的时间.
(8)将微量注射器内外用蒸馏水清洗干净,倒掉用过的展层液和平衡液,将培养皿洗净,整理好桌面上的仪器和试剂

F. 氨基酸分析仪的介绍

氨基酸分析仪是一种分析仪器，采用经典的阳离子交换色谱分离、茚三酮柱后衍生法，对蛋白质水解液及各种游离氨基酸的组分含量进行分析。

G. 在强酸性阳离子交换柱上asp，his及leu等几种氨基酸的洗脱顺序如何为什么

依次是：精氨酸Asp，赖氨酸Leu，组氨酸His
因为他们的碱性，也就是携带正电荷的能力，或者说电离成阳离子的能力，由强到弱是这个顺序。

H. 氨基酸用离子交换柱，色谱柱为什么需要平衡啊

如果你用的是一般的液相色谱仪，需要很长的时间平衡柱子和系统，因为离子交换柱对流动相中的离子很敏感，一般的液相色谱仪内壁是金属的，多会产生离子或静电荷，对分析造成干扰。推荐用离子色谱仪，或氨基酸分析仪，不过也要平衡一定的时间

I. 氨基酸分析仪的色谱柱是什么填料的寿命大概能有多久能自己装填吗

您好来，我是德国曼默博尔公司自的工程师。
氨基酸分析的色谱柱填料主要是苯乙烯-二乙烯苯聚合后磺化成的磺酸型强酸性阳离子交换树脂。
其实，色谱柱寿命主要看自己使用时候保护的怎么样：包括样品前处理是否规范，维护保养是否充分等。一般注意点使用的话，保证柱效的情况下，寿命能保证在1万-2万针左右，多的话也有可能，看你怎么用了。有的厂家会吹嘘能到6万针，简单计算下氨基酸分析一个样大概得1小时左右，除去维护时间，一天最多跑个20针，一年也就6000针左右，10年才能跑完6万针，到时候仪器报废没报废都不知道，别说色谱柱了。
色谱柱的装填是非常需要经验和技巧的活儿，而且装色谱柱得需要非常专业的色谱柱装柱机。比如装色谱柱的时候得用恒压泵装，一般实验室仪器都配置的是恒流泵，恒流泵装出来的柱子填料很容易就塌了。而且前期的填料清洗、匀浆等都非常需要经验，要是自己装估计很难，一般得找专业的色谱柱工程师装填最好。
希望对您有帮助，记得给分

J. 全自动氨基酸分析仪的工作原理

测定原理是利用样品各种氨基酸组分的结构不同、酸碱性、极性及分子大小不同，在阳离子交换柱上将它们分离，采用不同pH值离子浓度的缓冲液将各氨基酸组分依次洗脱下来，再逐个以另一流路的茚三酮试剂混合，然后共同流至螺旋反应管中，于一定温度下（通常为115～120℃）进行显色反应，形成在570nm有最大吸收的蓝紫色产物。其中的羟脯氨酸与茚三酮反应生成黄色产物，其最大吸收在440nm。