凝胶过滤层析需要的设备

A. 凝胶过滤层析的凝胶层析的应用

⑴脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。本法脱盐操作简便、快速、蛋白质和酶类等在脱盐过程中不易变性。适用的凝胶为SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6.柱长与直径之比为5-15，样品体积可达柱床体积的25%-30%，为了防止蛋白质脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡，然后加入样品，再用同样缓冲液洗脱，收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类。
⑵用于分离提纯：凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯。凝胶对热原有较强的吸附力，可用来去除无离子水中的致热原制备注射用水。
⑶测定高分子物质的分子量：用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内，在同一条件下层析，记录每一分钟成分的洗脱体积，并以洗脱体积对分子量的对数作图，在一定分子量范围内可得一直线，即分子量的标准曲线。测定未知物质的分子量时，可将此样品加在测定了标准曲线的凝胶柱内洗脱后，根据物质的洗脱体积，在标准曲线上查出它的的分子量。
⑷高分子溶液的浓缩：通常将SephadexG-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中，这时水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部的孔隙中，而高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外，再经离心或过滤，将溶胀的凝胶分离出去，就得到了浓缩的高分子溶液

B. 血红蛋白凝胶过滤层析所需仪器、用具、物品和实验的具体方案

一、实验目的

1.了解凝胶柱层析的原理及应用；

2.掌握凝胶柱层析的基本操作技术，为进一步掌握离子交换柱层析、亲和层析及吸附层析等其它分离方法打下良好的基础。

二、实验原理

凝胶层析：原理与应用

凝胶层析又称凝凝胶过滤，是一种按分子量大小分离物质的层析方法。该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。大分子无法进入凝胶颗粒中的静止相中，只能存在于凝胶颗粒之间的流动相中，因而以较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此就要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分离。

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凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数Kav（被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。Kav值的大小与凝胶床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关，即：

Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)

在限定的层析条件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。分离物分子量大，Kav值小；反之，则Kav值增大。因此，在同一凝胶柱上分离分子量不同的物质时，由于流动相的作用，这些分离物质将发生排阻和扩散效应。若缓冲液连续地倾入柱中，柱中物质的排阻和扩散效应也将连续地发生，其最终结果是分子量大的物质先从柱中流出，分子量小的物质则后从柱中流出。流出物用部分收集器分管等量或等时地收集起来，检测后分段合并相同组分的各管流出物，即等于把分子量不同的物质相互分离开了。其分离效果受操作条件（如基质的颗粒大小、均匀度、筛孔直径和床体积的大小、洗脱液的流速以及样品的种类等）的影响，而最直接的影响是Kav值的差异性，Kav值差异性大，分离效果好；Kav值差异性小，则分离效果很差，或根本不能分开。

分配系数Kav既是判断分离效果的一个参数，又是测定蛋白质分子量的一个依据。从公式Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)可知，只要测出床体积Vt 和外水体积Vo 以及洗脱体积Ve，即可计算出Kav值。而凝胶床总体积Vt可用测量法得到：

由凝胶床的组成可知，床体积Vt等于外水体积Vo、内水体积Vi与凝胶颗粒实际占有体积Vg之和。即

Vt = Vo+Vi+Vg = Vo+Vi

而Vo和Vi可通过实验测得：当把分子量不同的混合溶液铺在凝胶床上时，其在内水体积和外水体积中的分布是不一样的。溶液中的分子大于凝胶孔径上限者不能进入凝胶网孔内，而被排阻在外水体积的溶液中。凝胶床的洗脱体积Ve刚好等于外水体积。即Ve=Vo (Kav=0)。然而，溶液中的分子小于凝胶孔径下限者能自由进入凝胶网孔内，凝胶床的洗脱体积Ve应等于凝胶床总体积，即Ve= Vt= Vo+Vi (Kav=1)。而溶液中的分子大小介于凝胶孔径上限和下限之间者，则能进入部分凝胶网孔中，故其洗脱体积Ve是在Vo和Vt之间（Kav在0－1之间）。

以床体积Vt（等于pr2h）和测得值Vo来计算分配系数的值为Kav，若以床体积Vt（等于Vo+Vi）和测得值Vo来计算分配系数的值为Kd。在同一层析条件下，对同一物质计算出来的Kav和Kd值尽管有一定的差异性，但都是有效的。只因Kav计算方便，所以目前多使用Kav。分离物在凝胶过滤层析时的行为，除用Kav和Kd表示外，还可用Ve/Vo或Vo/Ve（R值）表示。

反应原理

凝胶过滤不仅常用做物质的分离，还可以根据需要用某种试剂非常方便地处理某种物质，当该物质流经试剂区时，因为可连续接触新鲜试剂，因而可以充分发生反应，最后经过洗脱，再与过量的试剂分开。本实验就是通过凝胶过滤，用还原剂FeSO4处理血红蛋白。即首先在层析柱中加入含有还原剂的溶液，使形成一个还原区带，当血红蛋白样品（血红蛋白与铁氰化钾的混合液）流经还原区带时，褐色的高铁血红蛋白立即生成紫色的还原型血红蛋白，随着还原型血红蛋白继续下移，与缓冲液中的氧分子结合又形成了鲜红的血红蛋白。铁氰化钾则因分子量小，在层析柱中呈现其本来的黄色带而远远地落在血红蛋白的后边。本实验操作简便，直观性强，趣味性浓，通过肉眼观察即可检验分离效果。

三、实验材料

1.器材：层析柱，?10×200

2.试剂：

(1) 20mM磷酸二氢钠

(2) 20mM磷酸氢二钠

(3) 40mM FeSO4(用时现配)

(4) 0.2M Na2HPO4，80mM Na2H2EDTA

(5) 抗凝血（哺乳动物血样，以1：X的比例加入%柠檬酸钠，置于4℃冰箱中保存。贮存期以不超过3个月为宜）

(6) Sephadex G-25

(7) 固体铁氰化钾

四、仪器设备

铁架台、恒流泵

五、实验步骤

1．凝胶的处理 取3克葡聚糖凝胶（Sephadex-25）干粉，浸泡于蒸馏水中充分溶胀（室温，6小时），然后倾斜法除去表面悬浮的小颗粒，最后加入等体积pH7磷酸缓冲液继续浸泡（磷酸缓冲液用试剂1、2以39:51的比例混合，并用pH计校对）。

2．装柱 将层析柱下端的止水螺丝旋紧，向柱中加入约5-7cm高的缓冲液，把溶胀好的糊状凝胶边搅拌边到入柱中，同时开启止水螺丝，控制一定的流速，使柱中的凝胶一直处在溶液中。最好一次连续装完，若分次装入，需用玻璃棒轻轻搅动柱床上层凝胶，以免出现界面。装柱长度至少8cm。最后放入略小于层析柱内径的滤纸片，以防将来加样时凝胶被冲起。

3．平衡 用磷酸缓冲液洗脱，平衡20分钟。注意液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。

4．血红蛋白样品的制备 取1ml抗凝血于烧杯中，加入10ml pH7 20mM磷酸缓冲液，再加入固体铁氰化钾，使浓度达到5mg/ml。

5．层析柱还原层的形成 取1ml 40mMFeSO4于小烧杯中，加入1ml 0.2M Na2HPO4,80mM Na2H2EDTA混合液搅拌均匀。待层析柱上缓冲液几乎全部进入凝胶时，速取该混合液0.4ml加入层析柱中，待混合液完全进入柱床后加入0.7ml缓冲液。（注意还原剂的混合液要新鲜配制，尽可能缩短在空气中暴露的时间）。

6．上样 将柱中多余的液体从底部流出后关闭止水螺丝,取前面制备好的血红蛋白样品0.5ml，将样品溶液小心加到凝胶柱上，打开止水螺丝，使样品溶液流入柱内。

7．洗脱 用缓冲液进行洗脱，控制缓冲液在约每5秒一滴的流速，观察并记录实验现象。

8．清洗 待所有色带流出层析柱后，加快流速，继续清洗层析柱5min

C. 蛋白质纯化，凝胶过滤层析填料

首先琼脂糖凝胶可来以排源除，这是大孔凝胶，用于分子量较大的成分。
我做分子筛用的比较多的柱子都是葡聚糖凝胶凝胶，我的蛋白比你的大，用G50和G100的填料，做的结果都没什么问题。
你的蛋白7kD，如果没有什么特别的性质（高级结构是球形还是其他的，有无多聚），G50应该可以。如果你不放心，也可以考虑聚丙烯酰胺凝胶，它和葡聚糖凝胶相比更适合于分子量稍小的蛋白，可能更实用于你的实验。
聚苯乙烯凝胶没用过，不发表意见。

D. 凝胶过滤层析法加样是应注意哪些问题

一般分为三个步骤：装柱、加样、洗脱淋洗。
装柱是需要注意的是：【1】垂直放置版 【2】放置产生气泡权 【3】放置柱分层
加样时，【1】加样前打开出口，使展开剂流出，至正好露出凝胶上平面时，立即关闭出口
【2】加样时，用滴管缓缓沿柱内壁加入柱子
【3】打开柱子得出口，使待分离的样品进入柱子。
加样完成后，进行洗脱。

E. 凝胶过滤层析的基本原理

凝胶过滤层析又称为排阻层析或分子筛方法。其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特点，将被分离物质各成分按分子大小分开，达到分离的目的。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，小分子物质能进入其内部，流下时路程较长，而大分子物质却被排除在外部，下来的路程短，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。

F. 凝胶过滤层析的使用方法

⒈凝胶的选择根据实验目的不同选择不同型号的凝胶。如果实验目的是将样品中的大分子物质和小分子物质分开，由于它们在分配系数上有显著差异，这种分离又称组别分离，一般可选用SephadexG-25和G-50，对于小肽和低分子量的物质（1000-5000）的脱盐可使用SephadexG-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4.如果实验目的是将样品中一些分子量比较近似的物质进行分离，这种分离又叫分级分离。一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶，层析过程中这些物质都能不同程度地深入到凝胶内部，由于Kd不同，最后得到分离。
⒉柱的直径与长度根据经验，组别分离时，大多采用2-30cm长的层析柱，分级分离时，一般需要100cm左右长的层析柱，其直径在1-5cm范围内，小于1cm产生管壁效应，大于5cm则稀释现象严重。长度L与直径D的比值L/D一般宜在7-10之间，但对移动慢的物质宜在30-40之间。
⒊凝胶柱的制备凝胶型号选定后，将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。自然溶胀费时较长，加热可使溶胀加速，即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1-2小时即可达到凝胶的充分胀溶。加热法既可节省时间又可消毒。
凝胶的装填：将层析柱与地面垂直固定在架子上，下端流出口用夹子夹紧，柱顶可安装一个带有搅拌装置的较大容器，柱内充满洗脱液，将凝胶调成较稀薄的浆头液盛于柱顶的容器中，然后在微微地搅拌下使凝胶下沉于柱内，这样凝胶粒水平上升，直到所需高度为止，拆除柱顶装置，用相应的滤纸片轻轻盖在凝胶床表面。稍放置一段时间，再开始流动平衡，流速应低于层析时所需的流速。在平衡过程中逐渐增加到层析的流速，千万不能超过最终流速。平衡凝胶床过夜，使用前要检查层析床是否均匀，有无“纹路”或气泡，或加一些有色物质来观察色带的移动，如带狭窄、均匀平整说明层析柱的性能良好，色带出现歪曲、散乱、变宽时必须重新装柱。
⒋加样和洗脱凝胶床经过平衡后，在床顶部留下数亳升洗脱液使凝胶床饱和，再用滴管加入样品。一般样品体积不大于凝胶总床体积的5%-10%。样品浓度与分配系数无关，故样品浓度可以提高，但分子量较大的物质，溶液的粘度将随浓度增加而增大，使分子运动受限，故样品与洗脱液的相对粘度不得超过1.5-2.样品加入后打开流出口，使样品渗入凝胶床内，当样品液面恰与凝胶床表面相平时，再加入数毫升洗脱液中洗管壁，使其全部进入凝胶床后，将层析床与洗脱液贮瓶及收集器相连，预先设计好流速，然后分部收集洗脱液，并对每一馏份做定性、定量测定。
⒌凝胶柱的重复使用、凝胶回收与保存一次装柱后可以反复使用，不必特殊处理，并不影响分离效果。为了防止凝胶染菌，可在一次层析后加入0.02%的叠氮钠，在下次层析前应将抑菌剂除去，以免干扰洗脱液的测定。

G. 凝胶过滤技术有哪些具体应用

凝胶过滤色谱法：分辨率较高，但是上样量仅为柱体积的1%，而且对流速也有严格的限制。内离子交换色谱法：根容据目的蛋白质表面所含有的氨基酸残基带有的净电荷分离蛋白质，但是分辨率没有凝胶过滤高。亲和层析法：根据生物分子的特异性分离目的蛋白，特异性很高，但是配件容易丢失适合含有特异性的标签的或者抗体。疏水色谱：根据疏水性来分离蛋白质,缺点是有的蛋白质在高盐中溶解度降低，所以应用范围受到限制，适合蛋白质表面含有较多疏水性氨基酸残基的疏水性蛋白质。

H. 凝胶层析分离物质，有什么优缺点

1. 凝胶层析操作简便，所需设备简单。有时只要有一根层析柱便可进行工作。分离介质—凝胶完全不需要像离子交换剂那样复杂的再生过程便可重复使用。

2. 2.分离效果较好，重复性高。最突出的是样品回收率高，接近100%。

3. 3.分离条件缓和。凝胶骨架亲水，分离过程又不涉及化学键的变化，所以对分离物的活性没有不良影响。

4. 4.应用广泛。适用于各种生化物质，如肽类、激素、蛋白质、多糖、核酸的分离纯化、脱盐、浓缩以及分析测定等。分离的分子量范围也很宽，如SephadexG类为102～105d；Sepharose类为105～108d。

5. 5.分辨率不高，分离操作较慢。由于凝胶层析是以物质分子量的不同作为分离依据的，分子量的差异仅表现在流速的差异上，所以分离时流速必须严格把握。因而分离操作一般较慢。而且对于分子量相差不多的物质难以达到很好的分离。此外，凝胶层析要求样品粘度不宜太高。凝胶颗粒有时还有非特异吸附现象。
   

I. superdex 200，凝胶过滤层析过程中，更换不同的样品，需要用氢氧化钠溶液冲洗柱子吗

不用，只要前一次层析冲干净后，紧接着下一次层析就可以直接上样。结束后使用氢氧化钠冲洗。

J. 凝胶过滤层析的优点

它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。