核酸检测水处理工艺方法

1. 检测核酸纯度方法

紫外吸收检测DNA浓度与纯度2007年11月13日 星期二 11:40目的： 了解紫外吸收检测DNA浓度与纯度的原理，掌握测定方法。

原理： 核酸的最大吸收波长为260nm，蛋白质为280nm，在波长260nm时，1OD值相当于双链DNA浓度为50μg/ml，单链

寡核苷酸的含量为30μg/ml，可以据此来计算核酸样品的浓度,还可通过测定在260nm和280nm的OD值的比值

（OD260/OD280），估计核酸的纯度。纯净DNA的比值为1.8, RNA为2.0。若比值高于1.8说明DNA样品中的RNA尚未除

尽，若样品中含有酚和蛋白质将导致比值降低。270nm存在高吸收表明有酚的干扰。 紫外分光光度法只能用于测定浓度

大于0.25μg/ml的核酸溶液，对浓度更小的样品，可采用荧光分光光度法。

试剂与仪器： 提取的质粒DNA，紫外分光光度仪。

操作步骤：
1) 分光光度计先用水在260nm和280nm两个波长下校零。
2) 取质粒DNA样品2μl，用水稀释100倍，转入分光光度计的石英比色杯中。
3) 在260nm和280nm分别读出样品光密度值。如果样品浓度单位为μg/μl，则样品DNA浓度为OD 值的10倍，即如

OD<SUB>260</SUB>=0.1，则样品浓度即为1μg/μl。
4) 若OD<SUB>260</SUB>/OD<SUB>280</SUB>大于1.8，说明仍有RNA，可以考虑用RNA酶处理样品，若小于1.8，说

明样品中含有蛋白质或酚，应再用酚/氯仿抽提，以乙醇沉淀纯化DNA。

2. 核酸pcr步骤

一、个人三级防护穿戴

带一次性帽子、佩戴医用N95、一次性防护服、一次性鞋套、一次性防水靴套、一层乳胶手套、外层一次性隔离衣、防护目镜、第二层乳胶手套、穿戴完毕后应尽快通过专用缓冲间或者走廊，进入核酸提取区（专业核酸提取实验室）。


二、样本灭活处理

核酸检测须有两名工作人员快速通过进入实验室，进行灭活实验操作。生物安全柜内需配备吸水棉与消毒酒精、有条件可配备吸水台布，对样本溢洒时进行紧急处理；打开二级容器，用75%酒精消毒物体表面，检测样本管密闭性后进行灭活处理，灭活条件（56℃，30min，恒温样本灭菌仪等多种方式），取出酒精灭活管用酒精擦拭外表，将样本放入到生物安全柜内。

三、手工核酸提取

操作人员进入试剂配置区或者单独的洁净实验室。

一、试剂区准备

根据说明说要求，在AW1中加入无水乙醇130mL，在AW2中加入无水乙醇160mL，计入无水乙醇后及时做好标记，在310μg的Carrier RNA中加入310μL AVE，并颠倒混匀使Carrier RNA充分溶解，就此完成洗液AW1、洗液AW2和Carrier RNA配置，而后通过传递窗传送到样本处理区，或者由专人送到核酸提取实验室中。

二、样本的裂解

用1.5ml的无菌EP管，移液器移取560μl AVL裂解液，加入5.6μl Carrier RNA，加入140μl的已灭活的待提取核酸的待测样本，涡旋振荡15s，室温静止10min。将上述EP管放入离心机内瞬时离心以去除可能残留在EP管盖上的裂解产物，防止污染。裂解完成后，加入560μl无水乙醇，振荡混匀15s，将上述EP管放入离心机内瞬时离心以去除可能残留在EP管盖上的裂解产物，防止污染。

向离心柱加入裂解产物630μl，8000转离心1min，若离心机在生物安全柜之外，每次使用都需进行外表面消毒。更换新废液收集管，要从离心机中小心取出离心柱，将上层离心柱转移到新收集管中，继续将剩余裂解产物630μl加入离心柱中，若样本体积大于140μl时需重复此步骤，直到全部裂解产物都过柱离心，8000转离心1min，小心将离心柱转移到新的收集管中。

取500μl AW1加入离心柱中（注意，此处加样操作时务必将移液器吸头接触离心柱内壁缓慢加样），8000转离心1min。小心取出离心柱，更换新的收集管。

取500μl AW2加入离心柱中，14000转离心3min，小心取出离心柱，更换新的离心柱上端收集管，置于离心机中使用最大转速离心1min，以确保将AW2中的残液完全离心干净。

取无菌1.5mlEP管收集核酸，将离心柱上端小心放入1.5mlEP管中，取40-60μl的洗脱液AVE加入到离心柱中（注意：洗脱液应尽量全部覆盖住离心柱膜），用EP管管盖盖住离心柱，使用无菌剪刀剪去原离心柱管盖。

室温静止1min，将其放入离心机中8000转离心1min，回收核酸。丢弃离心柱，EP管中即为获取的提取核酸，做好标记与登记。

四、用仪器提取核酸

首先按照说明说准备核酸提取试剂，将200μl灭活样本添加到核酸提取试剂中，根据核酸提取仪的设置程序上机提取核酸，等仪器操作结束，提取核酸完成，回收核酸。

五、PCR体系配置

根据检测样本数量配制体系，将配制好的PCR体系充分混匀并离心后，将其通过传递窗送至样本处理核酸加样区，或单独的样本加样实验室。按照每孔分装20μL反应体系，进行分装，在各孔分别加入5μL待测样本核酸或阴阳对照物（请注意每次检测器包含1个阳性对照和3个阴性对照且阴性对照需随机分布），密封PCR管，有条件时模板加样尽量在单独的生物安全柜进行。

工作人员将配好的PCR管通过传送窗口送至PCR扩增区，或由专人送至PCR扩增实验室，上机检测。

六、上机检测及结果分析

工作人员进入基因扩增分析实验室，从传递窗取出PCR反应管，上机前需混匀并离心反应体系，按试剂盒说明说设置扩增参数并分析判读结果。分析结果时，严格阅读说明说充分了解试剂盒灵敏度、方法学局限性等综合判读实验结果。

为防止扩增污染，反应结束后的PCR扩增管严禁开盖并装入密封带中装入指定的垃圾桶中。

七、检测后的消毒处理

样本处理完成后，工作人员应用75%的酒精消毒处理外层手套并脱下外层手套，放入生物安全柜中的生物垃圾桶中。检测完成后，生物安全柜台面和地面应用0.5-1%的有效氯消毒剂或75%乙醇进行擦拭。将安全柜内产生的医疗垃圾用三层垃圾袋密封，并将其放入指定垃圾桶中，垃圾袋上需标记医疗垃圾信息。实验结束后，生物安全柜以及实验室均要进行紫外灯照射消毒，时间至少30min。

实验操作人员，应有他人用0.5-1%的有效氯消毒剂或75%乙醇对一次性隔离衣均匀喷雾消毒处理，而后脱去隔离衣将检测医用垃圾放入制定垃圾桶中，工作人员在离开二级实验室后，应在缓冲区或走廊按顺序摘脱个人三级防护用品，首先应带新的外层手套，摘掉护目镜并置于75%乙醇中消毒，自上而下、自内向外翻转脱掉一次性防护服，脱去外层手套，摘除、一次性帽子、脱一次性鞋套。脱掉手套，病毒防护服均需进行高压灭菌处理。高压前后医疗垃圾严格区分。

病毒相关垃圾需在120度，30min条件进行湿热高压处理，以高压试纸条变色为有效，而后作为普通医疗垃圾处理。

3. 西安启用多套气膜实验室测核酸，这种检测核酸的原理是什么

它的原理是气膜实验室是一个整体可以固定安装也可以随时移动，工作员提取到样本之后可以直接在实验室里面提取样本检测这样更加快速有效。气膜实验室是第一次投入到使用当中，在此之间已经经过了多次试验，无论是在安全上还是效率上都是有保障的。

一、这种实验室有什么好处？

这种实验室的好处在于可以快速有效的检测提取到的样本，不同于常规实验室。常规的实验室提取到样本之后还要送到专门的研究室进行病毒检测，气膜实验室有专门的扩增室提取到样本之后，可以直接在扩增室里面进行检测。一方面这种实验室可以增加效率，另一方面也可以防止病毒从实验室当中传播出去既有效率又安全。

4. 核酸检测方法

核酸检测采用咽拭子检测，有口咽拭子采样和鼻咽拭子采样两种方式。

口咽拭子采样就是在咽喉部位用棉签涂擦，刷取咽喉部位上皮细胞的检测。受检测者只要放松心情，张口发出“啊——”的声音就可以了，检测过程并没有创伤风险，是非常安全的检测。

检测时可能会有恶心、想要呕吐的不适感觉，不过这些不适症状通常只需要半分钟到两分钟左右就可以完全缓解了。鼻咽拭子采样是将一根细棉签深入鼻孔，从下鼻道深入抵达鼻咽后壁，然后捻转棉签取样。棉签进入鼻腔的深度约为鼻尖到耳垂的距离。

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核酸检测相关知识：

核酸检测是检测病毒的方法，它可以更早发现感染。现在临床中对乙肝、丙肝、艾滋病都开展了核酸检测，可以在抗体产生前检测到血液中是否存在病毒。而一些呼吸道疾病可以通过咽拭子或者呼吸道分泌物的核酸检测来判断是否感染，以及推测是否具有传染性。

季节性流感、禽流感、冠状病毒感染等通过咽拭子检测可以方便地判断出上呼吸道是否存在病毒成份，从而判断被检测者是否属于感染者。

新冠病毒的核酸检测已经是比较成熟的检测方法了，只要在咽喉部位擦拭几秒钟就可以采集到标本。通过分析判断是否有新冠病毒的核酸成分，可以尽早发现感染者，甚至在感染者出现症状前就可以检测到阳性。

感染者经过隔离治疗后咽拭子检测阴性说明病毒已经清除，不具有传染性了。目前两次咽拭子核酸检测阴性是确诊病例和无症状感染者解除隔离的标准之一。

5. 食品怎么核酸检测

核酸检测的 常规步骤是 医护人员穿具防护服 双手用酒精消毒 佩戴无菌手套 然后打开检测盒的包装 一手拿压舌板 按压舌头 另一只手拿无菌的棉签 以灵敏而轻柔的动作 沾取受检查者 咽喉部扁桃体部位的分泌物 取样完毕