链霉亲和素琼脂糖树脂

㈠ 生物素-亲合素系统的原理

生物素（biotin，B）广泛分布于动、植物组织中，常从含量较高的卵黄和肝组织中提取，分子量244．31Da．生物素分子有两个环状结构（如图），其中Ⅰ环为咪唑酮环，是与亲和素结合的主要部位；II环为噻吩环，C2上有一戊酸侧链，其末端羧基是结合抗体和其他生物大分子的惟一结构，经化学修饰后，生物素可成为带有多种活性基团的衍生物——活化生物素。活化生物素可以在蛋白质交联剂的介导下，与已知的几乎所有生物大分子偶联，包括蛋白质，核酸，多糖，脂类等。
亲和素（avidin，AV）亦称抗生物素蛋白、卵白素，是从卵白蛋白中提取的一种由4个相同亚基组成的碱性糖蛋白，分子量为68kD，等电点pI=10.5；洞亩咐耐热并耐受多种蛋白水解酶的作用．尤其是与生物素结合后，稳定性更好。生物素与亲和素间的作用是目前已知强度最高的非共价作用，亲和常数（K）为1015mol/L，比抗原与抗体间的亲和耐返力（K=10.5～11L/mol）至少高1万倍。并且，二者的结合稳定性好专一性强，不受试剂浓度，PH环境，抑或蛋白变性剂等有机溶剂影响。由于每个亲和素能结合4个分子的生物素，这一特点可以用于构建一个多层次信号放大系统。因此，BAS即可用于微量抗原、抗体及受体的定量、定性检测及定位观察研究，亦可制成亲和介质用于上述各类反应体系中反应物的分离、纯化。
亲和素由于带有一个糖链侧链，导致容易和细胞表面的多糖发生非特异性亲和。因此，链霉亲和素被开发出来。
链霉亲和素（streptavidin，SA）是由链霉菌streptomyces avidinii分泌的一种蛋白质，分子量为65kD。链霉亲和素分子由4条相同的肽链组成，其中每条肽链都能结合一个生物素，并且不带任何糖基，因此与亲和素一样，一个链霉亲和素分子也能结合4个生物素分子，二者亲和常数（纳纯K）亦为1015mol/L。链霉亲和素的适用范围比亲和素更为广泛。

㈡ pcr扩增产物分析的方法有免疫印迹吗

PCR扩增产物的分析方法微孔板夹心杂交法颜色互补分析法PCR-ELISA法PCR-OLA法PCR-打点杂交法微孔板夹心杂交法：该法是通过一固定于微孔板的捕获探针与PCR产物的某一区域特 异杂交使产物的间接地固定于微孔板上，然后，再用一生物素 等非放射性标记物标记的检测探针与产物的另一特异性较一次 杂交，漂洗后显色即可判断结果。该法需要两个杂交过程来检测 一个产物，因此，其特异性较一次杂交的检测法高。该法已用于HBV 的检测，其敏感度可达5个HBVDNA分子。此法的敏感性和特异性与 PCR32P探针的Southern杂交法相当。但PCR微孔板夹心杂交法操作简 便、快速、避免了同位素标记探针的危害，显色反应类似于临床常 规应用的ELISA，适于临床实验室常规应用。另一种微孔板杂交法不 是采用夹心法，而是直接将特异探针固定微孔板上，然后用生物素 标记的PCR产物杂交。微孔板杂交与膜印迹杂交相比，有如下优点： ①前者易操作；②固相微孔板漂洗时间短，节省了检测时间，因为 膜杂交过程中，反应剂要浸透膜中，漂洗时，使反应剂全部浸出需 要时间较长；③本底低，微孔板杂交不需Dehatdt液和预杂交以及封 闭过程。另外，微孔板固定的DNA不需再加热或UV照射。微孔板杂交的基本过程包括L：DNA的固定，探针的杂交和酶联显色。DNA的固定在一定盐浓度条件下，DNA单链的一端可固定在微孔板上。不同来源 的微孔板固定DNA时所需盐浓度不同。因此，必须用一系列的盐浓度 （0.15mol/L至3.0mol/LNaCl）来固定加热变性的核酸，然后，用固 定浓度的标记探针杂交。显色后，判断合适的固定盐浓度。固定方 法的选择必须使DNA最大量的固定，且不影响杂交。用合适浓度的 NaCl或(NH4)2SO4可达到此目的。硫氰酸钠则无固定作用。盐浓度合 适时，DNA应为一端固定到微孔板上，而太低或太高浓度的盐可能使 DNA“平躺”固定在孔内而影响杂交。Mg2+虽有促进DNA固定的作 用，但它可激活Dnase，所以，一般不用。被固定的DNA应大于毁兄300bp， 否则影响杂交结果。每孔可固定高达200ng(624bp)的DNA。合适的盐 浓和固定量一经确定，可按下法固定DNA。
待固定DNA100℃加热5min变性并立即冷却。与合适的固定液混合后，加入微孔板的孔内。固定液：10mmol/L磷 酸钠-10mmol/LEDTA，pH7.0，合适浓度的NaCl（与DNA变性混合后， 终浓度为最适固定浓度）。用胶布封好，浸于37℃水浴2h。用PBS-0.05%Tween20漂洗3次。立即用于杂交，搜段或封闭于塑料袋内保存。杂交可采用标准的杂交系统杂交。夹心世余誉杂交时，是将变性的PCR产物与检 测探针一并加。杂交与漂洗时间均较一般膜杂交短。显色根据不同酶标检测分子的不同选择不同的底物、终止剂和测定波 长。颜色互补分析法(A)颜色互补分析法是利用三原色原理，当不同DNA片段（A和B）同时扩增时，用引 物5’端修饰技术将不同引物用不同颜色荧光素标记（A片段引物标记绿色的荧 光素，B标记红色的罗丹明）。如果仅有一条片段被扩增，扩增产物激发后，只有 一种颜色（红色或绿色）。如果两条不同大小的片段均被扩增，可通过电泳分离，紫 外激发后可观察到不同颜色的两条带。如果两条被扩增片段大小相同，电泳后可见一 条红绿互补色-黄色带。如果不用电泳法分离扩增片段，通过一定手段除未掺入引 物，亦可观察到扩增产物的颜色。此时，扩增产物无论大小，只要均被扩增，就可见 一条红绿互补的黄色条带。该法简便、易于自动化，可用于检测基因，缺失、染色体转位和病原微生物。这种情 况下，只需判断产物的有无。另外，在检测多种基因实变、多种病原菌和HLA分型 时，可用复合PCR。此时，不同引物可用不同荧光素标记（如绿色的ROX；蓝色的COUM 等）。PCR-ELISA法：(A)本法避免了电泳和杂交的步骤，适于常规ELISA记数仪检测。因为5’端修饰后仍 可进行常规PCR扩增特异靶序列，因此，可以通过修饰其中一个引物的5’端使其携带 便于PCR产物固定的功能基团，而通过另一引物5’端的修饰使产物便于检测。链霉亲和素的包被：不同厂家的聚丙乙烯微孔板的包被效果差异并不显著。亲和层析纯化的链霉亲和素（13U/mg，Sigma公司）用PBS-Tween液140mmol/LNaCl， 2.7mmol/LKCl，4.3mmol/LNa2HPO4，1.4mmol/LK2HPO4，0.05%(w/v)Tween20，Ph7.2 配成1μg/ml。向微孔板的每孔内加入100μl，封好，室温过夜。 用PBS液漂洗。
扩增产物与包被板的结合：PCR产物1μl用50μ1PBS-Tween液稀释后加入包被孔内。室温下作用30min。 用PBS-Tween液漂洗6次，去除未掺入的荧光引物。 ELISA：向结合有PCR产物的孔内加入50μlPBS-Tween液稀释的HRP-抗FITC抗体，室温下作用 30min。用PBS-Tween漂洗6次。将1mgTMB溶于1ml二甲基亚砜中，用50mmol/L醋酸钠-柠檬酸液（Ph4.9）稀释10倍， 向每孔内加入30%（v/v）H2O23μl，再加入80μlTMB液，使反应在室温下进行2～5min ，再加入80μl2mol/L硫酸终止反应。于ELISA计数仪上450nm测定OD值。另外，引物的修饰除用图2-3所示的生物素和FITC外，还可用DNA结合蛋白质的结合位 点和生物素修饰，将DNA结合蛋白质（GCN5或TyrR）包被在微孔板内，与PCR产物结合 后，可加入酶标亲和素进行ELISA检测。PCR-ELISA法可用于PCR产物定量分析。需注 意的是，定量分析时，PCR要在对数期内终止，并需设立已知标准对照。PCR-OLA法(A)研究表明、不同个体中同源DNA片段序列间的差异大部分是限定于单个核苷酸的位 置。已弄清的人遗传病的40个基因结构变异中，绝大部分属碱基替换，同样，作为遗 传连锁分析标记的大部分序列变异主要是位于基因组的非编码区的点突变。所以，一 般基因检测技术的一个重要要求是能很容易地检出单一核苷酸变异。寡核苷酸连接试 验（OLA）就是为此目的而设计的。它可以单独或结合PCR快速确定紧密相关的DNA序 列。OLA是通过设计两种能与靶序列DNA精确并列杂交的寡核苷酸完成的。寡核酸杂交 后，DNA连接酶可使其正常配对的相邻碱基共价连接，而错配的相邻碱基可通过调节 连接酶和NaCl浓度防止其连接，连接产物可通过凝胶电泳观察其大小，或通过5’端 修饰技术使一个寡核苷酸5’端带有一个配基。连接后，通过固相化的亲和配基使其 固定，漂洗后，检测另一寡核苷酸3’端携带的适当标记分子。这一过程如重复进行 多个循环，则连接产物会呈线性增加，故称这循环进行的OLA为连接检测反应（LDR）。 此反应中若再加入两种与上述寡核苷酸互补的寡核苷酸互补的寡核苷酸进行循环的连 接反应，则称之为连接酶链反应。两寡核苷酸在无靶序列的情况下，在非常接近的位 置发生杂交的可能性极小，因此，OLA技术的假阳性极少。另外，连接酶所形成的键 是连接产物。该法适于简单、标准化的基因组样品处理法，或直接用表面活性剂和蛋 白酶初步处理有核细胞作为检测样品。需指出的是，这里是以放射性标记检测分子为 例的。如图2-6中的地高辛标记分子可避免放射性同位素的缺点，且敏感性相当，更 易于自动化。
寡核苷酸的设计与标记：用于OLA的寡核苷酸一般为20mer，使被检变异核苷酸位于 即将连接的两个寡核苷酸接头的5’端。即位于图2-6中第2步左侧寡核苷酸的3’端。 左侧寡核苷酸是5’标记生物素。右侧寡核苷酸5’端需磷酸化才能与左侧寡核苷酸的 3’-OH相连接。用PNK酶处理很易使其5’或3’标记可以选择其它标记物（如荧光素 等）。OLA反应：向一软质圆底微滴定板内依次加入：3μlPCR扩增DNA产物；1μl剪切的鲑精DNA(10μg /μl);1μl0.5mol/LNaCl混匀室温作用10min。加入1μl0.5mol/LHCl，混匀。加入1μl生物素标记探针水溶液（140fmol）和1μl32P探针（1.4fmol），2μlT4连 接(约0.1WeiSS单位，用5×连接缓冲液稀释)。5X连接缓冲液：250mmol/LTris-HCl， Ph7.5;500mmol/LNaCl;500mmol/LMgCl2;25mmol./LDTT;5mmol/LATTP;500μg/μlBSA。 不同寡核苷酸与底物反应的连接所需酶液度不同，OLA试验时，一定要小心滴定最适 酶浓度，提高连接温度（50℃）可扩加OLA的特异性。混匀，在100%湿度下于37℃作用1h。加入1μl1mol/LNaOH，混匀，室温下作用10min。加入1μl1mol/LHCl中和。加入2μl10%SDS，3μl15%（w/v）链霉亲和素包被的琼脂糖悬液，混匀后室温作用 10min。将一事先用0.5%奶粉-0.1%SDS-100μg/ml蛙精DNA煮过的Whatman4号滤膜置于点样器 上，然后，将微孔板内混合液加入点样孔内，真空抽滤点膜。再用数毫升1%SDS和 0.1mol/LNaOH分别依次抽洗膜。取下膜，用塑料保鲜包好进行放射自显影。打点杂交当扩增产物是多条带时，用点杂交更合适。这种方法的基本过 程是，首先将扩增的DNA固定到尼龙膜或硝酸纤维素滤膜上，再 用放射性或非放射性标记的探针杂交。点杂交还有助于检测突变 DNA的突变类型，用于人类遗传病诊断和某些基因的分型。放射性同 位素32P标记的寡核苷酸探针检测的敏感性、特异性和方法的可靠性 均不容怀疑，对人们认识某些疾病与基因变异的关系起了很大的作 用。但是，由于同位素不稳定和放射性危害，不能常规用于临床或 法医检验。因而用非放射性物质（生物素、和地高辛等）标记的寡 核苷酸探针分析PCR产物以确定核酸序列变异则是一种简便而安全的 方法。非放射性标记物质稳定性高、使用方便、安全、检测速度 快。因此，本节仅叙述非放射性标记探针的点杂交与检测情况。
膜的制备：点杂交膜的制备有两种方法，一是将扩增产物直接固定于膜上，每 一个探针制备1张膜。然后，用不同的等位基因特异或某一微生物特 异探针在严格条件下杂交来检测扩增产物的突变类型或鉴定病原 菌；另一种方法是将不同的探针固定到尼龙膜上，然后，用标记的 PCR产物作探针去杂交。这样，根据杂交点的位置即可判断产物序列 变异的种类。显然，前一方法较后一方法繁琐，费时，费力；而后 一方法仅需一次杂交即可判断结果。产物的固定：⑴取1张带正电荷的尼龙膜，按点样器的 大小裁剪膜，并做好标记。⑵将膜浸入水中湿透至少 1min。⑶变性PCR产物：此步可在圆底微孔板或微量离 心管内操作。每点的变性方法为；5～20μl(50～100ng)PCR 产物与100μl变性液（0.4mol/LNaOH-25mmol/LEDAT） 混匀，室温作用5min即可。⑷小心将预湿的膜装在点 样器上，注意膜与点样器接触表面不能有任何气泡。 因气泡会使点样点呈环形或月牙形或样品间弥散融 合。膜固定后，每孔内加100μl变性混合液，打开真空泵。⑸抽干变性液后，每孔内再加100μlTE缓冲 液，真空抽滤“洗涤”样品。⑹取下膜，置于厚3mm滤 纸上渍干。重复制备用于其它基因探针的膜时，一定要认真清洗点样器，以免样品间的交叉污染。⑺渍干 的膜于80℃真空干烤1h或于254nmUV光源下以60～120mJ/cm2 的强度下照射使DNA固定在膜上。此时，的膜可直接用 于杂交，也可以用滤纸包好存于塑料袋或干燥缸内。探针的固定：因寡核苷酸的探针太短，在膜上固定较 困难，即使固定上，也会影响杂交。这就是需要将寡 核苷酸探针用末端转移酶加polydT尾后，UV线照射固 定。因为UV可激活胸腺嘧啶，使其与尼龙膜上的氨基共价结合，使探针间接地牢固地固定在尼龙膜上。这 种加尾固定的探针不影响杂交。但这种杂交对固定探针的要求是，在同一条件下与PCR产物的杂交必须是特 异的。通过选择探针的合适长度，G+C含量或通过改变 探针的固定可达到特异性的要求。这种固定的探针可 用于检测人类基因的突变，也可用来检测病原微生 物。
(1)加尾反应是用脱氧核糖核酸末端转移酶（TDT）催化，它可将dT依次加在寡核苷酸的3’端，在四种脱氧 核苷中，以dT加尾效果最好。通过改变dT浓度和TdT量 可调节加尾长度，在下述反应条件下，加尾长度可达 400个dT。①向一微量离心管中依次加入：寡核苷酸探 针，100～200pmol;10×TdT缓冲液(1mol/L二甲胂酸钾; 250mmol/LTris-HCl，Ph7.6;10mmol/LCoCl2;2mmol/LDTT) 10μl;dTTP80～110nmol；TdT，60～80U；补水至100μl。 ②混匀后，稍加离心，置37℃水浴60～90min。③加入 100μl10mmol/LEDTA终止反应。加尾长度可通过10%聚 丙烯酰胺凝胶电泳监测。(2)点膜：①加尾探针6pmol，用0.3mol/LNaOH室温处理5min，然后，用2.5mol/LNH4Oac中和。②加入等体 积6×SSC(1×SSC:0.15mol/LNaCl，0.015mol/L柠檬酸三 钠pH7.0)。③将6×SSC预湿的尼龙膜（zeta-probe）或 hybond-N固定在点样器上。④点样方法同上。(3)固定：①小心取下膜，置于TE缓冲液饱和的4～6 滤纸上，DNA面朝上。②将滤纸和膜一起置于254nmUV 灯下照射固定，poly(dT)400尾的探针在40mJ/cm2r的 剂下固定效果最好。辐射剂与给定光源对给定面积的 能量释放率（辐照度）和辐照时间有关。一般对一个 固定光源而言，辐照剂量为：辐照剂量（J/cm2）=辐照度（w/m2）×辐照时间(s)其中，J为辐照能量单位；w为辐照通量单位。辐照度 与照射角度有关，与入射角度θ的余弦（cosθ）呈正 相关。③固定后，在100ml6×SSC-0.5%SDS液中于42～55℃ 漂洗30min左右。漂洗后可立即用于杂交，也可以在蒸溜水中浸洗，晾干后室温保存。
探针的固定量与加尾长度均影响杂交结果。如用poly (dT)400尾的不同固定量的探针与等PCR产物（2.33fmol） 杂交，固定6pmol苷酸杂交时，有29.2%的PCR产物与 1.1%的寡核而固定的探针600fmol杂交时，仅有2.2%的产 物与0.8%。用不同加尾长度的等量产物6pmol固定寡核苷酸与（时，仅0.33%233fmol）杂交结果表明， poly(dT)300探针与产物杂交；而有1.3%的探针poly (dT)400时，则与产物杂交。因此，固定的探针加最好 在400个以dT尾上，固定量也至少6pmol。杂交寡核苷酸探针的杂交：每一寡核苷酸探针均有自己的杂交温度和漂 洗条件，主要取决于探针的Tm值。Tm值则受探针长度，G+C含量和杂 交液的盐渡影响。一般要由如下公式：Tm=4(G+C)+2(A+T)来计算Tm 值。在1mol/L盐浓时，杂交温度可比预测的寡核苷酸Tm值低5～20℃。 提高杂交温度和降低盐浓度可提高杂交的严格性。漂洗液一般不含 盐，漂洗温度比杂交温度低5℃。一旦确定了探针的杂交与漂洗条 件，可按下述方法进行杂交。⑴在（2×SSPE3.6mol/LNaCl：; 200mmol/LNaH2PO4;20mmol/LEDTA，Ph7.4）液中预湿点样膜。⑵置 膜于塑料封口袋中，并加入适量杂交液（SSPE，5×Denhardt液， 0.5%TritonX-100），封口。袋内不要有气泡。⑶置于水浴加热摇 动，在杂交温度下预杂交5min。⑷取出塑料袋，剪开一角。加入非 放射性标记物（如生物素-补骨脂素）标记的探针。每毫升杂交中加 入1pmol探针。封口后摇育20～60min。杂交时间不能太长，否则会 引起探针与膜的不可逆结合。⑸从袋中取出膜，室温下在漂洗液 （SSPE-0.1%TritonX-100）中洗1～2次。⑹漂洗温度下预热的漂洗 液在合适温度下洗10min。漂洗后的膜可用于显色检测。
反向点杂交：反向点杂交即扩增产物作为相中的探针与固定到膜上 的寡核苷酸杂交。如前述，这种杂交最基本的要求就是在同一条件 下，所有固定探针均与扩增产物特异杂较。为此，主要是认真选择 与设计寡核苷酸探针，使各探针在同一条件下Tm值相近。在同一杂 交特异。一旦确定了合适的杂交和漂洗条件，即可按上述基本程度杂交。只是杂交探针（产物）在加入前应加热变性或用等体积的 400mmol/LNaOH-10mmol/LEDTA变性。杂交时间（2～4h）要长些。PCR 产物的标记可以用标记引物扩增或在扩增时掺入标记物。杂交的检测不同非放射性标记物的检测原则上基本相同。若为酶标探针则可直接进行显色检测。下面以生物素标记物为例加以说明。酶标亲和素的结合 ⑴漂洗后的膜在缓冲液A（PBS，100mmol/LNaCl，5%TritonX-100） 中与一定浓度的HRP-标记链霉亲和素在室温作用10min，并轻轻振 荡。⑵用缓冲液B（液A，1mol/L尿素，1%硫酸葡聚糖）在室温下漂 洗5min，并轻轻振荡，将膜上非特异吸附的HRP-链霉亲和素洗掉。显色不同酶标亲和素的显色条件与底物均不同，下面以HRP的显色加以说 明。⑴将上述膜于缓冲液C（100mmol/L柠檬酸钠，pH5.0）中在室温下作 用5min，并轻轻振荡。⑵在缓冲液D中室温下，轻轻振荡10min。此步应避强光。缓冲液D： 1份底物（TMB：2mg/ml，用无水乙醇配制）和19份缓冲液C。⑶在缓冲液E中显色，该液应现用现配。应避强光。缓冲液E：2000 份缓冲液D和1份3%H2O2。显色时间取决于杂交体中含标记物的量； 一般为1～15min即可。杂交阳性呈深蓝紫色。⑷当膜色（信/噪比）合适时，在液C中洗膜1h终止反应，在此过程 中应更换2～3次液体。⑸杂交膜可拍照记录结果，也可封于缓冲液C避光条件下贮存。膜的再利用⑴脱色：将膜置于0.18%Na2SO4液中即可脱掉膜上的颜色。 ⑵去杂交的探针：将膜置于水-0.5%SDS中，65℃加热1h。 ⑶这种处理的膜可再与另一种探针杂交。
问题与对策信号弱：①点膜的产物少-增加点膜量；②杂交时探针浓度低-加大 探针浓度；③杂交漂洗过于严格-增加盐浓度或降低杂交温度；④TMB 液贮存时间过长（TMB液4℃可存2个月）-重新配制。本底信号强：①杂交时探针浓度高-降低探针浓度；②杂交时间长- 缩短杂交时间；③杂交漂洗不严格-降低盐浓度和提高杂交温度；④ 显色时间长-缩短显色时间。杂交膜的高本底着色：①同②；②在缓冲液C中洗膜时间短-延长漂 洗时间（过多的硫酸葡聚糖也能增加膜的本底着色；③同2④；④避 光不严格-显色过程中及显色后要确保杂交膜的避光。阴性对照出现阳性信号：①点样混淆，即把阳性标本点于阴性对照 的位置，重复实验即可纠正；②PCR较物的残留污染，用新配的试剂 重复全部扩增反应。（我自己加进的：Hybond—N+：Hybond-N+是带正电尼龙膜，对在碱性条件下杂交和普通的Southern杂交均有很好的灵敏性，故核酸样品可通过简单的碱处理固定在膜上，而不必在紫外灯下固定，尽管紫外固定的重复性最好。）
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PCR扩增产物的分析方法
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PCR扩增产物的分析方法
微孔板夹心杂交法
颜色互补分析法
PCR-ELISA法
PCR-OLA法
PCR-打点杂交法
微孔板夹心杂交法：
该法是通过一固定于微孔板的捕获探针与PCR产物的某一区域特 异杂交使产物的间接地固定于微孔板上，然后，再用一生物素 等非放射性标记物标记的检测探针与产物的另一特异性较一次 杂交，漂洗后显色即可判断结果。该法需要两个杂交过程来检测 一个产物，因此，其特异性较一次杂交的检测法高。该法已用于HBV 的检测，其敏感度可达5个HBVDNA分子。此法的敏感性和特异性与 PCR32P探针的

㈢ 链霉亲和素的介绍

链霉亲和素(streptavidin下称SA)是与亲和素(avidin下称AV)有相似生物扮扮学特性的一种蛋白质，是好缺颤streptomyces avidinii菌的分泌物，其分子量及结合生物素的能力与鸡蛋友败清中的亲和素相似，等电点6.0，非特异性结合远比亲和素低。

㈣ 单细胞测序能弄成二维吗

用于单细胞测序的细胞条码化的制作方法
admin 2022-06-16 06:16:13 8次
该技术已申请专利。仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
用于单细胞测序的细胞条码化
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年11月4日提交的，题为“用于单细胞测序的细胞条码化”的第62/930,288号美国临时专利申请的优先权，其全文通过引用纳入本文，用于所有目的。
3.发明背景
4.目前的液滴微流体方法实现了数千细胞的通量。然而，更大的数量可能难以实现。使用微流体技术，至少有三个导致细胞悬浮液死体积和因此用于分析的细胞丢失的因素：1)微流体装置的入口处的剩余液体2)微流体通道肢培预划分中的剩余液体和3)未从微流体装置的出口处收集的材料。此外，非常大的液滴乳化体积，对应于高细胞通量实验，很难以及时的方式产生，由于所需的体积。这可能对于细胞活力和细胞内含有的不稳定的核酸底物(如rna)有不利影响。最后，当产生较大的液滴乳液时，其增加的体积使其难以将单个乳液装载入与热循环仪兼容的单管中，从而进一步限制了大乳液体积的实施。
5.单细胞条码化平台需要昂贵的微流体技术(芯片、油和仪器)和条形码珠。仪器还需要昂贵的现场服务工程师来维护和解决硬件问题。
6.虽然液滴微流体技术改进了可扩展性，除非使用更复杂的芯片上(on-chip)液滴合并和皮注射(picoinjection)功能，否则只支持添加一种溶液。
7.用寡核苷酸直接标记细胞是使用寡聚物-偶联珠的选择。然而，在不破坏细胞生理的情况下，装载到细胞上的寡核苷酸的最大数量约为100-1000万。在nl大小的液滴中，寡核苷酸的终浓度往往将不足以驱动分子生物学反应，因此阻止液滴亮圆与直接寡核苷酸标记的细胞兼容。
8.发明概述
9.高密度寡核苷酸，范围达到106至107个分子，可以通过各种方法附接至细胞。例如，可以通过细胞特异性寡核苷酸偶联抗体(stoeckius等2018，genome biology)或通过脂质修饰的寡核苷酸(mcginnis等2019，nature methods)标记细胞。寡核苷酸细胞附接创造了直接在细胞上构建细胞条形码的可能性，例如，通过拆分汇集条形码构建(fan等2015，science)。这些细胞条形码反过来可以用于条码化靶向的细胞的核酸底物。
10.以前，这种形式的细胞条码化的一个要求是，在寡核苷酸裂解或从细胞释放之前，细胞与附接细胞条形码寡核苷酸的互补物必须被共同限制在分区中，此时可以发生与细胞核酸底物的附接。虽然液滴提供划分格式用于这种类型的反应，但是存在一些缺点。首先，单个乳液中液滴的数量上限是约100-200万。为了尽量减少多个细胞共同定位于单个液滴中，可以以大约0.05-0.1的λ装载细胞。基于每个乳液的液滴数量，封装的细胞的数量被限制在最大50,000至100,000。这种细胞通量对于某些类型的实验可能是不足够的，且受到向上可扩展性的限制。第二，由于入口处、微流体和液滴中剩余的细胞悬浮液不能从出口处收获，使用液滴微流体技术的细胞损失很难消除，导致细胞利用率为约60-85％。对于珍贵的细胞，这种水平的细胞利用率可能是不足够的。第三，液滴微流体技术需要芯片、油和仪器，都昂贵且难以支持。第四，在已经形成的液滴中加入试剂并在保持液滴的同时洗涤产物，虽然通过皮注射、液滴合并和磁珠捕获方法是可行的，但不容易工程化。这敬饥塌种限制使得单细胞
dna分析困难，因为简单的液滴微流体技术不支持蛋白酶k消化、随后失活然后加入生物化学品。第五，因为只有100-1000万寡核苷酸可以在不破坏膜的情况下被装载到细胞上，液滴必须有几十pl的体积，以提供足够的寡聚物浓度以驱动分子生物学反应。这些小液滴可能很难通过两个水性入口的微流体技术实现。第六，在进行条码化反应之前，细胞通常必须被清洗以除去其培养基。这明显增加了细胞损失。
11.本方法用液滴解决了上述限制，如下：在细胞上建立细胞条形码后，用与细胞密度匹配的水凝胶溶液重悬细胞，使得细胞不沉降。这可以通过用于保持细胞悬浮的常用试剂实现，例如蔗糖缓冲、percoll(西格玛(sigma))和/或optiprep(西格玛)。然后接着发生水凝胶的固化(solidification)。固化背后的机制取决于用于水凝胶的材料。例如，琼脂糖的固化会由温度下降引起。或者，藻酸盐可以使用钙交联。或者，temed启动了聚丙烯酰胺单体的交联。因此，细胞被分散在整个固化的水凝胶基质中。
12.水凝胶可以经或不经修饰以结合细胞条形码寡核苷酸。例如，细胞条形码寡核苷酸可以在5’端用生物素修饰，亲和素类似物(例如链霉亲和素)可以被偶联至水凝胶材料。因此，当在溶液中时，带有结合的寡核苷酸的细胞将自由移动，然而，一旦水凝胶固化，任何释放的寡核苷酸将在细胞膜的直接的附近结合至基质，在细胞膜存在的地方形成壳或皮。例如，0.01至10％重量/体积(wt/vol)的水凝胶对离子和非离子去污剂、以及低分子量蛋白质、酶和辅因子是多孔的。因此，在将细胞捕获在水凝胶基质中之后，细胞裂解剂(例如0.1％np-40)可以被应用于细胞。裂解剂将通过基质扩散并裂解细胞。细胞条形码寡核苷酸裂解或释放将作为细胞裂解和膜溶解的直接结果发生，或通过特异性或非特异性试剂从细胞裂解或释放寡核苷酸。然后释放的细胞底物核酸将结合至细胞条形码寡核苷酸，其已经被固定在细胞膜/水凝胶界面的壳中。
13.通过细胞/水凝胶界面圈起来的区域的体积基本上是细胞的体积。无论细胞条形码寡核苷酸是否被固定在寡核苷酸的壳上，这种最小体积将显著增加细胞条形码寡核苷酸的有效浓度，达到最大值。这可以补偿，例如，对于在不影响细胞生理的情况下可以被装载到细胞上的细胞条形码寡核苷酸数量有限，例如，每个细胞100-1000万寡核苷酸。对于直径约为9微米的细胞，用200万寡核苷酸的有效浓度将是几百个nm，其为足以支持大多数分子生物学反应(例如逆转录)的浓度。低分子量rna或dna依赖性聚合酶可以与裂解剂一起或之后加入，也可以在中间的洗涤之后加入，以除去或灭活细胞裂解剂。
14.一旦细胞底物核酸加细胞条形码寡核苷酸标签，导致细胞条码化发生，在从固化或未固化的水凝胶基质除去材料之后，文库制备的最后步骤可以在水凝胶基质中或溶液中发生。例如，逆转录酶，由于其低分子量，将流经组合物中高达5％的水凝胶。将其与裂解剂一起，或是与或不与寡核苷酸裂解/释放剂一起应用，将导致以下事件。随着裂解剂溶解细胞膜，细胞条形码寡核苷酸将结合至水凝胶以在细胞膜存在的位置形成壳。释放的rna将结合至在细胞膜存在的壳上固定的寡核苷酸，逆转录酶将合成cdna。这就是条码化反应。一旦发生，水凝胶可以被溶解，制备ngs文库的最终步骤就可以批量完成。
15.上述工作流程都不需要微流体技术(芯片、油和仪器)，且批量发生。这种形式的一个好处是可支持多步骤反应。例如，如果需要dna基因型信息，流经水凝胶的第一试剂可以是蛋白酶k，例如热敏蛋白酶k。其将消化核小体和染色质辅助蛋白，使dna可及于进一步的分子生物学。通过对细胞膜的破坏，细胞条形码寡核苷酸可以在细胞膜存在的地方结合形
成壳。蛋白酶k可以失活，dna聚合酶与试剂一起流入水凝胶中，例如，可以发生通过模板导向-dna合成条码化。一旦条码化，文库制备的最后步骤可以在水凝胶内部或外部进行。
16.细胞可以在其原始培养基中与水凝胶材料混合。一旦固化，可以洗涤水凝胶以去除培养基。此外，由于每个细胞都会有一组细胞条形码克隆的寡核苷酸，所以水凝胶基质中捕捉的每个细胞会被条码化。这两个因素将细胞利用率从起始材料增加到接近100％。
17.在一些方面，提供个体细胞或个体细胞核和交联水凝胶的混合物。在一些实施方式中，个体细胞包含附接至个体细胞的细胞膜的异源寡核苷酸，或个体细胞核包含附接至个体细胞核的核膜的异源寡核苷酸。
18.在一些实施方式中，个体细胞包含锚定于个体细胞的细胞膜的异源寡核苷酸，或个体细胞核包含锚定于个体细胞核的核膜的异源寡核苷酸。在一些实施方式中，异源条码化寡核苷酸包含脂质部分，其中脂质部分将异源条码化寡核苷酸锚定在细胞膜中。
19.在一些实施方式中，水凝胶被共价连接至对异源寡核苷酸具有结合亲和性的分子。在一些实施方式中，水凝胶被非共价连接至对异源寡核苷酸具有结合亲和性的分子。在一些实施方式中，该分子选自下组：生物素、链霉亲和素、抗体、适配体、镍(ni)、铕(eu)或包含至少6个连续核苷酸的序列的多核苷酸，其与异源条码化寡核苷酸中的序列完全互补。
20.在一些实施方式中，所述细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方式中，核或细胞包括片段化的核dna，其中片段化的dna在片段末端包含共有衔接子序列。
21.在一些实施方式中，水凝胶包括藻酸盐、琼脂糖、聚丙烯酰胺、壳聚糖、透明质酸、葡聚糖、胶原、纤维蛋白(fibrin)、聚乙二醇(peg)、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)(聚hema)、聚乙烯醇(pva)或聚己内酯(pcl)。
22.在一些实施方式中，异源条码化寡核苷酸包含细胞特异性条形码序列和3’序列。在一些实施方式中，3’序列是至少5个连续的胸腺嘧啶的多聚t序列。在一些实施方式中，3’序列是至少5个(例如至少8个、至少10个、至少12个，例如6-30个)连续核苷酸的随机序列。在一些实施方式中，3’序列是至少5个连续核苷酸的目标基因特异性序列。在一些实施方式中，3’序列是至少5个(例如，5-100个，5-25个)连续核苷酸的衔接子。在一些实施方式中，衔接子可以在例如来自细胞或核的片段化dna的末端于共有衔接子序列互补。
23.在一些实施方式中，异源条码化寡核苷酸还包含5’pcr柄(handle)序列。
24.在一些方面，提供了将细胞特异性条形码加标签到细胞核酸的方法。一些实施方式中，所述方法包括：提供(i)具有附接至细胞的细胞膜的异源条码化寡核苷酸的细胞或分离的细胞核或(ii)包含附接至个体细胞核的核膜的异源寡核苷酸的细胞核；混合该细胞或核与液态水凝胶；在该细胞或核周围交联水凝胶，其中水凝胶形成固体凝胶；从细胞膜或核膜释放异源条码化寡核苷酸以产生释放的异源条码化寡核苷酸；允许该异源条码化寡核苷酸从细胞膜或核膜释放以定位在细胞或核周围的固化的水凝胶上；将异源条码化寡核苷酸附接至细胞多核苷酸或其拷贝或其cdna上，以形成条码化细胞多核苷酸；并溶解固化水凝胶或从固化水凝胶中提取条码化细胞多核苷酸，从而从水凝胶中释放条码化细胞多核苷酸，从而将细胞特异性条形码加标签到细胞核酸上。
25.在一些实施方式中，允许包括将从细胞膜或核膜释放的异源条码化寡核苷酸结合至细胞或核周围的固化的水凝胶。在一些实施方式中，允许包括将从细胞膜或核膜释放的异源条码化寡核苷酸扩散至细胞或核周围的固化的水凝胶，使得异源条码化寡核苷酸定位

㈤ 什么免疫PCR（Immune PCR）

博凌科为-为你解答：所谓免疫PCR（Immune PCR）就是利用抗体与DNA特异结合来检测抗原，把抗原抗体反应与PCR联合应用而建立的一种抗原检测系统。 在免疫PCR中，一个中介分子同时具有与DNA、抗体分子特异闷猛结合的能力。其一端连接DNA（标记 物），另弯弯一端连接抗原-抗体复合物，形成一个特殊的抗原-抗体-DNA连接物。作为标记物的DNA分子可用PCR的扩增，存在特异的PCR产物应证明作为 标记物的DNA分子已特异地与抗原埋罩闷-抗体复合物结合，而且表明了抗原的存在。有人采用SAP（streptavidin protein A）嵌合体作为中介物。它具有双特异性结合能力，一端为链霉亲和素，可结合生物素；另一端为可与IgG的Fc段结合的蛋白A。这样可特异地把生物素化的 DNA分子和抗原-抗体复合物连接在一起。 选用BSA作抗原进行免疫PCR实验，结果表明，可检测出580个抗原分子（9.610-22mol/L）， 而且可以完全避免其它非特异信号的干扰。与采用碱性磷酸酶的ELISA相比，其灵敏度可提高105倍，较常规的放名分析灵敏度也高出几个数 量级。 免疫PCR产物在普通的琼脂糖电泳上就可以检测出来，如用更好的方法来检测PCR产物，如放射性同位素，荧光物或酶等掺入到PCR产物中，可进一步提高其灵敏度和适用性。另外，如果采用不同大小标准的DNA 进行标记，在电泳时，可同时检测出多种不同的抗原分子。 PCR产物的多少与抗原结合量有关，如果用标准反应作对照，则可以对抗原的量进行估算。因此，通过改变 连接物的浓度就可以改变检测系统的灵敏性。其它因素，如抗体的浓度，PCR循环周期数，PCR产物的检测方法等也同样影响系统的灵敏性。

㈥ 链霉亲和素植物表达

链霉亲和素植物表达是链霉亲和素具有与亲和素(Avidin,AV)相似的生物学特性，如都能与4分子的生物素（Biotin）特异性结合，结合常数为1×10-15/M。同时，由于SA不带糖基、等电点低，在检测中具有比AV低的背景而大大提高了检测的灵敏性。
Streptavidin－biotin系统可偶联抗原、抗体、酶、寡核苷酸分子以及PE等荧光物质，因此，Streptavidin-biotin被广泛用于生物反应检测系统，用以检测抗原、抗体及核酸分子。

目前，国内外大部分基于酶联免疫反应、荧光分子标记免疫反应和分子杂交为原理的各种检测试剂盒均采用SA-biotin系统。但目前，国内所用SA均为价格昂贵的进口产品，因此研制和生产国产化的SA具有重要的现实意义和广阔的应用前景。

链霉亲和素与 生物素-构成链霉亲和素-生物素放大系统,是二十世纪七十年代后期发展起来的一种生物反应放大系统，通过一分子亲和素和四分子生物素之间特异结合实现信号放大，还可以通过多级级联放大实现信号多级放大，在生物学特别是免疫检测中有越来越广泛的用途。

链霉亲和素是与亲和素具有相似性质的一种蛋白质，都具有与生物素特异结合的能力，结合常数高达1015M。同时，由于链霉亲和素等电点比亲和素低，且不含糖基链，故在检测中的灵敏度和特异性都高于亲和素，建立在此基础上的生物素-链霉亲和素系统的应用比生物素-亲和素系统有更大优势。

我公司生产用链霉亲合素-SA菌株及生产工艺均自国外原本带回。生产工艺稳定，保证质量，常年提供产品，确保供应。

我公司生产的SA单体经SDS-PAGE检验分子量为17.2KDa。经论证，完整的SA溶解性差、易于聚集，核心SA被蛋白酶水解掉了与活性无关的某些末端序列，一方面提高了结构的稳定性；另一方面由于减少了空间位阻，使SA更容易与生物返族前素标记的大分子发生反应。

SA的纯化是用2-亚氨基生物素琼脂糖珠4B 凝胶(Sigma 产品)进行亲和层析纯化，同时以离子交换进行进一步的精细纯化。

SA，分子量穗做为58KDa,生物活性15.7U/mg，接近理论值（16.8U/mg）并进行了活性测定。

SA溶解漏清与保存：我公司提供的SA产品，不含任何盐离子，用户可以根据自己的试验需要，使用不同的缓冲液进行溶解，溶解后应放与-20°C保存，避免反复冻溶。

㈦ 怎么样在CA中筛选出包含一特定结构的新物质

摘要：大肠杆菌可以应用介电电泳从含有人血细胞的混合物中分离出来，然后在一个微构造生物电子芯片上通过蛋白水解消化电子溶解。铂微电极利用交流电场分离细菌至25个微位置，这些位置上每个都有一个附加的铂微电极，电极直径是80μM，相邻电极中心间的距离是200μM。细菌分离后用一系列高电压脉冲溶解，溶解产物包括有一系列的RNA、质粒DNA和基因组DNA。溶解产物进一步在另一个生物电子芯片上用电来提高杂交进行检测分析。介电电泳分离细胞后，然后在一个电子活跃的芯片上进行的电子溶解和消化，这种方法可能作为样品的分离在一个完整的DNA/RNA分析系统中，作为用于芯片杂交分析的样品制备过程中可能很有潜力。

用于生物分析特别是用于DNA杂交的微型生物芯片，包括样品的制备及检测的整套系统中具有很大的潜力。这样的一个系统中的第一部分的结束即样品的制备，在整个过程中证实是最难者隐整合的部分。

目前已经开发了好几种分离细胞的方法。微小的硅玻璃滤过芯片可用来从人全血细胞中分离白细胞，通过加热可以从这些首世厅分离的白细胞中提纯溶解产物，这些产物可直接在同一张芯片上进行PCR扩增。已有人做过用在硅片的基质上刻蚀着许多微电极的微构造机械筛床通过电脉进行细胞分析。细胞的运输是通过电渗和电泳泵完成的，随后在在微构造上进行细胞的化学溶解。此外，在所有用芯片进行细胞分离的技术中，介电电脉法分离细胞是应用最广泛的方法之一。极化颗粒包括那些没有净电荷的粒子，在非均一的电场中受到电泳牵引力的作用，其条件是这些颗粒有效的极化作用与周围介质的有效极化作用是不同的。不同细胞类型移动的方向决定于（1）与表面电荷相关的电子双层外膜（2）细胞膜或细胞壁的传导性和介电常数（3）形态和结构。介电电脉已用于分离那些携带活的或无活性的人群、革兰氏阳性和阴性菌、病毒和癌细胞。

我们报道在一个微构造芯片上，根据提取的RNA 和DNA的电子扩增杂交这一电子样品制备过程的进展。样品制备过程始于从血细胞中分离大肠杆菌，该过程通过在一个覆盖有25 个特定位置的微电极的矩阵的一个硅芯片上介电电脉进行的。被分离的细菌在血细胞被洗脱后依然存在于电极上。原核细胞通过这种方法进行分离，然后通过提供一系列高电压脉冲进行电溶解，提取出一系列的核酸。提取的RNA和DNA然后运用生物芯片进行分析。

结果

从血细胞中介电电泳分离大肠杆菌、分离的大肠杆菌电子溶解、用蛋白酶K消化蛋白质都在一个流动池中一张微生物电子芯片上完成。为了提供介电电泳的交流电场，尝试两种不同确定位置的模式。图1表示5×5电极矩阵的square-wall和checkerboard两种方案的图解和对应的从交流电场（10KHz正弦波，相邻峰至峰10V）计算而来的对应的计算机模型。在square-wall模式中位置的确定,相同方框中的电极与相邻的最近的框中的电极有相反偏电压。Checkerboard模式中，每一个电极与相邻的最近的电极有相反的偏压。这个电场分布模型表明一个电场的有规律分布能够应用用Checkerboard定位模式得到，但是这种模式应具有在电极和电极周围的最大值之间的整个范围内的确定范围的最小值。相反，这种模型也表明，虽然区域的最大值固定在电极上，但是square-wall模式产生的区域最小值被播散。

图1：（A）和（B）分别为两个5×5的电极的定位Square-wall格式和checkerboard 格式；（C）和（D）分别为交流电场分布的相应的计算机模式，颜色从红、橘红、橘色、黄色、绿色和兰返没色分别代表从最高到最低的电场梯度。

图2. （A）和（B）分别为经过预打湿的Square-wall和checkerboard经过覆盖的芯片；（C）和（D）为两种定位格式的分离结果（电场最大区域为白色阴影区，电场最小区域为红色阴影区）；（E）和（F）是两种格式经过完全的清洗过程。

图3. 通过电解得到的大肠杆菌的核酸的琼脂糖分析。1为λDNA Hind III 酶解的标记；6为ΦX174 Hae III 酶解的标记；2为超螺旋的pCR2.1质粒；3为线性的pCR2.1质粒；4为经过RNase酶解的电解液；5为未经RNase酶解的电解液。

图4 从大肠杆菌的电子溶解液中提取的质粒DNA的杂交。电极模式依据X-Y轴的格式进行设计的，X轴是从上开始，Y轴是从左开始。（A）在5-5位置电极上的是用来证明捕捉探针的黏附性及电子杂交的特异性的合成的寡核苷酸RCA5，被与之互补的探针ATA5被定位于5-5点，与之不互补的探针被定位于5-4点，在4-5点没有探针。（B）以下点为合成的对照靶标的杂交 点1-5为互补的探针；点1-4为非互补的探针；点。点3-1为大肠杆菌基因组DNA溶解液对照的电子杂交，点3-5为没有插入片段的质粒DNA溶解液对照的电子杂交。3-2和3-4分别为具有与插入片段互补的探针；在以下点表明具有插入片段的质粒的不同稀释浓度的杂交：5倍稀释，点1-1，1-3，2-1和2-3为具有互补探针的点，点1-2和2-2为具有非互补探针的点；3倍稀释，点4-1；4-3，5-1和5-3为具有互补探针的点，点4-2和4-4点为非互补探针的点。

图5 应用电子溶解从大肠杆菌中提取的RNA的杂交结果。合成的对照靶标RCA5被电子定位于点1-5和1-4，1-5上具有互补的探针，1-4上具有非互补的探针。溶液被定位于在1和3列上，这些点没有进行严谨性过程的杂交，点1-1和点1-3为3倍稀释的材料，点2-1，2-3，3-1和3-3为5倍稀释的材料。（B）为应用电子严谨性包含RNA的溶解物的夹心杂交的结果。列1和列2 应用负偏压去掉没有杂交的核酸；在列1中的点包含有特异性探针，在列2中的点含有非特异性的点。列3是没有经过副偏压提高严谨性的特异性杂交的结果。

在采用介电电脉从血中分离大肠杆菌之前，用分离缓冲液冲洗芯片，把渗透膜打湿，并且去除任何水泡。在实验开始时，用预洗过的square-wall式（Fig.2A），电极表面出现黑色，在细胞混合物被引导到流动细胞后分离近4分钟结束。分离的结果（Fig.2C）与区域分离模型（Fig.1C）比配。大肠杆菌占据电极的整个区域（电极上的白色阴影部分对应最大区域），血细胞在电极之间（红色阴影、V型部分对应最小区域）聚集。然后，用分离缓冲液冲掉在电极之间的最小区域松散聚集的血细胞。在冲洗过程中，因为交流场持续存在，分离后的大肠杆菌依然在电极的最大区域上。冲洗完成后，分离的大肠杆菌在所有25电极上（Fig.2E）显示为白色阴影部分。

也可以用checkerboard模式（Fig.2B），在细胞混合物被引导到流动细胞后近4分钟分离结束，分离的结果（Fig.2D）与区域分布模型(Fig.1D)相匹配，电极上的白色阴影部分表示保留的细菌细胞的所在地，红色阴影部分表示在最小极聚集的红细胞和白细胞的混合物，在冲洗阶段将聚集在最小极的血细胞去除。单个大肠杆菌与红细胞不能被溶解有2个原因（Fig.2D），首先这些细胞相对于电极的直径（80μm）来说非常小（<5μm）；其次因为通过介电电脉分离的细胞是个被称作“珍珠链”的三维形式存在，用我们的装置来使所有的细胞聚集是很困难的。

电溶解是应用在四个相反电极和25个更小的细胞聚集电极之间一系列脉冲（500V400脉冲带每20脉冲交替的电极脉宽50μs）进行的。为了使冲洗缓冲液中的蛋白酶K能够消化污染的核酸蛋白质，芯片上的溶解混合物在50℃下培养20分钟。琼脂凝胶电泳(Fig.3)结果表明质粒、基因组RNA和DNA二者都能从细胞中提取出来，基本上对核酸无明显损害的。通过比较经过RNase A处理和没处理的溶解产物来确定RNA带。溶液经过RNase A消化后，所有小于1078bp的带都消失，也就是说这些带由RNA组成。同时，提取的质粒DNA保持超螺旋（无刻蚀）形式，与所买的超螺旋质粒相比较具有相同分子量。

对于杂交，消化溶解产物从细胞分离芯片上移出，用杂交缓冲液稀释3倍和5倍，并加热使其变质。然后将稀释过的溶解产物转移至分析芯片上，这些分析芯片表面覆盖着链亲和素琼脂糖，并通过电定位在电极的特殊微位置上定位生物素捕捉探针。这些捕捉探针包括与插入在质粒中的片段互补的寡核苷酸，这一片段是沙门氏杆菌的Spa0区域来的296碱基，与之互补的寡核苷酸探RCA5来自人的DQα基因，这些靶序列，包括溶解产物和与捕获探针互补的含SpaO区域序列的模式靶样寡核苷酸，通过一个夹心杂交过程进行检测。在这个检测过程，目的DNA/RNA首先与固定的捕捉探针进行杂交，然后被第二个探针进行结合，逐渐显现出结果（第二个探针为含荧光团报告分子或标记探针）。

为了进行杂交，每个靶序列都是通过电子定位在分开的带互补和非互补探针的微位置上（Fig.4），作为一个正对照，合成的靶样RCA5带有一个荧光集团，首先被固定在有互补和非互补探针的微位置上，化学固定和杂交工作如预期所想的。此外，在SpaO区域的固定着模式靶样寡核苷酸探针的微位置上的信号水平几乎是含非互补探针的微位置上的信号水平的2倍高。下一步，用RNase-A已消化了的含插入SpaO质粒和基因组的溶解产物被定位和杂交在选出的具有互补和非互补探针的微位置上。来自3倍和5倍稀释的溶解产物与互补探针信号水平比非互补探针上的信号水平强4倍和2倍，这也证明杂交的特异性。作为一个附加的负对照，一个没有嵌入Spa0质粒的溶解产物与不同微位置的相同探针进行杂交。如预期的那样，在互补和非互补探针位置上的信号水平都低。

用RNase A处理溶解产物的杂交结果和对照结果表明电溶解产物经过加热变质的质粒DNA能直接用于杂交分析。从稀释3倍的溶解产物得到的信号水平与从模式靶样寡核苷核得到的信号水平相当。

用没有用RNaseA处理的溶解产物做相似的的杂交实验。模式靶样寡核苷酸作为一个正对照，可以看到一个特殊的电子杂交（Fig.5A）。包含RNA的溶解产物在杂交缓冲液中稀释3倍或5倍，在特殊的微位置上进行电固定和杂交。为了提高杂交至溶解产物的16S核糖RNA的特异性，还试着用电来改进缺点，在互补探针的信号水平至少比非互补探针信号水平强4倍（Fig.5B），固定在捕获探针上的模式靶样寡核苷酸的信号水平几乎是非互补探针信号水平的2倍。从电子溶解产物来的经过加热处理的核糖体RNAs被直接用于杂交分析，同时包括一个严谨的洗涤过程。从稀释3倍的溶解产物得到的杂交信号水平能够与特异性寡核苷酸靶得到信号是相当的（Fig.5B）。

讨论

从人血细胞中分离大肠杆菌是应用生物电芯片来完成的，这种芯片最初的设计是用来应用电子学来提高杂交分析的。从理论模拟和实验结果表明用checkerboard定位模式应用介电电泳分离大肠杆菌，比用square-wall定位模式（即从最小极至最大极）产生的分离效果更好。在应用的区域进行明显的分离，更容易洗去不想要的细胞。虽然用于该研究的芯片只有25个电极，但应用这种方法分离大肠杆菌用于质粒DNA和RNA杂交分析已经足够了。通过用一个带已提高密度的微电极的矩阵，在很短的时间内就能获得想要细胞的高覆盖区域。

芯片表面覆盖着一层琼脂糖渗透膜。这层膜能够降低细胞的粘合力，由于这层膜的电场处于最小值，因此很容易将不想要的细胞洗去。这些分离的细胞也与金属电极有一定的距离，因此被电极表面上发生的电化学所破坏的可能性很小。为了捕获细胞的特殊类型，琼脂糖膜能够提供一个化学附着物的功能。例如，链球菌能被共价结合到琼脂糖上，因此链球菌能够用来固定生物素标记细胞特异性单克隆抗体。

带有RNA靶样的非特异性背景荧光较强。严谨的电子冲洗在产生非特异性信号方面，甚至在很低的电条件下都有效，这表明如果在那些必须检测多拷贝的质粒DNA的实验中，可以用直接信号检测，不再需要用酶增殖法。

我们所选大肠杆菌和血细胞的混合物是个随机的模型，我们也分离了溶血性链球菌（Micrococcus lysodeikticus）、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)和培养的来自血细胞的子宫颈癌细胞。这些细胞和其他细菌从混合物中的分离，表明电分离方法在医学诊断、食物检测、水质监测和其他领域中的应用有很大的潜力，通过电休克得到的从细菌提取的溶解产物包含一系列核酸其中除了琼脂糖凝胶电脉能发现的最小的剪切物以外，还有RNA、超螺旋质粒DNA和没有降级的高分子量的基因组DNA。用提取的质粒和RNA可获得特殊的杂交信号。用基因芯片研究基因表达已经引起了很大的重视，用基因芯片进行RNA的杂交在检测基因表达方面很有潜力。这里所用的方法可能证明在基因表达研究上很有价值，这个研究价值就在于它能从大量其他细胞中分离一些特殊类型的数量极少的细胞，用于一些特殊亚种群的RNA的研究。

虽然细胞分离和溶菌是在一张芯片上完成的，但是加热变性和分裂以及杂交是在另一张芯片上。我们预测将来两张芯片和所有过程（包括核酸在芯片上的扩增）能在一个简单的盒子里。

实验操作步骤

正如描述的那样完成生物电子芯片的构造和增厚。

生物电子芯片的微构造：带5×5铂微电极的硅芯片是由标准的半导体技术加工成的，相邻电极中心至中心的距离是200μm，每个电极的直径为80μm，热处理的氧化硅上喷上一层厚度为100nm的钛－钨层，然后再覆盖300 nm厚的铂层。金属的图形由光刻印刷技术与王水湿性方法完成。在此金属图形上通过原浆扩增和化学蒸发沉积低密度氮化硅（1.3μm）和氧化硅（100nm）的薄膜。在通过光刻印刷技术和等离子体刻蚀法被刻蚀至微电极上。将芯片线焊至印刷电路板上，制成一个含符合个人电脑内存卡国际组织标准的有个人电脑卡的芯片。

渗透膜离心覆盖至芯片上：用异丙醇冲洗然后用去离子水洗涤芯片，再在氮气流中吹干。胶卷(cartridge)承担着将这个干燥芯片垂直地置于原浆清洁船中，用氩（250mtorr，250w）清洁5分钟。

谷胱苷肽琼脂糖（Sigma，St.Louis，MO）A.2.5％基质渗透膜（BPL）溶液如下准备，谷胱苷肽琼脂糖（250mg）加入去离子蒸馏水中（10ml），混合，然后煮沸8分钟，完全分离的琼脂糖溶液预热（65℃），微量离心管用1.2μm孔径的洗涤过滤器，过滤的琼脂糖溶液在65℃中平衡5分钟。上层渗透膜包含固定的允许生物素探针附着物以链霉亲和素-生物素交互作用为媒介的链霉亲和素，如下制备，通过一个含氯化钠（250mM）和磷酸钠（10mM，PH7.2）的溶液保留链霉亲和素（Boehringer Mannheim, Indianapolis,IN），得到链霉亲和素溶液。这个链霉亲和素溶液与温度平衡溶液BPL结合产生2％琼脂糖和1mg/ml的链霉亲和素。这个温暖的BPL溶液（50ml）被放至每张芯片上，并且在室温下用离心机（EC101D，Headway Research，Garlan，TX）在2500rpm离心20秒。在BPL凝固后，上层温暖的渗透膜溶液（50μl）被放置在BPL的最上层，并且在室温下用10,000rpm离心机离心20秒。然后这芯片在37℃中培养30分钟。为了在谷胱苷肽琼脂糖和链霉亲和素胺之间得到Schiff基质联接，新鲜制备的硼氢化氰钠（sodium cyanoborohyidre）（0.2M）/硼酸钠（0.3M），PH9.0用芯片在常温培养1小时，剩下的乙醛组在硼酸钠（0.3M），PH9.0，常温下30分钟，浸入甘氨酸缓冲液(0.2M)中，芯片最后用去离子水冲洗5分钟，干燥4h然后储藏在4℃的环境中。

芯片的胶片装备：一个碳酸酯模型流动细胞用紫外线胶合法（Norland 68，Thorlabs，New Brunswick，NJ），即200W紫外线照射45秒（4joules/cm2），被胶合在芯片上。然后滑动的盖板依上述的程序被胶合至上层的流动细胞上，形成一个密封室，带瓶颈塞的塑料管被嵌入流入和流出的流动细胞，然后胶合至上述的部位。流动细胞的最后容量约7.5μl，从渗透膜至最上层盖（滑动盖板）的距离是0.45mm。

细胞培养：从沙门氏菌的SpaO区域来的A 296bp片断被扩增，然后用体外基因 T/A克隆试剂盒（Invitrogen，San Diego,CA）克隆至质粒pCR2.1（3890bp）上，按照试剂盒的说明完成连接，连接产物用于将INVαF’转移至合适的大肠杆菌上。转移产物在金属板上扩增，这个金属板含加有氨苄青霉素（100μg/ml）、80μl X-gal(20mg/ml)和4μl异丙基硫代－β-D一半乳糖苷（40mΜ）可以兰/ 白扫描的 Luria－Bertani（LB）介质，用SpaO特殊引物的PCR筛选出真正的克隆，用琼脂糖凝胶电脉检查扩增片段。经PCR筛选的克隆片段在LB介质中于37℃扩增一整夜，并且在225rpm摇动的氨苄青霉素（100μg/ml）液中培养。

细胞混合液的制备：细胞分离缓冲液包括0.05×TBE(4.5μM Tris,4.5μM硼酸，0.1μM EDTA，PH8.2)和250mM蔗糖，PH8.2。缓冲液的传导性用Accumet pH meter 50（Fisher Scientific，匹兹堡，PA）测量是114μS/cm，细胞分离缓冲液的传导性的选择是非常小心的，为了确保大肠杆菌受制于介电电脉的正极，并且所有人血细胞受制于介电电脉的负极，培养的大肠杆菌细胞悬浮液（1ml 含约2×109细胞）被离心机在325G离心4分钟，然后去除浮在表面的一层。在细胞分离缓冲液（1ml）中洗去细胞球，在相同的条件下依上面所述小球化。然后细胞在细胞分离缓冲液（1ml）中重新被悬浮，将新鲜的EDTA一抗凝血剂（20ml含1.46×105白细胞和9.38×107红细胞）加入大肠杆菌的悬浮液中，细胞悬浮液的传导性是315μS/cm。

介电电脉系统：大肠杆菌受限于正极的介电电脉牵引力，血细胞受限于相反的介电电脉牵引力的频率，通过在不同条件下暴露细胞混合物，凭经验被确定。这个研究由逐渐提高开始为5KHz的正弦波频率（相邻峰至峰10v）被传导。当频率达到10KHz，能发现大肠杆菌的分离物和剩余的人血细胞。这个电参数下面会被用来分离大肠杆菌。

介电电脉分离细胞：为了用介电电脉从人血中分离大肠杆菌，一种没用的胶卷被利用，首先通过流动细胞缓冲液冲洗芯片，细胞混合液被泵入流动细胞中，然后泵功能关闭。整个5×5的电极序列通过10v相邻峰至峰，10KHz正弦波固定在checkerboard 的斜线上，泵重新启动开始洗涤过程，当样品混合物从样品/缓冲液池中几乎洗净时，加入分离缓冲液在交流信号仍然存在时从流动细胞中洗去残余样品。洗涤完后，这个含蛋白酶K（490μg; Boehringer Mannheim）的分离缓冲液被泵入流动室。

电子分解产物：为了溶解细胞，在4个计数电极和25个更小的细胞富极电极之间需要提供一系列脉冲（500v，50μs脉宽），这个脉冲是这样提供的，在两组电极间每20个脉冲交替产生极性，每个溶菌过程需总共400个脉冲，这个溶解产物在50℃中培养20分钟，使污染的DNA蛋白消化，溶解产物（300μl）从流动室中被泵出收集，介电电脉分离细胞和电子溶菌的组合被重复6次，所有的溶解产物被集中在一起，收集的溶解产物用16,000G离心5分钟，重新得到浮在表面的一层，并加入2 升冰酒精（-20℃），混合，在16,000G离心10分钟，去掉浮在上面的一层，小球在空气中干燥，然后再溶解至0.05×TBE缓冲液（300μl）中，再溶解得到的碎片溶液（30μl）含Rnase A（3μl，10mg/ml，Boehringer Mannheim），然后在37℃中培养30分钟。

胶质电脉：将600mg溶解的琼脂糖加入50ml 1×TBE的缓冲液中制成A1.2％琼脂糖。在琼脂糖溶液变成固体前还要加入溴乙啶（2.5μg），有或没有RNase的经蛋白酶K处理过的溶解产物样品延标记的DNAs加入啫哩中。

DNA杂交分析：一个寡核苷酸捕获探针，5’－biotin－-3’, 对Spa0区域有特异性的质粒DNA通过辅酶在5’末合成。探针被50mM L一组氨酸缓冲稀释得到一个终浓度500nM，捕获探针被固定在覆盖有链亲和霉素琼脂糖的电极上（固定在左面的第一和第三列和1－5和3－5上），但会有正电磁场，这电磁场来自于各个电极上200nA持续1分钟的交流电，之后去掉剩余的探针溶液，芯片用50nM L一组氨酸缓冲液冲洗。生物素控制的寡核苷酸捕获探针ATA5（pad5－5）和不互补的链球菌A(GAS)探针（固定在第二和第四列）的合成，用上面所述来完成，ATA5与RCA5（ref.13）互补，GAS探针来源于化脓性葡萄球菌的speB基因，GAS探针序列如下所示：5’-biotin--3’。一个含互补序列的64－mer的模拟靶（50pM）捕获探针被合成，序列如下：5’--3’。为了测试控制，对捕获探针ATA5特异性的经Bodipy Texas Red (BTR)标记在靶样寡核苷酸RCA5（ref.13）（50pM）通过在每个电极上给450nA的交流电3分钟，平行杂交至固定的ATA5探针（pad5-5）和邻近的非特异性GAS探针（pad5-4）上。杂交完后，用新鲜的L-组氨酸缓冲液冲洗，通过150直交流脉冲（1μA 每0.1s开和0.1s关）同时纠正电磁场来完成冲洗，控制杂交试验（i.e.,捕获探针[pad1-5]和非特异性GAS探针[pad1-4] 合成靶的杂交，变性大肠杆菌DNA和带特异性捕获探针[pads 3－1和3－5]和非特异性GAS探针[pads 3-2和3－4]的质粒pCR2.1 [上面提到的不带296bp插入]的混合物用上面所述的相同操作来完成，为了DNA容易杂交，经蛋白酶K处理的溶解产物片断在L－组氨酸缓冲液中被分别稀释3倍和5倍。含稀释溶解产物样品的管子放在100℃水浴中10分钟，打碎DNA（最后DNA序列在300bp至1kb之间），并且得到一个单一的DNA。如上面所述用每个靶样（与5倍稀释的靶样互补的探针在pads1－1，1－3，2－1和2－3与3倍稀释的靶样互补的探针在pads4－1，4－3，5－1和5－3上，非互补探针在与5倍稀释的靶样非互补探针在pads1－2，2－2和与3倍稀释的靶样非互补探针在pads4－2，5－2）来完成杂交。为了传导2层分析，报告探针（5’-BTR-GTTGAAATGACCTAACTTTTTCG-3’）按以下方法杂交，芯片在室温下放入1×STE（150mM硫化钠，10mM Tris－HCI,1 mM EDTA,PH8.0）含超声处理的变性的小牛胸腺DNA（100μg/ml，Sigma）的缓冲液中放置5分钟，然后去除缓冲液，将10μl混合液（500nM在含小牛胸腺DNA的1×STE缓冲液中的报告探针）置于芯片上，在室温中放置5分钟，芯片用由0.2×STE制成的1％SDS的缓冲液10μl冲洗5次，然后常温下在5ml相同的缓冲液中浸10分钟，最后用0.2×STE冲洗5次。

RNA杂交：寡核苷酸捕获探针5’-biotin- TTTA-3’对16SRNA有特异性，在3，末与之结合，探针在50mM L－组氨酸缓冲液中稀释，得到终浓度为500nM，捕捉探针固定在带电磁场的链亲和素的实验微位置上，正电磁场通过在每个电极上200nA特续1分钟的交流电产生，去除剩余探针溶液，芯片用50mM L－组氨酸缓冲液冲洗，GAS探针（非特异性控制）的固定是通过如上所述的操作来完成的，为了测试捕获探针的特异性，合成的靶样寡核苷酸（5’-TGGAGTATGCAACTCG-3’，50pM）通过持续给每个电极450nA3分钟的交流电平行电杂交至固定的互补探针和邻近的非互补探针上。为了使16SRNA容易杂交，经蛋白酶K处理过的溶解产物碎片分别用L－组氨酸缓冲液稀释3次和5次。同时稀释溶解产物样品与质粒DNA杂交，杂交完成后，新鲜的三磷酸缓冲液(20mM Tris-base,20mM di-basic 磷酸钠PH9.0)取代旧的L－组氨酸缓冲液来完成严格的电子冲洗。冲洗靠同时将70直交流脉冲至一排负的电磁场，750nA每pad0.1s开0.1s关来完成。为了传导2层分析报告探针的杂交如下：报告探针的混合序列为：5’-BTR-TCC GACTTCATGGAGTC-3’，5’-BTR-TGAGGTCCGCTTGCTCTCGCGA-3’和 5’-GGTCGCTTC TCTTTGTATGCGCCATT-BTR-3’。芯片在室温下放入1×STE（10μl）含超声处理的变性小牛胸腺DNA的缓冲液中放置5分钟，然后去除缓冲液，将15μl的混合溶液（500nM在含前述小牛胸腺DNA的1×STE缓冲液中的报告探针）加在芯片上，在室温中放置5分钟。然后芯片用0.2×STE 制成的1％SDS的缓冲液15μl冲洗5次，在常温下浸入5ml相同的缓冲液10分钟，最后芯片用0.2×STE冲洗5次。

㈧ 我问师兄如何让蛋白纯度更高，他只告诉我这点……

硬核 | 细胞培养哪物羡笔记如何精读一篇文献献给初学者：如何选择合适的荧光蛋白又被蛋白纯化折磨到哭泣，如果早知道这点就好了

用 His-tag 做蛋白纯化时，或多或少有这样的经历：要么蛋白纯度低、纯化出来的蛋白失去原有结构，要么功能受到影响、难以从哺乳类细胞表达系统中纯化出目标蛋白。

作为一个孜孜不倦积极进取的人，我觉得在实验之前得先多做做功课，于是跑到隔壁实验室向师兄请教。师兄跟我说 Strep-tag 系统具有纯化过程温和，目标蛋白纯度高，且相容于多种表达系统的特性，愈来愈受到大众的欢迎。但是，对于 Strep-tag 这个纯化系统是怎么发展起来的，为什么蛋白纯度高，很多人可能不知道，而这点得从功能性抗体开始说起……

1.功能性抗体的出现

随着生物制药技术的发展，抗体也因此成为科学家研究的热门领域。但在 80 年代初，功能性抗体的表达一直是个问题，酵母表达系统中表达出来的蛋白只有部分具有功能，在其他的微生物表达系统中，也没有成功的先例。

一直到 80 年代末，一个具有功能性的 McPC603 抗体的 Fv 片段终于成功的在 E.coli 被中表达出来「1」。这一方法的出现，使得科学家能更快速的表达具有不同基因变异的抗体片段，并能对这些变异所引发功能改变进行检视。

2.抗体纯化不简单

将重组抗体片段表达出来之后，必须将此片段纯化出来，当时多以亲和层析法搭配目标抗体的抗血清（antiserum）进行蛋白纯化，但这一方法常常受到限制：在研究一个未知目标蛋白时，常出现没有抗血清或是相容抗体的情况，这严重影响了实验进度。为此，科学家尝试找出更有效的一步纯化法。

首先，他们考虑在重组蛋白上加入短肽标签（tag），当时市面上已有 myc、flag、KT3 epitope 等标签，但这些主要适用于侦测目标蛋白，纯化蛋白效果非常有限，或非常昂贵。

随着 His-tag 的问世，让固定化金属离子亲和层析法（Immobilized Metal Affinity Chromatography, IMAC）纯化目标蛋白变为可能，这的确提高了蛋白纯化的效率。

但是His-tag 仅适用于纯化，无法用于侦测目标蛋白，而且使用His-tag 进行Fv 片段纯化时，高盐浓度常使得Fv 片段解离成两个单体（VL 及VH），难以保持抗体的功能性及正确结构「2」。

3.更高能的短肽标签呼之欲出

要解决这些问题，科学家需要找出一个具备以下功能的短肽标签：

能被融合到目标蛋白上，且不会影响蛋白功能 能直接以现有试剂侦测出来 与配体结合稳定、特异性高且容易控制

经过一番搜索，发现链霉亲和素（Streptavidin）在特定情况下，能与不同短肽进行可逆性的结合，再加上其与生物素（biotin）极高的亲合力，且与背景蛋白的非特异性结合机率低，链霉亲和素已被应用在许多检测系统中，甚至能做为一个稳定的介质来固定蛋白。又因为链霉亲和素在不同溶液条件中稳定性好，较抗体来的高，所以能够重复被利用。

因此，90 年代初，科学家开始寻找一个能与链霉亲和素特异性结合的亲和标签「2」。

4.终于找到了第一代 Strep-tag 系统 Strep-tag vs Streptavidin

因先前已知可用E.coli 系统表达出具有功能性的Fv 片段来「1」，科学家又希望能确认标签是否会影响蛋白功能，所以选择了已知的D1.3 抗体Fv 片段做为实验模型，以便检测加上的短肽标签是否影响了这片段与其抗原结合的特李拍性「3」。

接着，一连串能与链霉亲和素结合的标签被接到VH domain 上，大量筛选之后，得到了一个适用于进行一步纯化的Strep-tag（Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly -Gly）「3」，与生物素相比，Strep-tag 和链霉亲和素间的亲和力较低，因此可以使用生物素衍生物Diaminobiotin，进行在生理条件下的温和洗脱。又因整个纯化流程温和，含盐浓度低蚂宏，纯化出来的 Fv 片段完整且功能不受影响「3」。

除此之外，这个标签还能被应用在 Western blot 或 ELISA 实验中，以链霉亲和素酶偶联物（Streptavidin-enzyme conjugates）来检测纯化出的 Fv 片段。后续测试了以 Strep-tag 来纯化抗体以外蛋白的可能性，证实了这个一步纯化系统可以被广泛使用在不同类型的蛋白上「3」。

5.因为不完美，所以有了第二代 Strep-tag II vs Strep-Tactin®

但 Strep-tag 仅能接在目标蛋白的 C 端，对于需将标签接在 N 端或是蛋白内部的实验，非常的不实用。因此科学家进一步优化了这个标签，便有了现在被广泛使用的 Strep-tag II（Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys）「4」。

但即便足以用于蛋白纯化，科学家对 Strep-tag II 与链霉亲和素的结合强度低这点仍不甚满意，因为在比较特殊的纯化条件中效率会受影响。于是进行了链霉亲和素的改造，发展出 Strep-Tactin®。

Strep-Tactin®:Strep-tag II 的亲和力较 Streptavidin:Strep-tag II 提升了近 100 倍，这个改变使得洗脱时需改用脱硫生物素（Desthiobiotin）「5」，但过程一样温合。这就是二代 Strep-tag 系统，在过去近 20 年间，逐渐被广泛应用于纯化或侦测蛋白质中，还甚至发展出细胞分离检测的方法「6」。

6.总觉得还能更好，一起看看第三代 Twin-Strep-tag vs Strep-Tactin®XT

即便亲和力已提升，在某些状况下，Strep-Tactin® 使用仍有所限制，尤其是在需要极高亲和力的应用之中，例如检测蛋白质间的交互作用、或是从目标蛋白浓度低的样本中进行纯化。

因此科学家利用总结合力（Avidity）的原理，将两个 Strep-tag II 以 linker 连接在一起：Twin-Strep-tag「7」。这一新标签的出现再度提升了目标蛋白与Strep-Tactin® 的链接强度，改善了低浓度样本纯化效果「8」，还能于抓取蛋白复合体、检视蛋白间的交互作用「7,9 」。

美中不足的是，Strep-Tactin® 在变性条件下并不稳定（例如：使用尿素时），无法进行纯化，且进行批量纯化时，即使搭配 Twin-Strep-tag，效果仍有改善的空间。为此，科学家再次改造了 Strep-Tactin®，得到与 Twin-Strep-tag 亲和力更上一层楼的 Strep-Tactin®XT（XT 意指 extreme tight）「10」。

经过这次的优化，科学家首次创造出一个纯化系统，其中标签与配体的键结力几近共价，但链结仍保持可逆（注：Strep-tag II 也能与Strep-Tactin®XT 结合）。因亲和力的增加，即使经过多次清洗步骤，蛋白也不会从 Strep-Tactin®XT 上解离，提高了目标蛋白的得率。

需注意的是，洗脱步骤必须使用生物素，但是整个纯化流程与前几代一样温合，纯度超过 95%，这就是最新一代 Strep-tag 系统。用Strep-Tactin®XT 来纯化时，得率及纯度都提高；且Twin-Strep-tag 搭配后还能用在Biacore 芯片「11,12」、微量滴定板或ELISA 中来固定蛋白，进行后续检测，是一个多用途的亲和标签系统。

参考文献

1.Skerra A & Plückthun A（1988）Science, 240, 1038-1041.

2.Schmidt TGM & Skerra A（1993）Protein Eng., 6, 109-122.

3.Schmidt TG & Skerra A（1994）J Chromatogr A., 676, 337-45.

4.Schmidt TG, Koepke J, Frank R & Skerra A（1996）J Mol Biol., 255, 753-66.

5.Voss A & Skerra（1997）Protein Eng., 10, 975-82.

6.Knabel M, Franz TJ, Schiemann M, Wulf A, Villmow B, Schmidt B, Bernhard H, Wagner H & Busch DH（2002）Nat Med., 8, 631-7

7.Junttila MR, Saarinen S, Schmidt T, Kast J, Westermarck J（2005）Proteomics, 5, 1199-203.

8.Schmidt TG, Batz L, Bo L, Carl U, Holzapfel G, Kiem K, Matulewicz K, Niermeier D, Schuchardt I & Stanar K（2013）Protein Expr Purif., 92, 54-61.

9.Ivanov KI,Bašić M,Varjosalo M &Mäkinen K（2014）JoVE, 86, 51536.

10.Carl U（2016）Poster session presented at: PEGS Bosten 2016.

11.Dintner S, Heermann R, Fang C, Jung K & Gebhard S（2014）J Biol Chem., 289, 27899-910.

12.Yeliseev A, Zoubak L, Schmidt TGM（2017）。 Protein Expr Purif., 131, 109-118.

作者：IBA

图片来源：IBA

题图来源：pexels

话题： Strep-tag 系统, 功能性抗体, 生物素, 短肽标签, 蛋白纯化, 链霉亲和素

㈨ 可用于elisa的抗体有哪些类型

• ELISA的类码陆蚂型
  ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：
  （1）固相的抗菌素原或抗体，即"免疫吸附剂"（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原
  或抗体，称为"结合物"（conjugate）；（3）酶反应的底物。根据试剂的来源和标本的情
  况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。用于临床检验的ELISA主要
  有以下几种类型：

• 2.2.1 双抗体夹心法测抗原

• 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：
  1） 将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。
  2） 加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。
  洗涤除去其他迟埋未结合物质。
  3） 加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合
  的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。
  4） 加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。
  在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、
  AFP、hCG等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合
  物而建立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动
  物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相
  载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标
  抗体一起保温反应，作一步检测。
  在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标
  抗体结合，而不再形成"夹心复合物"。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，此时反应
  后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的
  吸光值相同（参见1.3.2，图1-4），如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，这种现
  象被称为钩状效应（hook effect），因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重
  时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常
  增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时，应注意可测范围的最高值。用
  高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。
  假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如HBsAg的a决定簇，也可
  用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在HBsAg的检测中应注意亚型
  问题，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型，虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应
  性，这也是用单抗作夹心法应注意的问题。
  双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（RF）的干扰。RF是一种自身抗
  体，多为IgM型，能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含
  有RF，它可充当抗原成份，同时与固相抗体和酶标抗悉局体结合，表现出假阳性反应。采用
  F（ab"）或Fab片段作酶结合物的试剂，由于去除了Fc段，从而消除RF的干扰。双抗体
  夹心法ELISA试剂是否受RF的影响，已被列为这类试剂的一项考核指标（参见6.2）。
  双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小
  分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。

• 2.2.2 双抗原夹心法测抗体
  反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应
  的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需
  稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBs的检测常采
  用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。

• 2.2.3 间接法测抗体

• 间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗
  体）以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法（见图2-3）。操作步骤如下：
  1）将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。
  2）加稀释的受检血清，保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗
  体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，血清中的其他成份在洗涤过程
  中被洗去。
  3）加酶标抗抗体。可用酶标抗人Ig以检测总抗体，但一般多用酶标抗人IgG检测IgG抗
  体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，
  固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。
  4）加底物显色
  本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包
  被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。
  间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结
  果，但应尽可能予以纯化，以提高试验的特异性。特别应注意除去能与一般健康人血清发
  生反应的杂质，例如以E.Coli为工程酶的重组抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能与受过
  E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗体发生反应。抗原中也不能含有与酶标抗人Ig反应的物
  质，例如来自人血浆或人体组织的抗原，如不将其中的Ig去除，试验中也发生假阳性反
  应。另外如抗原中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影响包被效果。
  间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性。病人血清中受检的
  特异性IgG只占总IgG中的一小部分。IgG的吸附性很强，非特异IgG可直接吸附到固相载体
  上，有时也可吸附到包被抗原的表面。因此在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白质
  （例如牛血清蛋白）再包被一次，以封闭（blocking）固相上的空余间隙。另外，在检
  测过程中标本须先行稀释（1:40~1:200），以避免过高的阴性本底影响结果的判断。

• 2.2.4 竞争法测抗体

• 当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特
  异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体
  量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。如抗原为高纯
  度的，可直接包被固相。如抗原中会有干扰物质，直接包被不易成功，可采用捕获包被
  法，即先包被与固相抗原相应的抗体，然后加入抗原，形成固相抗原。洗涤除去抗原中的
  杂质，然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应。竞争法测抗体有多种模式，可将标本
  和酶标抗体与固相抗原竞争结合，抗HBc ELISA一般采用此法。另一种模式为将标本
  与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合，洗涤后再加入酶标抗体，与结合在固相上的
  抗原反应。抗HBe的检测一般采用此法。

• 2.2.5 竞争法测抗原
  小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法
  进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相
  抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。
  小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。

• 2.2.6 捕获包被法测抗体

• IgM抗体的检测用于传染病的早期诊断(early diagnosis)中。间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或
  IgG抗体。如用抗原包被的间接法直接测定IgM抗体，因标本中一般同时存在较高浓度的
  IgG抗体，后者将竞争结合固相抗原而使一部份IgM抗体不能结合到固相上。因此如用抗人
  IgM作为二抗，间接测定IgM抗体，必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理，以除去IgG的
  干扰。在临床检验中测定抗体IgM时多采用捕获包被法。先用抗人IgM抗体包被固相，以捕
  获血清标本中的IgM（其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM）。然后加入
  抗原，此抗原仅与特异性IgM相结合。继而加酶标记针对抗原的特异性抗体。再与底物作
  用，呈色即与标本中的IgM成正相关。此法常用于病毒性感染的早期诊断(early diagnosis)。甲型肝炎病毒
  （HAV）抗体的检测模式见图2-7。
  类风湿因子（RF）同样能干扰捕获包被法测定IgM抗体，导致假阳性反应。因此中和
  IgG的间接法近来颇受青睐，用这类试剂检测抗CMV IgGM和抗弓形虫IgM抗体已获成功。

• 2.2.7 ABS-ELISA法
  ABS为亲和素(avidin)生物素(biotin)系统(system)的略语。亲和素是一种糖蛋白，分子
  量60000，每个分子由4个能和生物素结合的亚基组成。生物素为小分子化合物，分子量
  244。用化学方法制成的衍生物素-羟基琥珀酰亚胺酯可与蛋白质和糖等多种类型的大小分
  子形成生物素标记产物，标记方法颇为简便。生物素与亲和素的结合具有很强的特异性，
  其亲和力较抗原抗体反应大得多，两者一经结合就极为稳定。由于一个亲和素可与4个生
  物素分子结合，因此如把ABS与ELISA法可分为酶标记亲和素-生物素（LAB）法和桥联亲
  和素-生物素（ABC）法两种类型。两者均以生物素标记的抗体（或抗原）代替原ELISA系
  统中的酶标抗体（抗原）。在LAB中，固相生物素先与不标记的亲和素反应，然后再加酶
  标记的生物素以进一步提高敏感度。在早期，亲和素从蛋清中提取，这种卵亲和素为碱性
  糖蛋白，与聚苯乙烯载体的吸附性很强，用于ELISA中可使本底增高。从链霉菌中提取的
  链霉亲和素则无此缺点，在ELISA应用中有替代前者的趋势。由于ABS-ELISA较普通
  ELISA多用了两种试剂，增加了操作步骤，在临床检验中ABS-ELISA应用不多。

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