A. 为什么加入盐能使蛋白质、胶体析出，出现盐析现象
这有点类似胶体的聚沉原理：中性盐对水分子的亲和力更强，蛋白质分子周围的水化膜层减弱、消失。同时，蛋白质因离子强度的改变而使表面电荷大量被中和，导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子发生聚沉，即出现盐析现象。
蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度和蛋白质分子带有电荷的情况决定的。而在盐溶液中大部分蛋白聚沉了，在盐溶液中的溶解度就小了。
B. 简要说明蛋白质电泳法·透析法·超速离心法和盐析法的基本原理
电泳：蛋白质在高于或低于其等电点的溶液中是带电的，在电场中能向电场的正极或负极移动。根据支撑物不同，有薄膜电泳、凝胶电泳等。
透析：利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。
超速离心：既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。不同蛋白质其密度与形态各不相同而分开。
盐析法就是通过控制盐的浓度，使蛋白质混合溶液中的各个成分分步“盐析”出来，达到分离目的蛋白质。
C. 常用的蛋白质分离纯化方法有哪几种各自的作用原理是什么
分离蛋白质混合物的各种方法主要是根据蛋白质在溶液中的以下性质：1）分子大小；2）溶解度；3）电荷；4）吸附性质；5）对其它分子的生物学亲和力等进行分离。
常见的分离提纯蛋白质的方法有： 1、盐析与有机溶剂沉淀：在蛋白质溶液中加入大量中性盐，以破坏蛋白质的胶体性质，使蛋白质从溶液中沉淀析出，称为盐析。常用的中性盐有：硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等。盐析时，溶液的pH在蛋白质的等电点处效果最好。凡能与水以任意比例混合的有机溶剂，如乙醇、甲醇、丙酮等，均可引起蛋白质沉淀。2、电泳法：蛋白质分子在高于或低于其pI的溶液中带净的负或正电荷，因此在电场中可以移动。电泳迁移率的大小主要取决于蛋白质分子所带电荷量以及分子大小。3、透析法：利用透析袋膜的超滤性质，可将大分子物质与小分子物质分离开。4、层析法：利用混合物中各组分理化性质的差异，在相互接触的两相（固定相与流动相）之间的分布不同而进行分离。主要有离子交换层析，凝胶层析，吸附层析及亲和层析等，其中凝胶层析可用于测定蛋白质的分子量。5、分子筛：又称凝胶过滤法，蛋白质溶液加于柱之顶部，任其往下渗漏，小分子蛋白质进入孔内，因而在柱中滞留时间较长，大分子蛋白质不能进入孔内而径直流出，因此不同大小的蛋白质得以分离。6、超速离心：利用物质密度的不同，经超速离心后，分布于不同的液层而分离。超速离心也可用来测定蛋白质的分子量，蛋白质的分子量与其沉降系数S成正比。
D. 蛋白质除盐的方法有哪几种简述其原理
蛋白质在用盐析沉淀分离后 需要将蛋白质中的盐除去 常用的办法是透析 即把蛋白质溶液装入秀析袋内（常用的是玻璃纸）用缓冲液进行透析 并不断的更换缓冲液 因透析所需时间较长 所以最好在低温中进行 此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐 所用的时间就比较短
2、等电点沉淀法
蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小 因而溶解度也最小 各种蛋白质的等电点有差别 可利用调节溶液的PH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀 但此法很少单独使用 可与盐析法结合用
3、用与水可混溶的有机溶剂 甲醇 乙醇或丙酮 可使多数蛋白质溶解度降低并析出 此法分辨力比盐析高 但蛋白质较易变性 应在低温下进行
E. 使用超滤管浓缩蛋白需要再脱盐吗
是否脱盐，是根据您要达到的最终效果！
F. 盐析法沉淀蛋白质的原理
1 中性盐沉淀（盐析法）
在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析”。除了蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离。
盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，已有八十多年的历史，其突出的优点是：
①成本低，不需要特别昂贵的设备。
②操作简单、安全。
③对许多生物活性物质具有稳定作用。
⑴ 中性盐沉淀蛋白质的基本原理
蛋白质和酶均易溶于水，因为该分子的－COOH、－NH2和－OH都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成1nm～100nm颗粒的亲水胶体，削弱了蛋白质分子之间的作用力，蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也越大。亲水胶体在水中的稳定因素有两个：即电荷和水膜。因为中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所以加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。盐析示意图如下页“图 4”所示。
⑵ 中性盐的选择
常用的中性盐中最重要的是（NH4）2SO4，因为它与其他常用盐类相比有十分突出的优点：
1) 溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这是其他盐类所不具备的。由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析操作也要求在低温下（0～4℃）进行。由下表可以看到， 硫铵在0℃时的溶解度，远远高于其它盐类：
表2-1 几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水）
0℃ 20℃ 80℃ 100 ℃
（NH4)2SO4 70.6 75.4 95.3 103
Na2SO4 4.9 18.9 43.3 42.2
NaH2PO4 1.6 7.8 93.8 101
2) 分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵
盐析，一步就可以除去75％的杂蛋白，纯
度提高了四倍。
3) 不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的
作用。有的酶或蛋白质用2～3mol/L浓度的
（NH4）2SO4保存可达数年之久。
4) 价格便宜，废液不污染环境。
⑶ 盐析的操作方法
最常用的是固体硫酸铵加入法。将其研成细粉，在搅拌下缓慢均匀少量多次地加入，接近计划饱和度时，加盐的速度更要慢一些，尽量避免局部硫酸铵浓度过大而造成不应有的蛋白质沉淀。盐析后要在冰浴中放置一段时间，待沉淀完全后再离心与过滤。
在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离，高浓度硫酸铵常用过滤方法。
各种饱和度下需加固体硫酸铵的量可由附录中查出。
⑷ 盐析曲线的制作
如果要分离一种新的蛋白质和酶，没有文献数据可以借鉴，则应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度。具体操作方法如下(讲义p39)：
蛋白质量(mg)或酶活力
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 硫铵饱
和度％
⑸盐析的影响因素
1) 蛋白质的浓度：高浓度的蛋白质用稍低的硫酸铵饱和度沉淀，若蛋白质浓度过高，易产生各种蛋白质的共沉淀作用。低浓度的蛋白质，共沉淀作用小，但回收率降低。较适中的蛋白质浓度是2.5％～3.0％，相当于25 mg/mL～30mg/mL。
2) pH值对盐析的影响：在等电点处溶解度小，pH值常选在该蛋白质的等电点附近。
3) 温度的影响：对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子，在高离子强度溶液中，温度升高，它们的溶解度反而减小。在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解度大多数还是随浓度升高而增加的。一般情况下，可在室温下进行。但对于某些对温度敏感的酶，要求在0℃～4℃下操作，以避免活力丧失
G. 蛋白质为什么加盐会盐析
蛋白质盐析是指加入轻金属盐溶液使其在水中的溶解度降低，从而达到变性的目的。不过，该变性是可逆的，只要向其中加入大量水，蛋白质还会溶解。
H. 超滤离心管怎么使用
蛋白浓缩和换Buffer通常使用的超滤管，常用Millipore的Amicon-Ultra-15超滤管（MWCO10kD）。也有其它型号的、不同体积大小和MWCO超滤管可选，视目的蛋白的分子量与浓缩前体积、浓缩目标体积而定。可重复使用。
1、选择合适的超滤管，主要考虑MWCO和浓缩体积，通常应截留分子量不应大于目的蛋白分子量的1/3，比如目的蛋白分子量为35kDa，就可以选择10kDa截留分子量的超滤管。若目的蛋白分子量为10kD左右，则可以用截留分子量3kD的超滤管。
2、新买来的超滤是干燥的，使用前加入MilliQ水，水量完全过膜，冰浴或冰箱里预冷几分钟。然后将水倒出，即可加入蛋白液，加入的多少，以不超过管顶的白线为准。操作要轻，加入蛋白液前，超滤管需要插在冰上预冷。
3、平衡。质量和重心二者都要达到平衡。注意转速和加速度不可太快，否则直接损坏超滤膜。开始离心超滤（离心机预冷至4度）。膜与转轴的方向根据说明书调整（角转离心机的情况是膜与轴垂直）。在实际使用中，一般转速开的比说明书里的要低，这样可以延长离心管的使用寿命。
4、当浓缩到剩下1ml时，【取50ul国产Bradford溶液，加入10ul流穿，看有没变蓝色，以此判断超滤管是否漏掉蛋白。如果管漏了，将上层和流穿重新倒入新管中开始超滤。要精确判断是否漏管，用5mg/ml的BSA离心10min，再取流穿，跑蛋白胶或Bradford粗测】，继续加入剩下的蛋白液浓缩（在冰上操作，防止蛋白受热），直到所有浓缩液都加完为止。离心过程中注意是否发生蛋白沉淀，导致堵管。若发生沉淀，要确定沉淀的具体原因，是蛋白浓度过高还是Buffer不合适；前者可用多根超滤管同时超滤，降低浓度的办法解决，后者的方法是换不同的Buffer，直到蛋白不发生沉淀为止。
5、前面几步用以浓缩蛋白，如果要换Buffer，在总蛋白液浓缩至1ml左右的时候，轻轻加入新的Buffer（经0.22um超滤膜超滤），再浓缩至1ml左右，连续三次，最后一次的浓缩终体积根据需要的蛋白浓度而定，一般不多于500ul，也有浓缩至200ul以内的情况。按照每次至少10倍左右的体积浓缩算，三次达到1000倍以上，基本上可以达到换buffer的目的。
6、取出最终蛋白浓缩液的操作在冰上操作，用黄枪头（200ul）取，轻轻顺着边缘插入枪头，轻轻吹打、混匀蛋白液，注意不要碰到超滤膜，然后吸取浓缩液，每次吸接近200ul，直到吸完。管底剩下的最后一点浓缩液不必吸取，否则难度太大，有可能损坏超滤膜。最后加入MilliQ水到超滤管中，没过超滤膜，防止膜失水变干。
7、以下是处理超滤管，重复利用超滤管的步骤。
8、倒出超滤管里的水，用milliQ水轻轻润洗几次，【若管底有可见的蛋白沉淀，可以先加入水，然后用枪头吹打，注意不要碰到膜，吹打至沉淀悬起，然后倒掉，不可用自来水猛冲】然后加入0.2M的NaOH溶液，室温放置20min，期间平衡超滤管。再离心10min。倒出残留的NaOH溶液，将管芯浸入MilliQ水的烧杯(1或2L)中,放置几个小时,再换新的水,放置几个小时，不断稀释NaOH浓度。50ml管和盖子用自来水洗，内壁再用MilliQ水洗干净。
9、取出浸没的管芯，加至接近满的MilliQ水，50ml管也加满MilliQ水，将管芯慢慢放入50ml
离心管，排出部分水，然后盖上盖子，放4度保存，直到下次使用。一般来说，按照上述步骤和注意事项，每根管用三四年不会坏。