A. 蛋白过镍柱纯化的原理和步骤是什么
Ni柱中的氯化镍可以与有HIs（组蛋白）标签的蛋白结合，也可以与咪唑结合。
步骤是：过柱子前可以选择Ni柱重生，也就是往柱子里倒氯化镍，一个柱长体积就行了，然后平衡柱子，拿你自己的buffer，给蛋白提供最适的环境，我一般平衡4个柱长，然后蛋白上样，你可以让他自己挂，这样挂柱子的效果好一些，如果流速太慢，可以加个恒流泵，但是一定不能太快，太快挂柱效果差，当然你也可以选择循环挂柱，就是恒流泵的一头接你装蛋白的烧杯，从柱子中留下来的液体还用同一个烧杯接回去。挂完之后，按理想来讲，你的蛋白在Ni柱中与Ni就结合了，杂蛋白多数在烧杯里，留下来了，当然肯定有少量杂蛋白也挂上了，这时候你要梯度洗脱，拿咪唑和你的buffer配，一般从0 20mM 40mM。。。。100mM这样洗脱（当你不知道你的蛋白大概在什么时候出来的时候）我指的是咪唑的终浓度。咪唑加入之后，会和蛋白争夺与Ni的结合位点，杂蛋白、你的目的蛋白，会在不同的浓度被洗脱下来，洗完之后，你可以用200mM咪唑洗柱子，清理一切蛋白，然后平衡几次，是否选择重生你自己定咯~然后放上20%乙醇保存柱子就可以咯~
过的蛋白用不同的管子收下，然后SDS-page检测在哪个管子里。
这是我的经验，楼主可以多方面参考下别人的。喜欢推荐我的答案哦，~\(≧▽≦)/~
B. 镍柱纯化时，镍离子被洗脱下来掉到蛋白溶液里对蛋白有影响吗透析时只有透析掉咪唑为什么不说把镍离子透析
Ni离子是重金属，进入蛋白中肯定是有影响的，如果这个蛋白是用于人体或者动植物的肯定是不行的。Ni柱重新挂Ni确实是必须要脱Ni的，但一般是先用咪唑把蛋白全部洗下来后才脱Ni的，所以一般不太可能进入蛋白溶液中，如果进入了你可以重新用另一根柱子（这个柱子得保证结合你的蛋白），将蛋白溶液穿过这个柱子，让蛋白结合至柱子上，而Ni则和流穿液一起流穿，在把蛋白洗脱下来即可；至于透析，没试过，不好说，但Ni毕竟是离子，小分子，应该能透析掉的啊。希望我的回答对你有帮助。
C. 为什么镍柱纯化洗脱下来的酶透析后就没有活性了
向透析后的酶加入辅助因子，观察酶活是否可以恢复。用以EDTA螯合金属离子的酶做为对照。第二可以加入非辅助因子的离子来增加离子强度，观察酶活是否恢复。
辅助因子是金属离子的情况。用EDTA做对照就是人工降低离子浓度。然后向实验组和对照组都加入金属离子，看功能是否可以恢复。如果两组都能恢复，说明的确是由于缺少金属离子造成酶活的丧失。
酶活力的度量单位。1961年国际酶学会议规定：1个酶活力单位是指在特定条件（25℃，其它为最适条件）下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量。
定义
指酶催化一定化学反应的能力。
单位
在特定条件下，1分钟内转化1微摩尔底物所需的酶量为一个活力单位(U)。温度规定为25度，其他条件取反应的最适条件。
比活力
每毫克酶蛋白所具有的酶活力。单位是u/mg。比活力越高则酶越纯。
转化数
每分子酶或每个酶活性中心在单位时间内能催化的底物分子数(TN)。相当于酶反应的速度常数kp。也称为催化常数（Kcat）。1/kp称为催化周期。碳酸酐酶是已知转换数最高的酶之一，高达36×106每分，催化周期为1.7微秒。
D. 镍柱纯化蛋白后，镍柱结块了，怎么办
柱子的填料已经变形，要超声处理，复性，加氯化镍再生。
E. ni柱纯化蛋白的原理，镍柱纯化总有一条杂蛋白怎么办
his标签与镍金属离子的结合作用是ni柱纯化蛋白的原理。
总有一条杂蛋白，有可能是非特异性结合。你可以尝试优化蛋白洗脱方法，将你的目的蛋白与杂蛋白进行分离。
F. 蛋白纯化过镍柱以后为什么会沉淀啊
蛋白浓度过高的时候，会发生聚集而沉淀。有些不易溶蛋白随着镍柱的专富集作用就会沉淀属。
由于不知道你实验目的，简单认为你要纯化表达的蛋白，解决方法：
1. 换更强亲水肽段载体pet50（从酶切链接开始做），但是这样会在表达出来蛋白中增加非目的蛋白成分
2. 不要用最佳浓度咪唑洗脱，用稍差一些的，这样洗脱出来蛋白速度慢，浓度低，但是看你是否对浓度要求了。
3. 重新设计引物把输水片段删掉，这样增加可溶性再表达纯化
4. 考虑在沉淀里加入稀盐，促溶。但不知对你实验是否有影响
G. 纯化蛋白得镍柱使用后怎么处理
你好，蛋白保存是个比较棘手的问题，就我的理解来讲：蛋白的保存很大程度上依赖于蛋白本身的结构稳定性，其次和保存条件优化有关；尽量避免蛋白的反复冻融，这会对蛋白的结构和活性造成破坏；像你说到的第二天就要用，根本没必要放在-70℃低温，一般来讲，尽量安排好实验周期，在3天内用完蛋白（4℃保存）是理想条件；如果不得不保存，要分装，留下马上就用的放在4℃，其他放低温，每次取1只；如果有冻干机，冻成干粉再放到-70比液态低温更好，再溶解也会好很多（但很多蛋白还是会有失活问题）；关于保护剂，如果蛋白稳定性不强，一般会加甘油（5%-50%浓度）和叠氮钠（抑菌），这样一来，取出时，不得不做透析或脱盐，以去除甘油和叠氮钠，会带来损失，相比而言，冻干粉就好很多；关于咪唑的去除问题，如果确信咪唑的存在对你后续的实验没影响，可以不去；但实际上，很多实验都会受到咪唑的影响，或者说一旦实验有疑问，你就无法判定是否是因为咪唑，所以建议你去咪唑，去咪唑的方式包括：透析、浓缩管离心、脱盐柱。个人认为，去除效率、最省时、蛋白回收率最高的法是脱盐柱。我目前想到的就这么多，欢迎继续讨论，祝实验顺利！
H. 镍柱纯化后为什么用平衡缓冲液平衡后即可再次使用
PMSF为蛋白酶抑制剂，在纯化过程中，为了防止细菌本身的蛋白酶降解待纯化的目的蛋白，通常在破碎菌体，上柱的过程中会加PMSF。使用时请注意防护，有毒。
I. 纯化后的蛋白在含有高浓度nacl的情况下浓缩容易沉淀吗
理由相信，浓度越高，对保存蛋白质越有利。加入 PEG 和更换 缓冲液种类是一种值得试验的方法，但结果如何还在两可之间，没试过就不会知道。
镍柱下来以后，溶液中混有相当多咪唑和议定含量的Ni，都有可能引起蛋白质不稳定变性沉淀。
我在纯化一种蛋白质时，也遇到过相同的情况，虽然蛋白质不同，但是也许能有帮助。
镍柱后，用含 EDTA 的缓冲液透析，除去 Ni ，再过 DEAE 离子交换柱，之后透析再浓缩，分装小管，-80度保存。一次使用一支。
理论上说蛋白质应在高浓度情况下保存，但当缓冲溶液中含有大量盐而且目的蛋白中含有大量输水氨基酸的情况下，高浓度就不利于保存。
在这种情况下，如果你不想太多的稀释蛋白，可以选择适当脱盐，如透析、凝胶过滤、超滤等，但应保持缓冲液具有一定的离子强度（500mM NaCl这个浓度太高，可以降到100），如果还不行的话，可以添加甘油至终浓度5%左右。
Ni纯化最好不要用Tris，可能会影响Ni的结合。