㈠ 模版DNA怎麼保存
看需要保存多少時間，
短期【1-6個月】
-20/-80℃ 冷凍保存
更長時間【1年-幾十年】
就需要專門的模板DNA室溫保存系統對DNA進行保護，處理後可以直接放在室溫情況下，直接使用。
低溫保存無法對DNA樣本提供絕對安全的長久保存，其實只是延緩DNA氧化和水解的過程。
至於長時間的樣本保存為什麼不能用低溫冷凍的方法，是因為在樣品的凍結過程中，會產生一個波陣面，這種界面會引起樣本濃度的局部變化，並產生機械應力；這種波陣面的產生跟凍結的速度有關，緩慢的凍結會產生很大的波陣面，機械應力也會很大，而快速冷凍相對波陣面會減小，但是會產生很多小晶體，產生這些波陣面和晶體帶機械應力都會造成DNA鏈的斷裂
㈡ 急求！！DNA測序的問題
DNA測序技術
DNA sequencing technology
在分子生物學研究中，DNA的序列分析是進一步研究和改造目的基因的基礎。目前用於測序的技術主要有Sanger等（1977）發明的雙脫氧鏈末端終止法和Maxam和 Gilbert（1977）發明的化學降解法。這二種方法在原理上差異很大，但都是根據核苷酸在某一固定的點開始，隨機在某一個特定的鹼基處終止，產生 A，T，C，G四組不同長度的一系列核苷酸，然後在尿素變性的PAGE膠上電泳進行檢測，從而獲得DNA序列。目前Sanger測序法得到了廣泛的應用。
Sanger 法測序的原理就是利用一種DNA聚合酶來延伸結合在待定序列模板上的引物。直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測定由一套四個單獨的反應構成，每個反應含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸 (dNTP)，並混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。由於ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、 A、T或C處終止。終止點由反應中相應的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對濃度可以調整，使反應得到一組長幾百至幾千鹼基的鏈終止產物。它們具有共同的起始點，但終止在不同的的核苷酸上，可通過高解析度變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理後可用X- 光膠片放射自顯影或非同位素標記進行檢測。
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一、概述：
Promega公司的SILVER SEQUENCETM DNA測序系統是一種無放射性的序列分析系統，它通過靈敏的銀染方法檢測凝膠中的條帶。銀染提供了一種對於放射性或熒光法來說更加快速，廉價的替代方法。測序結果可以在同一天內得到；電泳完成後經90分鍾就可讀序，這是常規的放射性測序法做不到的。 此外, SILVER SEQUENCETM系統用未修飾的5'OH寡聚核苷酸作為引物，減少了特殊修飾寡聚核苷酸的花費。該系統不需要放射性方法中對同位素的謹慎操作，也不需要熒光法或化學發光技術的昂貴試劑。另外，也不需要象大多數熒光法那樣用儀器來檢測序列條帶。
Taq DNA聚合酶在95℃時極強的熱穩定性。本系統利用的測序級Taq DNA聚合酶是一種Taq DNA聚合酶的修飾產品，對於雙鏈DNA模板有非常好的效果，具有高度的准確性，能產生均一的條帶，且背景低。
SILVER SEQUENCETM系統包含被修飾的核苷酸混合物，如7-去氮dGTP(7-deaza dGTP，或dITP)替代dGTP可清除由GC豐富區域所引起的條帶壓縮現象。
退火溫度是熱循環測序中最重要的因素。高退火溫度可減少模板二級結構。提高引物結合模板配對的嚴謹性。鏈重退火和模板二級結構則限制了小片斷PCR產物(<500bp)得到清楚的序列數據的能力。引物延伸起始於每個循環的退火階段。在較低溫度時，聚合酶可能會遇到堅固的二級結構區域，它可導致聚合酶解離。則在四個電泳道中均有同一相對位置的條帶。因為這些原因，應該使用盡可能高的退火溫度。對於有牢固二級結構的模板建議使用95℃變性、70℃退火/延伸的循環模式。一般來說，較長的引物及GC含量高的引物能得到較強的信號。實驗結果表明，>24mer的GC含量約為50%的引物可得到最佳結果。
由於本系統採用熱循環裝置, 與常規的測序方法相比具有如下幾點好處：(1).本方法線性擴增模板DNA產生足夠的產物使銀染技術能夠檢測序列條帶，測序反應需要0.03-- 2pmol模板DNA, 隨模板種類而定。(2). 在每一個變性循環中的高溫可以取代對雙鏈DNA(dsDNA)模板的鹼變性及乙醇沉澱過程，變性循環也有助於消除由於線性dsDNA模板(如PCR反應產物)快速重退火所引起的問題。(3). 高溫聚合酶反應減弱了DNA模板的二級結構，允許聚合酶穿過高度二級結構化的區域。
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二、材料
待測已提純的DNA，可為單鏈，也可為雙鏈。
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三、設備
高壓電泳儀，測序用電泳槽，制膠設備，PCR儀。
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四、試劑
（1）SILVER SEQUENCETM DNA測序試劑盒。
（2）丙烯醯胺和甲叉雙丙烯醯胺儲備液（38%丙烯醯胺 W/V，2%甲叉雙丙烯醯胺 W/V)：95g丙烯醯胺，5g甲叉雙丙烯醯胺溶於140ml 雙蒸水中，定容至250ml，0.45mm過濾器過濾後，貯於棕色瓶中，置於4℃冰箱可保存2周。
（3）10%過硫酸銨，0.5g過硫酸銨溶於4ml水中，定容至5ml，應新配新用。
（4）10×TBE緩沖液（1 mol/L Tris, 0.83mol/L 硼酸，10mmol/L EDTA)： 121.1g Tris，51.35g硼酸，3.72g Na2 EDTA ·2H2O，溶於雙蒸水中定容至1升，置於4℃下可貯存2周，其pH約為8.3。
（5）TBE電極緩沖液：10×TBE 緩沖液稀釋至1×TBE備用。
（6）TEMED
（7）固定/停止溶液：10%冰醋酸（V/V）配製2升備用。
（8）染色溶液：硝酸銀2克，甲醛3ml，溶於2升超純水中備用。
（9）顯影溶液：60克碳酸鈉（Na2CO3)溶於2升超純水中，使用前加3ml 37% 甲醛和 40ml硫代硫酸鈉溶液（10mg/ml)。
（10）95%乙醇。
（11）0.5%冰乙酸。
（12）Sigmacote (Sigma CAT. #SL-2)。
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五、操作步驟
：
成功地使用銀染測序系統需要對提供的操作方法進行仔細考慮。銀染不如放射性檢測法靈敏，而需要更多的模板量，此外，也不可能通過延長X-光膠片曝光時間的方法增加信號強度。因此，請使用推薦的DNA模板量, 每次均使用所提供的對照檢查系統的可靠性，並且注意如下幾點：
（1） DNA的濃度和純度必須經過瓊脂糖凝膠電泳或熒光法測定, 樣品應與已知量DNA一起電泳。
（2） 分光光度法對於很多DNA提取物包括質粒小量制備來說，並不能給出一個可信的DNA濃度估計，混雜的染色體DNA、蛋白、RNA、有機物及無機化合物均可能有260 nm光吸收。因此，分光光度法常常錯誤地高估DNA濃度。
（3） DNA制備過程中用核糖核酸酶處理所產生核糖核苷酸，雖然它們在電泳後DNA樣品的前面，並不能觀察到，但它們仍會有260nm光吸收。
（一）測序反應：
1. 對於每組測序反應，標記四個0.5ml eppendorf管(G、A、T、C)。每管加入2ml適當的d/ddNTP混合物(d/ddNTP Mix)。各加入1滴(約20ml)礦物油，蓋上蓋子保存於冰上或4℃備用。
2. 對於每組四個測序反應,在一個eppendorf管中混合以下試劑：
（1） 樣品反應：
質粒模板DNA 2.1pmol
5×測序緩沖液 5ml
引物 4.5pmol
無菌ddH2O 至終體積16ml
（2）對照反應
pGEM-3Zf(+)對照DNA(4mg) 4.0ml
5×測序緩沖液 5ml
pUC/M13正向引物(4.5pmol) 3.6ml
無菌ddH2 O 至終體積 16 ml
3. 在引物/模板混合物(以上第2步)中加入1.0ml測序級Taq DNA聚合酶(5u/ml)。用吸液器吸動幾次混勻。
4. 從第3步的酶/引物/模板混合物中吸取4ml加入每一個d/ddNTP混合物的管內。
5. 在微量離心機中離心一下，使所有的溶液位於eppendorf管底部。
6. 把反應管放入預熱至95℃的熱循環儀，以[注意]中循環模式為基準，開始循環程序。對於每個引物/模板組合都必須選擇最佳退火溫度。下列程序一般能讀出從引物開始350鹼基的長度。
7. 熱循環程序完成後，在每個小管內加入3μl DNA測序終止溶液，在微量離心機中略一旋轉，終止反應。
[注意] 1、測序所用模板DNA的量一般按下面要求加入：
模板種類/長度 模板量
200bp (PCR產物) 16ng(120fmol)
3000-5000bp（超螺旋質粒DNA) 4mg (2pmol)
48000bp(λ,粘粒DNA) 1mg(31fmol)
由於超螺旋質粒產生的信號比鬆弛的線性雙鏈DNA弱，因此使用超螺旋質粒作為模板時其用量要比其它模板大一些。
2、計算與4.5pmol相當的引物納克數可用以下一般公式：
4.5pmol=1.5ng×n,其中n為引物鹼基數
計算與1pmol相當的引物微克數可用以下一般公式：
dsDNA:1pmol=(6.6×10-4 mg)×n,其中n為模板鹼基對數
ssDNA:1pmol=(3.3×10-4 mg)×n,其中n為模板鹼基數
3、為阻止Taq DNA聚合酶延伸非特異性退火引物， 熱循環儀必須預熱至95℃。溫度變換應越快越好。下面的循環時間不包括變溫時間。如果你無法確定使用何種模式，建議從模式1開始。
模式1：適用於引物<24鹼基或GC含量<50%
95℃ 2分鍾。然後： 95℃ 30秒(變性), 42℃ 30秒(退火), 70℃ 1分鍾(延伸)。
模式2:適用於≥24鹼基或略短的GC含量≥50%的引物。
95℃ 2分鍾, 然後: 95℃ 30秒(變性), 70℃ 30秒(退火/延伸)。 4. 在加入終止溶液之後樣品可在4℃保存過夜。
（二）、 測序凝膠板的制備
1、玻璃板的處理：
銀染測序的玻璃板一定要非常清潔，一般先用溫水和去污劑洗滌，再用去離子水沖洗玻璃板，除去殘留的去污劑，最後用乙醇清洗玻璃板。玻璃板上遺留的去污劑微膜可能導致凝膠染色時背景偏高(棕色)。短玻璃板經粘合溶液處理可將凝膠化學交聯於玻璃板上。這一步對於在銀染操作過程中防止凝膠撕裂至關重要。
（1）短玻璃板的處理
A. 在1ml 95%乙醇, 0.5%冰乙酸中加入5ml粘合硅烷(Bind Silane), 配成新鮮的粘合溶液。
B. 用經浸透新配的粘合溶液浸透的吸水棉紙擦拭仔細清洗過並已經自然乾燥的玻璃板, 整個板面都必須擦拭。
C. 4-5分鍾後, 用95%乙醇單向擦玻璃板, 然後略用力沿垂直方向擦拭。重復三次這一清洗過程, 每次均須換用干凈的紙, 除去多餘的粘合溶液。
[注意] 1. 在95%乙醇單向擦玻璃板時過度用力會帶走過多的粘合硅烷, 使凝膠不能很好地粘附。
2. 准備長玻璃板之前要更換手套，防止粘染粘合硅烷。
3、防止粘合溶液沾染在長玻璃板上是很重要的, 否則將導致凝膠撕裂。
(2)、長玻璃板的處理
A. 用浸透Sigmacote溶液的棉紙擦拭清洗過的長玻璃板。
B. 5-10分鍾後用吸水棉紙擦拭玻璃板以除去多餘的Sigmacote溶液。
[注意] 1. 用過的凝膠可在水中浸泡後用剃須刀片或塑料刮刀颳去。玻璃板須用去污劑完全清洗。或者凝膠用10% NaOH浸泡後除去。為防止交叉污染, 用於清洗短玻璃板的工具必須與清洗長玻璃板的工具分開, 如果出現交叉污染, 以後制備的凝膠可能撕裂或變得鬆弛。
2、凝膠的制備：
（1）玻璃板經粘合硅膠和Sigmacote處理後，即可固定玻璃板。該方法是用0.2mm或0.4mm厚的邊條置於玻璃板左右兩側，將另一塊玻璃板壓於其上。在長玻璃板的一側插入鯊魚齒梳平的一面邊緣，用夾子固定住。
（2）根據所需要的凝膠濃度，按下表制備測序凝膠，一般6%-8%的膠濃度可獲得較好的結果。配製過程中，先用適量雙蒸水溶解尿素，再加入 Acr&Bis和10×TBE緩沖液，再用雙蒸水調終體積至99.2ml，並用0.45mm的濾膜過濾，然後加過硫酸銨和TEMED。溶解尿素時不必加熱。如果確需加熱則應等溶液完全冷卻後，方可加入TEMED和過硫酸銨。一般在膠灌制後4-6分鍾，即開始聚合，如果聚合不好，則應使用高濃度的 TEMED和過硫酸銨。
凝膠終濃度
3 4 5 6 8 12 16 18
尿素(g) 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0
Acr&Bis(ml) 7.5 10.0 12.0 14.5 20.0 30.0 40.0 50.0
10×TBE緩沖液(ml) 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0
雙蒸水(ml) 47.5 45.0 43.0 40.5 35.0 25.0 15.0 5.0
10%過硫酸銨(ml) 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.7 0.7
TEMED(ml) 87 80 80 80 80 70 47 40
(3)膠配製好後，即可灌制膠板。一般是將凝膠沿著壓條邊緣緩慢地倒入玻璃板的槽中，倒完後，靜止放置使之聚合完全。
[注意] 1、使用夾子固定玻璃板時，最好夾子的力量稍大一些，防止因力量不足使灌膠的過程中出現漏膠液現象。
2、灌制凝膠的過程中要嚴防產生氣泡，否則影響測序的結果。
（三）電泳：
1、預電泳
（1）當凝膠聚合完全後，撥出鯊魚齒梳，將該梳子反過來，把有齒的一頭插入凝膠中，形成加樣孔。
（2）立即將膠板固定在測序凝膠槽中，一般測序凝膠槽的上下槽是分開的，因而只有在固定好凝膠板後，方能加入TBE緩沖液。
（3）稀釋10×TBE緩沖液至1×TBE，將該緩沖液加入上下二個電泳槽中，去除產生的氣泡，接上電源准備預電泳。
（4）有些電泳槽，如LKB的Macrophor等是使用水浴加熱的，則應先將水浴加熱至55℃後進行預電泳。有的不使用水浴加熱，依靠電泳過程中自身產生的熱進行保溫，如上海求精有機玻璃儀器生產的測序電泳槽，這種槽需夾上二塊散熱鋁板，使整個凝膠板的溫度一致。
（5）按30V/cm的電壓預電泳20-30分鍾。預電泳的過程是去除凝膠的雜質離子，同時使凝膠板達到所需的溫度。高溫電泳可防止GC豐富區形成的發夾狀結構，影響測序的結果。
[注意]
（1）. 用鯊魚齒梳製作加樣孔時，應注意將齒尖插入膠中0.5mm左右，千萬注意不能使加樣孔滲漏，否則得不到正確的結果。
（2）. 應時刻注意上面電泳槽中的緩沖液是否滲漏，否則極易造成短路而損壞電泳儀。
2、樣品的制備：
當在預電泳時，即可進行樣品的制備，將反應完畢的樣品在沸水浴中加熱1-3分鍾，立即置於冰上即可。如果樣品長時間不用，則應重新處理。可使用4- 6%聚丙烯醯胺凝膠，膠厚0.4mm。厚度小於0.4mm的膠可能導致信號太弱。加樣時不必吸去上層覆蓋的礦物油，但要小心地吸取礦物油下的藍色樣品。
3、上樣及電泳
關閉電泳儀，用移液槍吸緩沖液清洗樣品孔，去除在預電泳時擴散出來的尿素，然後立即用毛細管進樣器吸取樣品，加入樣品孔中。上樣順序一般為G、A、 T、C。加樣完畢後，立即電泳。開始可用30V/cm進行電泳，5分鍾後可提高至40-60V/cm，並保持恆壓狀態。一般來說，一個55cm長， 0.2mm厚的凝膠板，在2500V恆壓狀態下電泳2小時即可走到底部，同時在電泳過程中，電流可穩定地從28mA降至25mA。為了能讀到更長的序列，可採用兩輪或多輪上樣。
[注意]
1、上樣電泳時，一定要注意凝膠板的溫度是否達到55℃左右，如果還沒有達到，則應等溫度達到後才能上樣電泳。
2、一般來說電泳時，不宜使用太高的電壓，因為太高的電壓會使凝膠的解析度降低，並且使帶擴散。電泳中可進行恆功率電泳。
（四）、 測序凝膠的銀染
染色過程要求凝膠浸在塑料盤中。因而至少使用兩個盤子，大小與玻璃板類似。在盤中加入新鮮溶液之前須用高質量的水洗滌盤子。
1. 電泳完畢後用一個塑料片子小心地分開兩板，凝膠應該牢固地附著在短玻璃板上。
2. 固定凝膠：將凝膠(連玻璃板)放入塑料盤，用固定/停止溶液浸沒,充分振盪20分鍾或直至樣品中染料完全消失，膠可在固定/停止溶液中保存過夜(不振盪)。保留固定/停止溶液，用於終止顯影反應。
3. 洗膠：用超純水振盪洗膠3次，每次2分鍾。從水中取出, 當轉移至下一溶液時拿著膠板邊沿靜止10-20秒，使水流盡。
4. 凝膠染色：把凝膠移至染色溶液充分搖動30分鍾。
5. 凝膠顯影：
(1). 在顯影溶液中加入甲醛(3ml)和硫代硫酸鈉溶液(400μl)以完成顯影液的配製。
(2). 從染色溶液中取出凝膠放入裝有超純水的盤中浸洗5-10秒。注意，把凝膠從超純水轉移到顯影溶液的總時間不能長於5-10秒。浸泡時間過長則導致信號微弱或喪失信號。若浸泡時間過長,可重復第五步用染色液浸泡。
(3). 立刻將凝膠轉移至1升(總量的一半)預冷的顯影液充分振盪直至模板帶開始顯現或開始出現第一批條帶,把凝膠移入剩下的1升顯影液中繼續顯影2--3分鍾,或直至所有條帶出現。
6. 固定凝膠：在顯影液中直接加入等體積的固定/停止溶液。停止顯影反應,固定凝膠。
7. 在超純水中浸洗凝膠兩次，每次2分鍾，注意在本操作中戴手套拿著膠板邊緣避免在膠上印上指紋。
8. 將凝膠置於室溫乾燥或用抽氣加熱法乾燥。在可見光燈箱或亮白，黃色背景(如紙)上觀察凝膠，若需永久保存的記錄, 則可用EDF膠片保留實驗結果。
[注意] 測序產物的銀染是顯現序列信息的一種新方法，本系統的成敗受幾個因素的影響。
1. 水的質量對於染色的成功極其重要。超純水(NANOpureR 或Milli-QR 的水)或雙蒸水可獲得較好的效果, 如果水中有雜質, 則低分子量條帶可能無法出現。
2. 碳酸鈉也非常重要。使用新鮮的，美國化學學會級碳酸鈉較好，如Fisher和Kodak ACS試劑級碳酸鈉(Fisher Cat #S263-500或S262-3，或Kodak Cat #109-1990)，一般可獲得較好的結果。
3. 染色後的洗滌步驟是非常關鍵的。如果凝膠洗滌時間太長，銀顆粒會脫離DNA, 產生很少或沒有序列信號。如果洗滌時間過長，染色步驟可以重新進行。
4. 如果凝膠厚度超過0.4mm或丙烯醯胺濃度高於4-6%，則有必要延長固定和染色的時間。如果凝膠比0.4mm薄，染色反應後的洗滌必須縮短至不超過5秒。
5. 在室溫下進行所有步驟，顯影反應除外。顯影溶液必須預冷至10-12℃以減小背景雜色。注意：臨用前在顯影溶液中加入甲醛和硫代硫酸鈉。用新配的染色及顯影溶液。不要重復使用任何溶液。
㈢ DNA測序的問題
1，PCR需要使用高保真聚合酶。
2，一般送2、3個樣去測序，保證正確。
㈣ DNA可不可以溶於水啊
DNA可溶於水。我們提取質粒很多時候是直接用純水溶解的。
樓上不要亂說。
㈤ DNA製品為什麼應保存在濃度較高的溶液或緩沖溶液中
為了
不使dna降解，溶液中必須含有edta螯合劑
以便螯合dna水解酶的輔酶，此外，dna在酸性條件下易降解，因此
需要給予鹼性環境。隨意buffer
都是含有edta的鹼性溶液。
至於為什麼用溶液而不用乾粉，是為了方便使用而已（免去了溶解過程，也避免了非專業溶解造成的dna水解）
㈥ 為什麼DNA製品應保存在較高濃度的緩沖液或溶液中
為了 不使DNA降解，溶液中必須含有EDTA螯合劑 以便螯合DNA水解酶的輔酶，此外，DNA在酸性條件下易降解，因此 需要給予鹼性環境。隨意buffer 都是含有EDTA的鹼性溶液。
至於為什麼用溶液而不用乾粉，是為了方便使用而已（免去了溶解過程，也避免了非專業溶解造成的DNA水解）
㈦ 基因測序，pcr對純水有什麼要求
PCR產物直接測序技術現已成為分子生物學和基因組學研究中的一個重要技術,廣泛用於基因突變檢測、遺傳性疾病診斷、單核苷酸多態性研究、基因組重疊序列群等.與傳統克隆測序技術相比較,直接對PCR擴增的DNA進行測序,省去了耗時的克隆步驟,避免了傳統的細菌培養,模板提取等重復性操作,可以從少量的原始樣品中得到正確的DNA序列信息.PCR產物直接測序技術具有快速、簡便、穩定經濟的優點. 試驗試劑 PCR擴增的雙鏈DNA模板長約20個核苷酸的DNA引物 DNA聚合酶測序膠 0.1mol/L DDT α-32P-dATP dNTP/ddNTP混合物(80μmol/L/8μmol/L) dNTP(dCTP、dGTP 、dTTP 各0.75μmol/L) 測序反應緩沖液：40mmol/L Tris-HCl(pH7.5),20mmol/L MgCl2,50mmol/L NaCl 終止緩沖液：95% 甲醯胺,20mmol/L EDTA,0.05% 溴酚藍,0.05% 二甲苯腈試驗步驟： 1、 4個微量離心管中各加入dNTP/ddNTP混合物2.5μl,混合物37OC溫浴5min,備用. 2、 在一個空的微量離心管中加入1pmol的PCR擴增雙鏈DNA,10pmol測序引物,2μl 5×測序緩沖液,加雙蒸水至總體積10μl,96OC加熱8min,冰浴泠卻1min,4OC 10000g離心10s. 3、 加入2μl預冷的標記混合物(dCTP、dGTP 、dTTP 各0.75μmol/L),α-32P-dATP 5μCi,1μl 0.1mol/L DDT,測序酶2U,加水至15μl,混勻後置冰上2min,標記新合成的DNA鏈. 4、 在第1步驟的4個管中各加入3.5μl標記反應混合物,37OC溫浴5min.每管各加入4μl終止液. 5、 樣品在80OC的水浴中熱變性5min,每一泳道加2μl 加到測序膠上,電泳分離這些片段. 注意事項： 1.?PCR產物要有一定的長度(>200bp),因為測序結果兩端20-30bp的電泳峰圖的准確性較低. 2.?純化PCR產物可通過離子交換層析使擴增的DNA段與反應剩餘的dNTP及引物分離；也可通過瓊脂糖凝膠電泳,將PCR產物與非特異性擴增產物和引物分離開來；如果擴增的特異性較高時,可直接通過酚：氯仿抽提,乙醇沉澱的方法來純化. 3.?測序引物設計原則類似於PCR引物設計,可在DNA合成儀上合成20個左右的核苷酸作為引物,經過高壓液相層析或聚丙烯醯胺凝膠電泳純化後,即可用作測序引物. PCR循環測序法 PCR循環測序法是將PCR擴增和核酸序列分析技術相結合,從而形成的一種測定核苷酸序列的研究方法,也稱作線性擴增測序.該方法採用PCR儀加熱使DNA模板變性,在TaqDNA聚合酶作用下,以溫度循環模式在模板上進行多輪的雙脫氧核苷酸測序反應,線性擴增標記的DNA分子. PCR循環測序法與以往的測序方法相比,其優點在於：大大減少所需的模板量；能提高測序反應產生的信號,降低了操作的復雜性,且聚合酶的用量減少；可在小量制備的模板上進行篩選反應；高溫下進行的測序反應使DNA聚合酶催化的聚合反應能夠通過模板二級結構的區域；雙鏈閉環DNA可以直接作為反應模板應用,不用作預先鹼變性處理.由於PCR循環測序法能夠簡單、快速地檢測特定序列,因此, PCR循環測序法在核酸序列分析研究中受到廣泛的重視. 試驗試劑： DNA測序試劑盒 dNTP ddNTP 丙烯醯胺雙丙烯醯胺尿素 TEMED(N,N,N『,N』-四甲基乙二胺) 過硫酸銨 6%測序膠：6%丙烯醯胺,7mmol/L 尿素,1×TBE. 10×測序緩沖液：100mmol/L Tris-HCl(pH8.8),500mmol/L KCl,40mmol/L MgCl2,0.01%明膠,20μmol/L dATP,50μmol/L dCTP,50μmol/L dGTP,50μmol/L dTTP 終止混合液：ddATP (600μmol/L),ddCTP (600μmol/L),ddGTP (100μmol/L),ddTTP(1000μmol/L) 終止緩沖液：95%甲醯胺,20mmol/L EDTA,0.05%溴酚藍,0.05%二甲苯腈試驗步驟 1、 4個小離心管,每個小管加入3μl的終止混合液,將管子放在冰上. 2、 在DNA模板中加入引物(4pmol), 4μl 10×測序緩沖液, 10μlα-32P-dATP, 2U TaqDNA聚合酶,加雙蒸水到30μl徹底混勻,每管7μl加入上面4個小管中. 3、 反應液上加30μl的石蠟油. 4、 95OC 30S,50OC 30S,72OC 60S共30個循環,可根據具體的情況進行適當的調整循環條件及循環次數. 5、 反應結束後在油層下加入5μl的終止緩沖液並用加樣槍混勻. 6、 上樣前將樣品在大於80OC的水浴中熱變性5min,每一道加2μl加到測序膠上,電泳分離這些片段. 注意事項： 1、 制備測序模板：PCR 擴增的產物可以經過低熔點的瓊脂糖凝膠電泳純化回收後,用於序列分析；可經過柱層析純化,去除PCR 反應後剩餘的dNTP和引物後,用於序列分析.PCR 產物也可不經純化直接用於測序,但是這種測序產生的結果較差,建議測序之前應進行PCR產物的純化.各種標準的質粒制備方法所純化出的質粒均可作為測序模板使用.用標准方法制備的M13噬菌體、粘粒、λDNA都適合用作測序模板用.但要注意的是反應體系中不應有與引物互補的非目的基因序列,否則將會導致測序實驗的失敗. 2、 測序引物：測序引物是指合成的與測序模板鏈特異性互補的寡核苷酸序列.可用α-32P-dATP和T4多聚核苷酸激酶對引物的5『端進行標記,反應體系中引物、激酶和α-32P-dATP要保持在最佳的比例,以得到高比活性的標記引物；也可用α-32P-dATP標記新合成的DNA鏈.引物的濃度不宜高,否則容易形成引物二聚體,或產生非特異性的擴增引物. 3、 酶：各種缺乏3『—5『端外切活性的耐熱DNA聚合酶都可以用於循環測序,其中TaqDNA聚合酶在DNA測序中最為常用.雖然應用PCR循環測序法能夠簡單、快速的進行基因序列的測定,但仍未能適應大規模DNA序列測定的需要,而PCR循環測序法、熒游標記和自動測序儀的聯合使用成為大規模基因組測序的主要技術.該技術是採用熒游標記引物或雙脫氧核苷三磷酸,反應產物經聚丙烯醯胺凝膠電泳後,經特定的DNA序列分析儀和分析系統處理待測的DNA序列.它的應用減輕了DNA序列測定的工作量,提高了測序的效率.
㈧ 單鏈DNA應該怎麼保存
乾粉保存就行 -20度。如果保存幾年，要在-80度。可以分幾管訂購，用的時候溶解一管，短期內用完。一般滅菌超純水或者滅菌的蒸餾水即可。Tris不必要，0.1mMEDTA保存時候可以，但是做實驗的時候因為EDTA會影響很多酶活性，必須先去除干凈。這個過程很繁瑣，還會損失你的單鏈DNA，所以不建議加那個東西。
㈨ DNA測序樣品准備問題
如果公司來取樣的人當天或第二天能把樣品寄出去，200ul-500ul的菌液就夠了