純化水細菌內毒素檢測凝膠法

B. 細菌內毒素國家葯典是怎麼檢測的

10版國家葯典
檢測內毒素可以用凝膠法
凝膠法是通過鱟試劑與內毒素產生凝集反應的原理來檢測或半定量內毒素的方法。
鱟試劑靈敏度復核試驗

在本檢查法規定的條件下，使鱟試劑產生凝集的內毒素的最低濃度即為鱟試劑的標示靈敏度，用EU/ml表示。當使用新批號的鱟試劑或試驗條件發生了任何可能影響檢驗結果的改變時，應進行鱟試劑靈敏度復核試驗。

以上摘自2010版中國葯典《細菌內毒素檢查法》

C. 中國葯典和美國葯典中的細菌內毒素檢測法的不同點是什麼

1、細菌內毒素工作標准品（CSE）

CP： 對CSE的用途及效價進行定義「細菌內毒素工作標准品中每1ng細菌內毒素的效價應不小於2EU，不大於50EU」
USP：未提到CSE

2、細菌內毒素檢查用水

CP ： 與靈敏度為0.03EU/ml或更高靈敏度的鱟試劑在37±1℃條件下24小時不產生凝集反應的滅菌注射用水；
USP：與鱟試劑在限定的靈敏度下不發生反應的滅菌注射用水或其它水。

3、實驗用具的准備

CP：實驗所用器皿需經處理，除去可能存在的外源性內毒素，常用的方法是250℃下干烤至少1小時，也可用其它確證不幹擾細菌內毒素檢查的適宜方法。

USP：使用經驗證的除熱原程序對所有玻璃器皿和遇熱穩定的材料在熱空氣烘箱中進行除熱原，常用的最低溫度和最少的時間是250℃下30分鍾。

4、內毒素標准品貯備液和標准品溶液的制備

CP： 未提到

USP：RSE的效價定為10,000USP EU/支，用5ml鱟試劑檢查用水復溶1支RSE的全部內容物，用漩渦混合器間歇混合30分鍾，並用此原液作系列稀釋，將原液置於冰櫃中保存不超過14天，作以後的稀釋之用，在使用前用漩渦混合器強力混合不少於3分鍾，在作下一步稀釋前需對前面的稀釋液混合不少於30秒，不要貯存稀釋液，因為沒有數據能證明其不會因為吸附作用而失去活性。

5、供試品溶液的制備

CP：|某些供試品需進行復溶、稀釋或在水性溶液中浸提 用LRW復溶或稀釋葯品或抽提醫療器械，某些物質可能更適於用其它水性溶液來溶解、稀釋或抽提。
對於過酸、過鹼或本身有緩沖能力的供試品需調節被測溶液（或其稀釋液）的pH值，一般要求供試品溶液的pH值在6.0-8.0的范圍內。

USP：用LRW復溶或稀釋葯品或抽提醫療器械，某些物質可能更適於用其它水性溶液來溶解、稀釋或抽提。

6、內毒素限值的建立

CP：葯品、生物製品的細菌內毒素限值（L）一般按以下公式確定：L=K/M
L 為供試品的細菌內毒素限值，一般以 EU /ml、EU / mg 或 EU / U （活性 單位）表示； K 為人每千克體重每小時最大可接受的內毒素劑量，以 EU / ( kg · h ）表示，注 射劑 K = 5EU/(kg•h )

放射性葯品注射劑 K=2.5EU / （kg· h ) ， 鞘內用注射劑 K = 0.2EU / （kg· h ) ； M 為人用每千克體重每小時的最大供試品劑量，以 ml / ( kg · h ）、mg / ( kg · h ） 或 U / ( kg · h ）表示，人均體重按 60kg 計算，人體表面積按 1.62m2 計算。

注射時間若不足 1 小時，按 1 小時計算。供試品每平方米體表面積劑量乘以 0.027 即可轉換為 每千克體重劑量（M）。

USP：非經腸道葯品的內毒素限值，以劑量定義，等於K/M
除了鞘內給葯以外的任何給葯途徑，K均為5 USP-EU/kg，鞘內給葯時，K為0.2 USP-EU/kg，對於非鞘內給葯放射性葯品，內毒素限值的計算為175/V，V為以mL為單位的最大推薦劑量

對於鞘內給葯的放射性葯品，其內毒素限值為14/V，對於按以每平方體表面積計算的給葯劑量（通常是抗腫瘤葯品），計算公式為K/M，其中K=5EU/kg，M為（最大劑量/m2/小時×1.80m2)/70kg。

7、靈敏度復核實驗

CP：當最大濃度2.0λ管為陽性，最低濃度0.25λ管均為陰性，陰性對照管為陰性時，實驗方為有效，按下式計算反應終點濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度的測定值（λc）：λc=lg-1(ΣX/4)

USP：|濃度最低的標准品溶液的所有重復管均為陰性，實驗方為有效。
用下式計算終點濃度的對數值的平均值，然後再計算該平均值的反對數：終點濃度的幾何平均值= antilog(Σe/f)

Σe是稀釋系列的終點濃度的對數值之和，f為重復管數，反應終點濃度的幾何平均值即為鱟試劑靈敏度的測定值。

8、凝膠法限量實驗：

CP：溶液制備以添加了內毒素的溶液為「供試品溶液』。---USP：為「經稀釋的供試品溶液。

CP：使用稀釋倍數為MVD並且已經排除干擾的供試品液來制備溶液A和B。----USP；使用稀釋倍數不超過MVD的稀釋液來制備溶液A和B

CP：在復試中，溶液A需做4支平行管，當所有平行管都為陰性時，供試品溶液符合規定
------------USP：在復試中，如果溶液A的兩支平行管均為陰性，供試品溶液符合規定

USP：如果供試品溶液以不超過MVD的某個稀釋倍數稀釋，檢測結果為陽性時，可進一步稀釋供試品溶液但不能超過MVD，再重新進行試驗。------CP；無規定。

D. 細菌內毒素檢測方法動態濁度法和凝膠法結果不一致

您好，同一樣品採用動態濁度法檢測和凝膠法檢測內毒素結果相差很多的原因主要有:
1.動態濁度法比凝膠法靈敏很多，比如某個樣品中內毒素限值為0.40EU，使用動態濁度法檢測結果在0.35EU/ml左右，而使用凝膠法，當使用0.5EU的鱟試劑時，有可能檢測結果會呈陽性!
2.動態濁度法和凝膠法實驗過程中使用的內毒素標准品存在差別，由於判斷實驗結果的質控品的不一樣，會使實驗結果較大的誤差!
根據要點的規定，當定量法和凝膠法的實驗結果出現偏差時，以凝膠法的實驗結果為准!
廈門市鱟試劑實驗廠有限公司為您提供全方位的內毒素檢測服務!
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E. 細菌內毒素的檢測方法

鱟試劑法（利用鱟血液遇革蘭氏陰性菌時會產生凝膠的原理）

F. 中國葯典和美國葯典中的細菌內毒素檢測法的不同點比較

中國葯典和美國葯典中的細菌內毒素檢測法的不同點比較

1、細菌內毒素工作標准品（CSE）

CP 對CSE的用途及效價進行定義「細菌內毒素工作標准品中每1ng細菌內毒素的效價應不小於2EU，不大於50EU」

USP未提

2、細菌內毒素檢查用水

CP ： 與靈敏度為0.03EU/ml或更高靈敏度的鱟試劑在37±1℃條件下24小時不產生凝集反應的滅菌注射用水

USP：與鱟試劑在限定的靈敏度下不發生反應的滅菌注射用水或其它水。

CP：用於細菌內毒素定量測定用的細菌內毒素檢查用水，內毒素含量應小於0.005EU/ml。

USP： 未提到。

3、實驗用具的准備

CP：實驗所用器皿需要經處理，除去可能存在的外源性內毒素，常用的方法是250℃下干烤至少1小時，也可用其它確證不幹擾細菌內毒素檢查的適宜方法。

USP：使用經驗證的除熱原程序對所有玻璃器皿和遇熱穩定的材料在熱空氣烘箱中進行除熱原，常用的最低溫度和最少的時間是250℃下30分鍾。

(6)純化水細菌內毒素檢測凝膠法擴展閱讀

細菌內毒素檢查法的注意事項：

在細菌內毒素檢查方法的建立中，計算內毒素限值L、MVD和MVC時，需要注意最大人用劑量、產品規格、鱟試劑的靈敏度等重要的參數，因為計算錯誤會導致後續的所有努力均告失敗。常見的問題有：

(1)臨床用葯劑量確定不正確，僅用常規用葯劑量，未考慮臨床可能的人體最大用葯劑量和給葯途徑，在限值計算公式L=K/M中，由於對K值及M值的定義模糊，使K值及M值賦值不準確，最終導致限值計算錯誤。

例如，某注射劑臨床成人每次靜脈滴注給葯40-80mg，嬰兒(三個月以上)靜脈滴注給葯每次10-20mg。

按成人(體重60kg)劑量計算限值為3.75EU/mg，而嬰兒體重僅為5kg左右，計算限值約為1.25EU/mg，如果不考慮臨床每公斤體重最大用葯劑量，細菌內毒素限值就會出現較大的差別。

(2)有的申報品種細菌內毒素限值不是根據臨床用量計算出來，而是根據同品種熱原檢查的劑量推算出來的，造成限值錯誤。

(3)有的品種細菌內毒素限值從國外葯典抄來，沒有考慮該品種國內上市的臨床使用劑量及中國人與國外人均體重等的差異，也造成限值確定不正確。

(4)錯誤的計算日給葯劑量(一日內多次給葯)。

(5)在品種規格(濃度)發生變化時，計算MVD沒有進行調整。

(6)建立方法時所用的最大給葯劑量已經超出了臨床所用劑量等。

G. 細菌內毒素的檢驗方式有什麼

細菌內毒素檢查法是判斷供試品中細菌內毒素是否符合規定。 內毒素(Endotoxin)即革蘭氏陰性菌細胞壁的脂多糖，其毒性成分為類脂A。菌體死亡崩解後釋放出來。細菌內毒素檢查包括兩種方法，即凝膠法和光度測定法，後者包括濁度法和顯色基質法。供試品檢測時，可使用其中任何一種方法進行試驗。當測定結果有爭議時，除另有規定外，以凝膠法結果為准。

H. 2010版葯典關於凝膠法細菌內毒素檢查與2005版葯典有哪些不同

沒有什麼不同，要說不同有兩點：1、反對數計算公式的表示方式原來lg-1→antilg；2、檢查法（1）凝膠限量度試驗→凝膠限度試驗