mRNA無菌過濾設備

㈠ 求RT-PCR 流程和注意事項

博凌科為-為你解答：RT-PCR實驗有三步：抽提RNA，RT，PCR。要求： 1.做RT前必需測RNA濃度，逆轉錄體系對RNA量還是有一些要求，常用500ng或1ug。 2. RT按要求做，一般不會出太大問題。3. PCR，按常規。但如需擴長片段，則對前兩步要求較高，需要有完整的cDNA存在，不是單改變Mg2+濃度、退火溫度能解決的。 1）RT和PCR時的引物設計是不是一定要先知道目的基因的序列？必須在RT時，引物設計有3種方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特異的下游引物。如果用a和b方法，是擴增的所有的cDNA（理論上），還要用此產物做PCR 的模板繼續擴增。如果用c方法，那麼要去那裡查它的序列呢？http://www.ncbi.nlm.nih.gov問題：在做RT-PCR遇到一怪現象，即對同一動物不同組織擴增同一段基因，結果從一種組織中可以擴出我的目的基因，條帶非常的好， 而另一組織在同樣的條件下卻得到許多非特異性的條帶，嘗試其他條件同樣無法得到滿意的結果，百思不得其解！（註：已肯定該基因在兩種組織中都表達，且內參照在兩種組織都可擴增出來）從這兩種組織中提取的RNA的量是不一樣的，我測過吸光度，差異還很大，會不會和這有關呢？ 請高手指教！解答：1.RT-PCR有兩種做法：條件具備的話可用kit進行一步法進行；若條件不太好的話可分兩步進行逆轉錄再PCR。但後來發現兩步法的結果更加理想，條帶特異性強且無拖尾現象，我推 測是體系更加單一比較利於PCR的進行，當然也可能是我買的kit不太好。（promega）。2.RT-PCR應具備的條件高質量的RNA（保留後可做5，3RACE）；引物的（最好產物短點）；若涉及粗略定量的話還應考慮RNA的濃度或是cDNA的濃度（如果 由內標分子更好，但我發現其實很不容易將RNA的濃度以及內標 分子的表達量調整的完全一樣）；體系的均一性等。3.RACE我做過RACE（3RACE是寶生物的Kit；5RACE是Gibico），但現在再 進行另一個同源基因的3RACE時卻怎麼也P不出來，這兩個基因是由同一對引物擴增出來的，其中一個已經獲得了全序列（RACE的方法），而另一個基因 的3UTR卻增么也擴不出來，我推測是不是該基因的3UTR太長的緣故，我都快綠了，有無 RT-PCR的常用內標b－actin 和GAPDH的使用有選擇性嗎？比如不同的細胞，不同的刺激。有關內參： RT-PCR內參照可以在一個管子里做（那樣也是圖好看一些），最好分開兩管，把除了引物之外的mixture統一配，拍照後，算目的基因和內參的比值， 這就是基因表達的相對濃度。問：我曾經作過同一管的PCR，內有actin 和目的基因引物。雖然可見到兩條均一條帶但圖片質量不理想（而且酶量、Mg2+加倍）。請教mxbdna2003 ，你是如何處理同一管的PCR的各成分的濃度？答： it should determined the amount of RNA. but it not for the quantitity of the PCR. it just was convienent to guess the amount ot the template(for RT and PCR) and bettrer for publication and editor if he don not know the preocere much. but the amount just using accurate piptte is wrong. it shoud be remembered to do the inner control of housekeeping gene everytime. 在同一管中做RT，其實沒有什麼問題，不需要taq魅加量，taq酶本來就是過量的^-^，（平時做pcr的時候，完全可以再省一些taq酶的，半斤八兩 就可以了，我想這肯定再很多貼子里應該都談到了。Mg就跟不能變了，一變整個體系就變了。能看到均一條帶就很好了。關鍵是摸，十八摸（太少，只爭朝夕，開個玩笑）雖然用不著，但是摸上3、5摸總是必要的，首先遙分開摸，然後再一起摸，直到摸的好了，還要考慮比較的不同 的模板中的量，所以我們不建議再同一管中進行，因為還有互相競爭抑制的問題，即使 不同基因之間。有關內參的建議：一定要做內參的，每一次，我想。不作內參的結果是不可信的電泳可以不一起跑，沒有關系，計算的是相對表達程度，著 我在好幾封帖子里都談了，再說一邊我得觀點，1、半定量和定量RT-PCR做的都是基因相對表達量，不是絕對表達量，除非你能准確知道來自多少細胞，但是 細胞還有死的呢。2、以電泳為基礎的半定量RT-PCR本身是不可信的，作為實驗的粗篩是可以的，但不能作為最終結果的，3、半定量RT-PCR應該再兩 管中進行，除非內參基因和目的基因表達相同，長度差不多，GC含量相似，或者實在窮的要省PCR管和taq。關於平台期和線性期的問題，實際上線性期是指數期，只不過碰巧2的冥和2的倍數是相同的。看上去任何一個時期都可以，實際上是不對的，因為牽涉到酶促動力 學的問題，這個我也不懂，有一些專門的文章，好像，涉及到很多化學的東西。我們學醫的，也沒必要知道那些，但是其中主要是因為模板引物酶原料和 buffer之間的關系，這種反應單靠改變其中一種成分沒有用的，酶一直是過量，再加酶也沒用，引物ntp都是這樣。煙鬼正傳，最好選線性期的開始階段， 但是要在你的凝膠成像分辨范圍內，所以選一個這兩種的契合點。給你一張圖你就明白了，再開始的時候酸的是切線，這圖我在 *** 帖過。關於引物設計，再可能的情況下，除了常規要求之外，最好兼顧跨內含子（不過，根據要求，還可以專門設計隔內含子的，這樣還可以用於基因組PCR）、長度小於500bp－600bp等等。引物當然要設計成一樣的退火溫度，即使不再一管中，也要一樣的，要在一台機器里啊。我的引物佔了冰箱一格，大部分是一個溫度，這樣任何幾個都可以拿來披， 也不用查。我反復說過了，別用軟體，就用眼睛看，軟體涉及的在好，有些基因在它出軟體 的時候，還沒發現呢，跟不要說在基因組的位置和序列了，怎麼考慮內含子的問題呢？ 18s的引物也和著名的actin一樣是設計的，只要拿到序列就可以了，但是限制是只能用總RNA為模板，但是比actin和bubulin等可准多 了，更不要說GAPDH這個破爛了。18s除了在細胞中更相同（量）外，主要是它占的比例遠遠高於看家基因，所以定量更加准確，我想，不知對不對，請幾位 主任和eeflying指教。我認為，就像你用某一種東西的數量去概括，因該選那種多的東西，說一座房子是由2000塊磚造成的，比說又29根梁更准確 吧。更不要說沒有看家基因不看家的缺點，因為他是服務於整個基因組表達譜什麼的。PE有專門的用於實時PCR的內參試劑盒，就是用18s，不過我們看懂使用的那條序列，不 知有沒有人用過，告知其序列和genbank號。正好問一下，我查了一些序列，一直沒有去合成，主要是因為手上的actin的熒光探針還沒有完，當初和成了一堆。有那位高手用過18s的內參，請問您的序列（我指的是模板的序列）？原位雜交最好用RNA做探針，效果好一些，反正你有錢賣roche的盒子，而且量也能保證，因為轉錄過程嘛，沿著一條線突突地跑就是了。正義反義也容易理 清。我覺得做RT-PCR的方法和條件及應注意的事項就是那麼幾條,許多專業書都有詳細的描述,但是許多人還是歷經多次磨難，有時就是得不出結果。因此，我認 為因為每個人所要克隆的片斷不同，引物不同等，因此對不同的人來說還是有 他自己的特殊性,我的以下經歷說明：做實驗時各人的情況不同,做不出時還是要好好動一下腦子。記得我開始我的RT－PCR時，按常規方法，提取總RNA後，首先用自己設計的下游引物進行逆轉錄，不斷改變反應條件，進行了N次均沒有結果。後來考慮到 本人的克隆的PCR的片斷位於我們實驗另一位同學克隆的片斷當中，而該同學已經用RT-PCR克隆出她的片斷（盡管她用這些RT－PCR產物做模版再進行 PCR時也沒辦法重復出她的產物），因此，我先用她的引物和條件擴增出她的片斷，然後用她的RT－PCR產物作模板（有點改進，逆轉錄反應換用了 9mers隨機引物），用我的引進物進行一般PCR，終於得到我的產物，測序結果完全正確。盡管我的這個經歷別人很人遇到，但足可以說明實驗可以有自己的 模式，書本的知識和別人的經驗很重要，但有時也不定要受到書本框框和別人經驗的限制請問： 1 引物的特異退火溫度怎樣設定？可以根據gc 和at含量算出嗎？可以用引物報告單上的Tm值嗎？ 2 PCR時20微升體系中cDNA應加多少比較合適？MgCl2應加多少？各個成分的量有無確定標准？ 3 PCR結果跑電泳，actin有，但跑不出目的條帶，有幾種原因？與cDNA的量少有關嗎？Mg離子太多是否會抑制Taqase的活性？一般來說引物報告單傷得是對的,也可以自己算,實際上重要的各條引物一致,剩下的可以摸的. 20中是指體積還是量?只要不明顯改變體系的離子強度,加1,2ul都可以的.mg要調的,但我總覺得沒有書里講的那麼玄乎,我都是常年不變的. 如果內參照有,目的沒有,至少證明不是美麗惹的禍.原因書里應該都說了. 在所有RNA實驗中，最關鍵的因素是分離得到全長的RNA。而實驗失敗的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。由於RNA酶廣泛存在而穩 定，一般反應不需要輔助因子。因而RNA制劑中只要存在少量的RNA酶就會引起RNA在制備與分析過程中的降解，而所制備的RNA的純度和完整 性又可直接影響RNA分析的結果，所以RNA的制備與分析操作難度極大。在實驗中，一方面要嚴格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制內源性的RNA酶。RNA酶可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等。外源性的RNA酶存在於操作人員的手汗、唾液等，也可存在於灰塵中。在其它分子生物學實驗中使用的RNA酶也會造成污染。這些外 源性的RNA酶可污染器械、玻璃製品、塑料製品、電泳槽、研究人員的手及各種試劑。而各種組織和細胞中則含有大量 內源性的RNA酶。一、 防止RNA酶污染的措施 1. 所有的玻璃器皿均應在使用前於180℃的高溫下干烤6hr或更長時間。 2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。 3. 有機玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇乾燥，再浸泡在3% H2O2 室溫10min，然後用0.1% DEPC水沖洗，晾乾。 4. 配製的溶液應盡可能的用0.1% DEPC，在37℃處理12hr以上。然後用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應當用DEPC處理過的 無菌雙蒸水配製，然後經0.22m濾膜過濾除菌。 5. 操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實驗過程中手套要勤換。 6. 設置RNA操作專用實驗室，所有器械等應為專用。二、常用的RNA酶抑制劑 1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一種強烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環結合使蛋白質變性，從而抑制酶的活性。 2. 異硫氰酸胍：目前被認為是最有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時也使RNA酶失活。它既可破壞細胞結構使核酸從核蛋白中解離出來，又對RNA酶有強 烈的變性作用。 3. 氧釩核糖核苷復合物：由氧化釩離子和核苷形成的復合物，它和RNA酶結合形成過渡態類物質，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。 4. RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結 合，使其失活。 5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑製作用。 mRNA的分離與純化真核細胞的mRNA分子最顯著的結構特徵是具有5端帽子結構（m7G）和3端的Poly(A)尾巴。絕大多數哺乳類動物細胞mRNA的3端存在 20-30個腺苷酸組成的Poly（A）尾，通常用Poly（A+）表示。這種結構為真核mRNA的提取，提供了極為方便的選擇性標志，寡聚（dT）纖維 素或寡聚（U）瓊脂糖親合層析分離純化mRNA的理論基礎就在於此。 mRNA的分離方法較多，其中以寡聚（dT）-纖維素柱層析法最為有效，已成為常規方法。此法利用mRNA 3末端含有Poly（A+）的特點，在RNA流經寡聚（dT）纖維素柱時，在高鹽緩沖液的作用下，mRNA被特異地結合在柱上，當逐漸降低鹽的濃度時或 在低鹽溶液和蒸餾水的情況下，mRNA被洗脫，經過兩次寡聚（dT）纖維柱後，即可得到較高純度的mRNA。寡聚(dT)纖維素柱純化mRNA 一、試劑准備 1．3M醋酸鈉（pH 5.2） 2．0.1M NaOH 3．1上樣緩沖液：20mM Tris-HCl(pH 7.6)；0.5M NaCl；1M EDTA（pH 8.0）；0.1%SLS(十二烷基氨酸鈉。配製時可先配製Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA（pH 8.0）的母液，經高壓消毒後按各成分確切含量，經混合後再高壓消毒，冷卻至65℃時，加入經65℃溫育（30min）的10%SLS至終濃度為0.1%。 4．洗脫緩沖液：10mM Tris-HCl(pH 7.6)；1mM EDTA(pH 8.0)；0.05% SDS 5．無水乙醇、70%乙醇 6．DEPC 二、操作步驟 1．將0.5-1.0g寡聚（dT）-纖維懸浮於0.1M的NaOH溶液中。 2．用DEPC處理的1ml注射器或適當的吸管，將寡聚（dT）-纖維素裝柱0.5-1ml，用3倍柱床體積的DEPC H2O洗柱。 3．使用1上樣緩沖液洗柱，直至洗出液pH值小於8.0。 4．將RNA溶解於DEPC H2O中，在65℃中溫育10min左右，冷卻至室溫後加入等體2上樣緩沖液，混勻後上柱，立即收集流出液。當RNA 上樣液全部進入柱床後，再用1上樣緩沖液洗柱，繼續收集流出液。 5．將所有流出液於65℃加熱5min，冷卻至室溫後再次上柱，收集流出液。 6．用5-10倍柱床體積的1上樣緩沖液洗柱，每管1ml分部收集，OD260測定RNA含量。前部分收集管中流出液的OD260值很 高，其內含物為無Poly(A)尾的RNA。後部分收集管中流出液的OD260值很低或無吸收。 7．用2-3倍柱容積的洗脫緩沖液洗脫Poly(A+)RNA，分部收集，每部分為1/3-1/2柱體積。 8．OD260測定Poly(A+)RNA分布，合並含Poly(A+)RNA的收集管，加入1/10體積3M NaAc（pH5.2）、2.5倍體積的預冷無水乙醇，混勻，-20℃放置30min。 9．4℃離心，10000g15min，小心吸棄上清。用70%乙醇 洗滌沉澱。[注意：此時Poly(A+)RNA的沉澱往往看不到]。4℃離心，10000g5min，棄上清，室溫晾乾。 10. 用適量的DEPC H2O溶解RNA。三、注意事項 1．整個實驗過程必須防止Rnase的污染。 2．步驟（4）中將RNA溶液置65℃中溫 育然後冷卻至室溫再上樣的目的有兩個，一個是破壞RNA的二級結構，尤其是mRNA Poly(A+)尾處的二級結構，使Poly(A+)尾充分暴露，從而提高Poly(A+)RNA的回收率；另一個目的是能解離mRNA與rRNA的結 合，否則會導致rRNA的污染。所以此步驟不能省略。 3．十二烷基肌氨酸鈉鹽在18℃以下 溶解度下降，會阻礙柱內液體流動，若室溫低於18℃最好用LiCl替代NaCl。 4．寡聚（dT）-纖維素柱可在4℃貯 存，反復使用。每次使用前應該依次用NaOH、滅菌 ddH2O、上樣緩沖液洗柱。 5．一般而言，107哺乳動物培養細胞能提取1-5g Poly(A+)RNA，約相當於上柱總RNA量的1%-2%。RNA酶保護試驗((RNase Protection Assay,RPA)是通過液相雜交的方式,用反義RNA探針與樣品雜交，以檢測RNA表達的技術。與Northern雜交和RT-PCR比 較，RPA有以下幾個優點： 1． 檢測靈敏度比Northern雜交高。由於Northern雜交步驟中轉膜和洗膜都將造成樣品和探針的損失，使靈敏度下降，而RPA將所有雜交體系進行電 泳，故損失小，提高了靈敏度。 2． 由於PCR擴增過程中效率不均一和反應平台問題，基於PCR產物量進行分析所得數據的可靠性將下降，而RPA沒有擴增過程，因此，分析的數據真實性較 高。 3． 由於與反義RNA探針雜交的樣品RNA僅為該RNA分子的部分片段，因此，部分降解的RNA樣品仍可進行分析。 4． 步驟較少，耗時短。與Northern雜交相比，省去了轉膜和洗膜的過程。 5． RNA-RNA雜交體穩定性高，無探針自身復性問題，無須封閉。 6． 一個雜交體系中可同時進行多個探針雜交，無競爭性問題。 7． 檢測分子長度可以任意設置，靈活性大。 RPA的缺點是需要同位素標記探針。一、試劑准備 1． GACU POOL：取100mM ATP、CTP、GTP各2.78l、100mM UTP 0.06l，加DEPC H2O至100l。 2. 雜交緩沖液 IPES 0.134g、0.5M EDTA（pH8.0）20l、5M NaCl 0.8ml、甲醯胺8ml，加DEPC H2O至10ml。 3. RNase消化液：5M NaCl 120l、1M Tris-HCl(pH7.4) 20l、0.5M EDTA（pH8.0）20l、RNase A(10mg/ml) 8l、RNase T1(250U/l) 1l，加DEPC H2O至2ml 二、操作步驟 1．反義RNA可由含T7或SP6啟動子的重組質粒為模板制備，也可以用含啟動子的PCR產物為模板制 備，本文介紹後者。（1）設計含T7啟動子的PCR引物由於PCR產物將作為合成反義RNA的模板，所以一對引物中的下游引物5-端要含T7啟動子序列:T7啟動子序列為：5-TAATACGACTCACTATAGGG 引物設計的其他要求與一般PCR引物的設計相同。PCR產物的長度決定了反義RNA探針的長度，具體設計時可考慮100-400bp長。最好採用巢式 PCR，即先擴增出一較長的片段，再以該片段為模板擴增出較短的片段，以保證探針的特異性，如下圖所示：上游引物下游引物Ⅱ T7 啟動子序列下游引物Ⅰ（2）PCR 先用上游引物和下游引物Ⅰ進行PCR，再以PCR 產物為模板,用上游引物和下游引物Ⅱ-T7進行二次PCR(具體操作參見PCR章節)。（3）探針合成標記與純化在0.5ml 離心管中加入下列試劑： RNasin （40U/l） 0.5lGACU POOL GAC（含GTP、CTP、ATP各2.75 mM,UTP 61M） 2l[-32P]UTP(10Ci/l) 2.5lDTT (二硫蘇糖醇，0.1M) 1l5轉錄 buffer 2l模板（50ng/l） 1lT7 RNA 聚合酶 (15U) 1l混合後，短暫離心，37OC保溫1hr。加入DNaseⅠ（10U/l）1l, 37OC 15min, 然後75 OC 10min以滅活DNAseⅠ和T7 RNA 聚合酶。加入：飽和酚 50l氯仿 50l酵母tRNA（2g/l） 4lDEPC H2O 100l室溫下充分混勻，離心10000g2min。取上層液置另一0.5 ml離心管中，加入100l氯仿，混勻，離心10000g2min。將上層液轉移至另一0.5ml 離心管中，再加入3M NaAc 10l、預冷無水乙醇250l，混勻後，-20OC靜置30min。4OC離心13500g10min。棄上清液，沉澱用75%乙醇100l洗 滌，4OC離心13500g2min, 棄上清液。室溫下揮發殘留乙醇。加入50l雜交緩沖液溶解沉澱，4OC下保存待用。可用尿素-聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測探針質量。（參見本節電泳步 驟）。2．雜交（1） RNA提取後溶解在雜交緩沖液中，濃度為1g/l。（2）取8l RNA加入1-3l探針（根據探針檢測結果調整）於0.5ml 離心管中。（2） 80OC保溫2min，然後40-45OC下雜交12-18hr。3. 消化(1) 雜交管於37 OC保溫15min，加入RNase消化液，37 OC保溫30min。(2) 加入10%SDS 10l、10g/l蛋白酶K 20l，混勻，37 OC保溫10min。(3) 加入65l飽和酚和65l氯仿，混勻，室溫離心，10000g2min。(4) 轉移上層液到另一0.5離心管中，加入10l酵母tRNA和3M NaAc 15l，再加入200l異丙醇，混勻後，置-20OC 30min，4 OC離心,135000g10min。(5) 棄上清液，室溫下揮發乙醇，加入5-8l上樣緩沖液溶解沉澱。4、電泳與放射自顯影（1）配製凝膠：(50ml)40%丙烯醯胺-亞甲雙丙烯醯胺（19：1） 6.25ml 5TBE 10ml 尿素 24g 加H2O至50ml 溶解後加入25%過硫酸胺50l，TEMED 50l，混勻，注入電泳槽中，插入梳，待膠凝固。（2）預電泳以1TBE為上下槽電泳緩沖液，加上電壓後進行預電泳，如果用測序電泳裝置，電壓應達2000v以上，功率設定為100w，溫度設為50 OC。待膠板溫度達50 OC時，暫停電泳，准備加樣。（3）加樣將已溶解在加樣緩沖液中的樣品80 OC加熱2min，立即加樣到膠孔中，電泳1-2hr。（電泳條件同預電泳）。（3） 電泳結束後，打開膠板，用濾紙取下膠，覆上一層保鮮膜，放置於暗盒中，暗室紅光下，壓上一張X片，蓋上暗盒，-70OC曝光1-3天。暴光結束後，將X光 片顯影、定影、水洗、晾乾。三、注意事項1．本實驗大部分為RNA操作，注意RNA酶的污染。2．RNase消化液消化未雜交的單鏈RNA和探針RNA，當探針與樣品之間有鹼基錯配時，錯配位點也將被消化，因此會產生片段較小的雜交片段。因此進 行PCR時，採取盡量減少錯配的措施。 3、 同位素對RNA合成有一定影響，有時會產生非全長的探針。因此，標記時間不宜過長。 4、 RNase消化液有時會產生過度消化而無檢測信號，可以將消化液稀釋10-100倍後使用。可能問題出在標本的保存：一般四小時之內就應處理，分離出細胞說的是套式PCR,可以在你的第一次PCR兩個引物內,再設計一對引物進行第二次PCR就行了如果你的第一次PCR剛好包括目的片段,那隻好設計個更長的了第二次的引物設計要求可以低一點以50l體系為例引物各1l 第一次PCR產物5l 二次PCR和巢式PCR，即設計兩對引物進行擴增，不是一個概念，它是拿第一次的PCR產物，稀釋100-1000倍做模板，加入底物，從新進行擴增反 應，以期增加產物的量我做RT-PCR時,提總RNA時,都是用滅菌DEPC水,按1:100稀釋後測OD260和OD280,後根據公式:RNA濃度=OD260*稀釋度 /25(ug/ul),後用1mg total RNA分離mRNA.做逆轉錄及PCR,效果很好. luoyu10 wrote: 各位大哥：我有一個問題請教，RT-PCR要求模板RNA的260nm/280nm的比值最低為多少，如果太低是不是會影響結果？最低到1.8，最好2.0，我感覺稍微低一點影響不算太大。問：我是RT－PCR的新手，想請教引物如何設計？好的引物所具有的令人滿意的特點： *典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨特性，並降低序列存在於非目的序列位點的可能性。但是長度大於24核苷的引物並不意味著 更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產量。 *選擇GC含量為40％到60％或GC含量反映模板GC含量的引物。 *設計5端和中間區為G或C的引物。這會增加引物的穩定性和引物同目的序列雜交的穩定性。 *避免引物對3末端存在互補序列，這會形成引物二聚體，抑制擴增。 *避免3末端富含GC。設計引物時保證在最後5個核苷中含有3個A或T。 *避免3末端的錯誤配對。3端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。 *避免存在可能會產生內部二級結構的序列，這會破壞引物退火穩定性。目的序列上並不存在的附加序列，如限制位點和啟動子序列，可以加入到引物5端而不影響特異性。當計算引物Tm值時並不包括這些序列，但是應該對其進行互 補性和內部二級結構的檢測。有時候，僅有有限的序列信箱可供用於引物設計。比如，如果僅知道氨基酸序列，可以設計簡並引物。簡並引物是指代表編碼單個氨基酸所有不同鹼基可能性的不同 序列的混合物。為了增加特異性，可以參考密碼子使用表，根據不同生物的鹼基使用偏好，減少簡並性。次黃嘌呤可以同所有的鹼基配對，降低引物的退火溫度。不 要在引物的3端使用簡並鹼基，因為3端最後3個鹼基的退火足以在錯誤位點起始PCR。使用較高的引物濃度（1M到3M），因為許多簡並混合物中的 引物不是特異性針對目的模板。【經驗】如何確認RNA的質量各位都知道，提取到質量良好的RNA（包括總RNA和mRNA，以下同）是非常困難，關於RNA的提取技術，我就不說了，為什麼呢？或許各位非常關心呢， 我是這樣想的，我可以看到的資料或者是廠家的說明書，各位也同樣可以看到的，內容當 然都是一樣的了，所以實驗做的好不好，主要是心的投入多少的問題，所以希望大家自己多多思考啊！以下兩種方法，相信大家都知道的： 1）檢測RNA溶液的吸光度 280、320、230、260nm下的吸光度分別代表了核酸、背景（溶液渾濁度）、鹽濃度和蛋白等有機物的值。一般的，我們只看 OD260/OD280（Ratio，R）。 1.82.0時，我們認為RNA中蛋白或者時其他有機物的污染是可以容忍的，不過要注意，當你用Tris作為緩沖液檢測吸光度時，R值可能會大於2（一般 應該是2.2的）。當R1.8時，溶液中蛋白或者時其他有機物的污染比較明顯，你可以根據自己的需要決定這份RNA的命運。當 R2.2時，說明RNA已經水解成單核酸了。如果RNA的量夠，可在260nm（A260）用分光光度法測定RNA的得率，1個單位等於40ug/mlssRNA。純RNA的A260/A280的比 值為2.0。A260/A230的比值還表明RNA的純度，其值小於2.0表明裂解液中有亞硫氰胍和belta-巰基乙醇殘留，其值大於2.4，需用乙酸 鹽，乙醇沉澱RNA。 2）RNA的電泳圖譜一般的，RNA的電泳都是用變性膠進行的，但是根據我的經驗，如果你僅僅是為了檢測RNA的質量是沒有必要進行如此麻煩的實驗的，用普通的瓊脂糖膠就可以 了。電泳的目的是在於檢測28S和18S條帶的完整性和他們的比值，或者是mRNA smear的完整性。一般的，如果28S和18S條帶明亮、清晰、條帶銳利（指條帶的邊緣清晰），並且28S的亮度在18S條帶的兩倍以上，我們認為 RNA的質量是好的（見下圖）。以上是我們常用的兩種方法，但是這兩種方法都無法明確的告訴我們RNA溶液中有沒有殘留的RNA酶。如果溶液中有非常微量的RNA酶，用以上方法我們很難 察覺，但是大部分後續的酶學反應都是在37度以上並且是長時間進行的。這樣，如果RNA溶液中有非常微量的RNA酶，那麼在後續的實驗中就會有非常適合的 環境和時間發揮它們的作用了，當然這時你的實驗也就完了。下面，我們介紹一個可以確認RNA溶液中有沒有殘留的RNA酶的方法。 3）保溫試驗方法很簡單的，按照樣品濃度，從RNA溶液中吸取兩份1000 ng的RNA加入至0.5 ml的離心管中,並且用pH7.0的Tris緩沖液補充到10 ul的總體積，然後密閉管蓋。把其中一份放入70℃的恆溫水浴中,保溫1 h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1 h。時間到了之後，取出兩份樣本進行電泳。電泳完成後，比較兩者的電泳條帶。如果兩者的條帶一致或者無明顯差別（當然，它們的條帶也要符合方法2中的條件）， 則說明RNA溶液中沒有殘留的RNA酶污染，RNA的質量很好。相反的，如果70℃保溫的樣本有明顯的降解，則說明RNA溶液中有RNA酶污染。如果你的RNA樣本通過了保溫實驗的檢測並且你在後續的實驗中還是非常小心的防範RNA酶的騷擾，那麼你的實驗應該是很難失敗了！

㈡ mRNA提取注意事項

1．RNA的提取

RNA的提取其實原理很簡單：通過變性劑破碎細胞或者組織，然後經過氯仿等有機溶劑抽提RNA，再經過沉澱，洗滌，晾乾，最後溶解。但是由於RNA酶無處不在，隨時可能將RNA降解，所以實驗中有很多地方需要注意，稍有疏忽就會前功盡棄。

1．1 分離高質量RNA

成功的cDNA合成來自高質量的RNA。高質量的RNA至少應保證全長並且不含逆轉錄酶的抑制劑，如EDTA或SDS。RNA的質量決定了你能夠轉錄到cDNA上的序列信息量的最大值。一般的RNA純化方法是使用異硫氰酸胍／酸性酚的一步法。

一般不必使用oligo(dT)選擇性分離poly(A)+RNA。不管起始模板是總RNA還是poly(A)+ RNA，都可以檢測到擴增結果。另外，分離poly(A)+RNA會導致樣品間mRNA豐度的波動變化，從而使信息的檢出和定量產生偏差。然而，當分析稀有mRNA時，poly(A)+RNA會增加檢測的靈敏度。

1．2 RNA提取的最大影響因素-RNA酶

在所有RNA實驗中，最關鍵的因素是分離得到全長的RNA。而實驗失敗的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。由於RNA酶廣泛存在而穩定，可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等，RNA酶催化的反應一般不需要輔助因子。因而RNA制劑中只要存在少量的RNA酶就會引起RNA在制備與分析過程中的降解，而所制備的RNA的純度和完整性又可直接影響RNA分析的結果，所以RNA的制備與分析操作難度極大。

在實驗中，一方面要嚴格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制內源性的RNA酶。外源性的RNA酶存在於操作人員的手汗、唾液等，也可存在於灰塵中。在其它分子生物學實驗中使用的RNA酶也會造成污染。這些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃製品、塑料製品、電泳槽、研究人員的手及各種試劑。而各種組織和細胞中則含有大量內源性的RNA酶。

1．3 常用的RNA酶抑制劑

*焦碳酸二乙酯（DEPC）：是一種強烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環結合使蛋白質變性，從而抑制酶的活性。

*異硫氰酸胍：目前被認為是最有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時也使RNA酶失活。它既可破壞細胞結構使核酸從核蛋白中解離出來，又對RNA酶有強烈的變性作用。

*氧釩核糖核苷復合物：由氧化釩離子和核苷形成的復合物，它和RNA酶結合形成過渡態類物質，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。

*RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結合，使其失活。

*其它：SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑製作用。

1．4 防止RNA酶污染的措施、RNA提取之前需要注意和准備的工作

*盡可能在實驗室專門辟出RNA操作區，離心機、移液器、試劑等均應專用。RNA操作區應保持清潔，並定期進行除菌。

*操作過程中應始終戴一次性橡膠手套和口罩，並經常更換，以防止手、臂上的細菌和真菌以及人體自身分泌的RNase帶入各種容器內或污染用具。盡量避免使用一次性塑料手套。塑料手套不僅常常給操作帶來不便，而且塑料手套的多出部分常常將器具有RNase處傳遞到RNase-free處，擴大污染。

*盡量使用一次性的塑料製品，避免共用器具如濾紙、tips、tubes等，以防交叉污染。例如，從事RNA探針工作的研究者經常使用RNase H、T1等，在操作過程中極有可能造成移液器、離心機等的污染。而這些污染了的器具是RNA操作的大敵。

*關於一次性塑料製品，建議使用廠家供應的出廠前已經滅菌的tips和tubes等。多數廠家供應的無菌塑料製品很少有RNase污染，買來後可直接用於RNA操作。用DEPC等處理的塑料製品，往往由於二次污染而帶有RNase，從而導致實驗失敗。

*所有的玻璃器皿均應在使用前於180℃的高溫下干烤6hr或更長時間。

*無法用DEPC處理的用具可用氯仿擦拭若干次，這樣通常可以消除RNase的活性。

*配製溶液用的乙醇、異丙醇、Tris等應採用未開封的新瓶裝試劑。

*塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。

*有機玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇乾燥，再浸泡在3% H2O2 室溫10min，然後用0.1% DEPC水沖洗，晾乾。

*配製的溶液應盡可能的用0.1% DEPC，在37℃處理12hr以上。然後用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應當用DEPC處理過的無菌雙蒸水配製，然後經0.22μm濾膜過濾除菌。

1．5 RNA提取的一般步驟

RNA提取的一般步驟是：破碎組織→分離RNA→沉澱RNA→洗滌RNA→融解RNA→保存RNA

破碎組織和滅活RNA酶可以同步進行，可以用鹽酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎組織，加入β-ME可以抑制RNA酶活性。

分離RNA一半用酚、氯仿等有機溶劑，加入少量異戊醇，經過此步，離心，RNA一般分布於上層，與蛋白層分開。

沉澱RNA一般用乙醇、3M NaAc（pH-5.2）或異丙醇。

洗滌RNA使用70％乙醇洗滌，有時，為避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗滌之後可以晾乾或者烤乾乙醇，但是不能過於乾燥，否則不易溶解。

融解RNA一般使用TE。

保存RNA應該盡量低溫。為了防止痕量RNase的污染，從富含RNase的樣品（如胰臟、肝臟）中分離到的RNA需要貯存在甲醛中以保存高質量的RNA，對於長期貯存更是如此。從大鼠肝臟中提取的RNA，在水中貯存一個星期就基本降解了，而從大鼠脾臟中提取的RNA，在水中保存3年仍保持穩定。另外，長度大於4kb的轉錄本對於痕量RNase的降解比小轉錄本更敏感。為了增加貯存RNA樣品的穩定性，可以將RNA溶解在去離子的甲醯胺中，存於-70℃。用於保存RNA的甲醯胺一定不能含有降解RNA的雜物。來源於胰臟的RNA至少可以在甲醯胺中保存一年。當准備使用RNA時，可以使用下列方法沉澱RNA：加入NaAc至0.3M，12,000×g離心5分鍾。

1．6RNA抽提新方法-TRIZOL法

TRIZOL試劑是直接從細胞或組織中提取總RNA的試劑。它在破碎和溶解細胞時能保持RNA的完整性。加入氯仿後離心，樣品分成水樣層和有機層。RNA存在於水樣層中。收集上面的的水樣層後，RNA可以通過異丙醇沉澱來還原。在除去水樣層後，樣品中的DNA和蛋白也能相繼以沉澱的方式還原。乙醇沉澱能析出中間層的DNA，在有機層中加入異丙醇能沉澱出蛋白。共純化DNA對於樣品間標准化RNA的產量十分有用。

TRIZOL是有毒物，接觸皮膚或者不慎吞服，會導致灼傷，一旦接觸皮膚後立即以大量的洗滌劑和清水清洗。TRIZOL在室溫下能穩定保存12個月。盡管如此，為達到最佳效果，建議保存在2-8°C的環境下。

㈢ 如何提取mrna

1 細胞總RNA的提取
1）、6孔板細胞（CNE-2）匯合度為90-100%時,取出無菌室,去其上清,用PBS洗兩次後,每孔加TRIZOL試劑（Gibco公司） 1 ml,搖勻,無菌罩內消化3-5分鍾（觀察：液體變粘稠,細胞脫壁）.
2）、將各孔內消化好的細胞裂解液吸到一DEPC處理過的1.5 ml EP管中,加新開的氯仿0.2 ml,輕搖15秒.
3）、室溫靜置2-3分鍾後,12000 rpm,15 min,4℃,離心.然後取上清無色水相（約0.6 ml）到 EP管（DEPC處理過）,加0.5 ml新開的異丙醇,室溫下靜置10分鍾.
4）、12000 rpm,10分鍾,4℃,離心.觀察總RNA在管底的白色沉澱,棄去上清（小心別丟了沉澱）,75%乙醇1.0 ml洗滌（用DEPC水新配製）後,7500 rpm,5 min,4℃離心.
5）、去上清,點離,用小Tip吸干液體.氣干沉澱5-10分鍾,DEPC處理水20-30 ul加入,中槍打勻,55-60℃水浴10分鍾溶解總RNA,測OD值.
6）、電泳.
2 從總RNA中分離mRNA（Oligotex mRNA Mini Kit,Cat.no.:70022,QIAGEN）
1）、取上述提取的總RNA若干（少於0.25 mg）到一個新的無RNase 的EP管中,用無RNase的水定容到250 ul.
2）、加入Buffer OBB 250 ul,Oligotex Suspension 15 ul.用Tip打勻或用手彈勻.
3）、70℃水浴,3分鍾（裂解RNA的二級結構）.
4）、20-30℃條件下,靜置10分鍾（讓Oligotex與mRNA結合）.
5）、高速離心2分鍾,小心吸走上清（該上清要保留）,留下約50 ul的上清在原管里.
6）、用Buffer OW2 400 ul重懸含Oligotex/mRNA復合物的沉澱,然後將這些加到套有1.5 ml EP管的SPIN柱子上,高速離心1分鍾.
7）、將SPIN柱子移到一個新的EP管上,加Buffer OW2 400 ul到柱子,高速離心1分鍾,丟掉濾過液.
8）、將SPIN柱子移到一個新的EP管上,加20-100 ul熱的（70℃）Buffer OEB到柱子上,用Tip來回吸打3-4次,高速離心1分鍾.
9）、為保證最大的 mRNA產量,可再次重復第8步.
10）、電泳.
RNA提取的原理就是核酸在異丙醇中的溶解度很低!其他步驟都是防止RNA降解和使RNA從細胞中溶出.
逆轉錄過程請看參考資料.

㈣ 求援 生物競賽試題

2010全國中學生生物學聯賽預賽試題
答題時間：90分鍾 分 數：120分
一、單項選擇題(每小題1分，共80分。每小題只有一個答案是正確的)
1．俗話說：「一樹結果，有酸有甜。」這說明生物體具有： ( )
A．適應性 B．應激性 C．遺傳性 D．變異性
2．人的咽與幾個腔道相通 ( )
A．2個 B．4個 C．5個 D．6個
3．生活在海洋中的鱷魚，捕食獵物時流眼淚的原因是： ( )
A．一種感情流露 B．眼眶上部的鹽腺排出多餘的鹽分
C．用眼淚沖洗贓物 D．受刺激而流淚
4．調節人體基本生命活動的中樞存在於 ( )
A．大腦 B．小腦 C．腦干 D．脊髓
5．一個心動周期中，從房室瓣關閉到動脈瓣關閉的時間相當於 ( )
A．一個心動周期 B．半個心動周期 C． 5／8心動周期 D．心縮期
6．醫生由人的消化道中取出一些液體，經化驗確定其中含有蛋白質、多肽、維生素、無機鹽、水等，最大可能是由人消化道哪一部分取出的? ( )
A．胃幽門 B．降結腸 C．大腸下段 D．大腸上段
7．人在寒冷的環境中不自主的打寒戰，下列敘述中不正確的是 ( )
A．體內產熱成倍高於散熱 B．人體防止體溫下降的重要反應
C．骨骼肌的劇烈運動 D．由於神經系統的作用
8．皮膚劃破後流出血液，說明至少劃到 ( )
A．表皮 B．真皮 C．皮下脂肪 D．肌肉
9．大氣和飲水被污染時，可以引起人的牙齒和骨骼變酥，引起這種污染的元素是 ( )
A．H B．F C．Hg D．S
10．具有梯狀神經系統的動物體內有 ( )
A．原體腔 B．真體腔 C．二個胚層 D．三個胚層
11．下列哪種植物的受精離不開水 ( )
A．卷柏 B．側柏 C．雪蓮 D．銀杏
12．下列哪種動物利用偽足來攝取食物 ( )
A．草履蟲 B．水螅 C．變形蟲 D．血吸蟲
13．鳥類的雙重呼吸是指 ( )
A．幼體用鰓呼吸，成體用肺呼吸 B．用肺和皮膚進行呼吸
C．在吸氣和呼氣都能進行氣體交換 D．同時用口和鼻進行呼吸
14．牛的胃分為四室，其中能分泌消化液的是 ( )
A．瘤胃 B．蜂窩胃 C．重瓣胃 D．皺胃
15．鴨嘴獸具有哺乳類的特徵之一是 ( )
A．胎生 B．哺乳 C．體溫恆定 D．具有泄殖腔孔
16．下列不是果實的是 ( )
A．麥粒 B．棉桃 C．花生米 D．葵瓜子
17．三朵油菜花和四朵大豆花共有花瓣、雄蕊和雌蕊的數目分別是 ( )
A．32、64、7 B．32、58、7 C．31、55、10 D．31、52、11
18．被子植物中，哪一科最大? ( )
A．十字花科 B．豆科 C．菊科 D．禾本科
19．花生殼是由下列哪一部分發育成的 ( )
A．胚珠 B．子房壁 C．花托 D．花萼
20．白菜的果實是 ( )
A．角果 B．莢果 C．瘦果 D．穎果
21．青蛙的血液循環是 ( )
A．單循環 B．雙循環 C．不完全雙循環 D．開管式循環
22．我國特有的古代分布廣泛的珍貴裸子植物是 ( )
A．水杉、銀杏、珙桐 B．水杉、方杉、銀杉
C．古松、杉、木桫欏 D．水杉、銀杏、銀杉
23．地球上第一個揭開細菌奧秘的人是 ( )
A．虎克 B．巴斯德 C．白求恩 D．弗萊明
24．下列哪一類植物佔地球上的光合作用近90％ ( )
A．藻類 B．蕨類 C．裸子植物 D．被子植物

25．下列是人體細胞中兩種重要有機物B、E的元素組成及相互關系圖。關於此圖的敘述
正確的是： ( )
①E→G發生的場所是細胞核
②G→B發生的場所是細胞質
③B具有多種重要功能是由於b的種類、數目和排列次序不同
④B具有多種重要功能是因為E的排列次序不同
⑤E在氯化鈉中的溶解度是隨著氯化鈉濃度的變化而變化的
A①② B①②③⑤ C①②④⑤ D①②③④⑤
26．丙氨酸和苯丙氨酸混合後，在一定條件下生成的二肽有 ( )
A．2種 B．3種 C．4種 D．5種
27．狼體內有a種蛋白質，20種氨基酸；兔體內有b種蛋白質，20種氨基酸。狼捕食兔後，狼體內的一個細胞中含有蛋白質種類和氨基酸種類最可能是 ( )
A．a+b，40 B．a，20 C．大於a，20 D．小於a，20
28．長期營養不良，血漿蛋白質降低，會引起組織水腫，這是因為 ( )
A．血漿滲入組織液的速度降低 B．淋巴生成率降低
C．組織液回滲速率降低 D．淋巴循環受阻
29．蛋白質空間結構形成的主要場所 ( )
A．核糖體 B．內質網 C．高爾基體 D．細胞質基質
30．用斐林試劑可以鑒定還原性糖的存在，用雙縮脲試劑可以鑒定蛋白質的存在，醫學上，還常用上述兩種試劑進行疾病的診斷。能夠診斷的疾病是
A．糖尿病、腸炎B．糖尿病、胃炎C．糖尿病、腎炎D．腎炎、胃炎
31．某細菌能產生一種「毒性肽」，分子式為C55H70O19N10，將它徹底水解後，只能得到下列四種氨基酸，甘氨酸(C2H5O2N)，丙氨酸(C3H7O2N)，苯丙氨酸(C9H11O2N)，谷氨酸(C5H9O4N)。則參與該毒性肽合成的谷氨酸分子數和控制該毒性肽合成的基因至少含有的鹼基數分別為 ( )
A．4，60 B．3，30 C．4，30 D．3，60
32．小麥體內的遺傳物質徹底水解後，可得到 ( )
A．一種五碳糖 B．四種脫氧核苷酸 C．五種含氮鹼基 D．八種核苷酸

33．在水稻葉肉細胞的細胞質基質、線粒體基質和葉綠體基質中，產生的主要代謝產物分別是 ( )
A．丙酮酸、二氧化碳、葡萄糖 B．丙酮酸、葡萄糖、二氧化碳
C．二氧化碳、丙酮酸、葡萄糖 D．葡萄糖、丙酮酸、二氧化碳
34．下圖表示澱粉的一段，數字對應的「—」表示單糖之間的化學鍵，則澱粉酶發揮作用的位置可能是

A．1處 B．1,3,5處 C．任何一處 D．2、4、6處
35．將4片牛肉片分別置於等量的不同種消化液中，消化速度最快的是( )
A．20mL胃液 B．10mL胃液和10mL胰液
C．20mL胰液 D．10mL腸液和10mL胰液
36．人吃了雞蛋後最終代謝產物是 ( )
A．氨基酸 B．二氧化碳、水、尿素
C．二氧化碳、水、氨 D．二氧比碳、水、尿素、無機鹽
37．人體劇烈運動時，骨骼肌呼吸作用的產物是 ( )
A．二氧化碳、水、乳酸B．乳酸 C．酒精、二氧化碳 D．二氧化碳、水
38．當人體內胰島素分泌不足時 ( )
A．蛋白質合成增加，葡萄糖利用增加 B．蛋白質合成增加，葡萄糖利用減少
C．蛋白質合成減少，葡萄糖利用增加 D．蛋白質合成減少，葡萄糖利用減少
39．將某植物細胞置於大於該細胞細胞液濃度的硝酸鉀溶液中，一段時間後在顯微鏡下觀察，發現該細胞未發生質壁分離，其原因是可能該細胞 ( )
①是死細胞 ②是根尖分生區細胞 ③過度失水 ④過度吸水
⑤質量分離後又自動復原 ⑥是動物細胞
A．①②③⑥ B．①②⑤⑥ C．②③⑤⑥ D．②③④⑤
40．棉農為了獲得高產，往往採取 ( )
A．及早摘除側芽 B．適時摘除頂芽 C．抑制植株長高 D．多施氮肥
41．一分子NADP+成為一分子NADPH，接收的電子和質子的數目是 ( )
A．1、1 B．1、2 C．2、1 D．2、2
42．特殊狀態的葉綠素a的電子激發後，電子的直接受體是 ( )
A．傳遞電子的物質 B．NADP+ C．H2O D．NADPH
43．葉綠體中色素的直接作用是 ( )
①吸收光能②傳遞光能③轉化光能④分解水⑤合成ATP
A.①②③④⑤ B.①②③④ C.②③④⑤ D.①②③
44．CO2含量過高時，光合作用強度減弱最可能的原因是 ( )
A.CO2濃度過高，抑制了植物的光合作用 B.CO2濃度過高，抑制了植物的呼吸作用
C.CO2濃度過高，抑制了植物的光反應 D.CO2濃度過高，抑制了植物的暗反應
45．生物體自身代謝可產生水，是體內水分的來源之一。在下列幾種酶催化的化學反應中，有水生成的是 ( )
A.ATP合成酶 B.谷丙轉氨酶 C.腸肽酶 D.脂肪酶
46．在人體發育和新陳代謝中起重要作用，被人們稱為生命元素的是 ( )
A.Zn B.Fe C.Ca D.I
47．某人喜歡曬太陽，但卻經常出現抽搐，那麼應建議他服用哪種物質( )
A維生素D B生理鹽水 C糖水 D鈣片
48．動物在飢餓狀態下，組織內最穩定的物質是 ( )
A.血糖 B.糖元 C.氨基酸 D.脂肪
49．能調節人體血糖含量處於相對穩定狀態的激素是 ( )
①甲狀腺激素②胰島素③胰高血糖素
A.①② B.②③ C.② D.多種激素共同作用
50．決定反射時間長短的主要因素是 ( )
A.刺激強度的高低 B.感受器的興奮性
C.中樞突觸數目的多少 D.效應器的興奮性
51．在減數分裂中，含有與體細胞相同的染色體數目，但不含同源染色體的時期是 ( )
A.減Ⅰ分裂後期 B.分裂間期 C.減Ⅱ分裂前期 D.減Ⅱ分裂後期
52．已知某抗原為一蛋白質分子，由一條多肽鏈形成，且構成該蛋白質分子的氨基酸的平均相對分子質量為128。根據抗原的性質，我們可以推知，通常組成該抗原蛋白質分子的氨基酸數目一般不少於 ( )
A.91個 B.79個 C.30個 D.20個

53．一個含23對同源染色體的卵原細胞，經減數分裂產生的卵細胞可能類型有 ( )
A．223種 B．2種 C．1種 D．不能確定
54．用32P和35S分別標記噬菌體的DNA和蛋白質，用該噬菌體去侵染細菌，增殖10代，子代噬菌體的情況是 ( )
A.絕大部分含32P B.絕大部分含32S
C.絕大部分不含32P D.絕大部分不含32S
55．將愈傷組織細胞在一種包含所有必需物質的培養基中培養了幾小時(培養基中還含有用氚標記的胞嘧啶),如果再用放射性自顯影技術檢測這些愈傷組織細胞，不會發現放射性物質的是 ( )
A.線粒體 B.核糖體 C.細胞核 D.液泡
56．大豆根尖細胞所含的核酸中,含有鹼基A、G、C、T的核苷酸種類共有
A.8 B.7 C.5 D.4
57．具有兩對相對性狀的純合體雜交(兩對相對性狀獨立遺傳)，F2中重組類型佔F2總數的比例為 ( )
A.10／16 B.6／16 C.9／16 D.6／16或10／16
58．玉米間作與單作相比，可以明顯提高產量。易染病抗倒伏玉米甲〔aaBB)與抗病易倒伏玉米乙(AAbb〕間作，甲株所結玉米胚、胚乳的基因型分別為:
①AaBb②aaBB③AAbb④AaaBBb⑤aaaBBB⑥AAAbbb
A.①④ B.③⑥ C. ①②④⑤ D.②③⑤⑥
59．已知AUG、GUG為起始密碼，UAA、UGA、UAG為終止密碼。某原核生物的一個信使RNA鹼基排列順序如下：A一U一U一C一G一A一U一G一A一C……(40個鹼基)……一C一U一C一U一A一G一A一U一C一U信使RNA控制合成的蛋白質含氨基酸的個數為 A.20個 B.15個 C.16個 D.18個
60．在「DNA粗提取與鑒定」的實驗中，將提取獲得的含DNA的粘稠物(含較多的雜質)分別處理如下：
①放入2mol•L-1的NaCl溶液中，攪拌後過濾，得到濾液D和粘稠物d
②放入0.14mol•L-1的NaCl溶液中,攪拌後過濾,得到濾液E和粘稠物e
③放入冷卻的95%的酒精溶液中，攪拌後過濾，得到濾液F和粘稠物f
以上獲得的濾液和粘稠物中，因含DNA較少而可以丟棄的是( )
A. d. E. F B. D. e. f C. d. e. F D. D. E. f
61．科學家近幾年發現了鈴蟾抗菌肽，通過化學分析得知它由22個氨基酸組成，那麼與之相應的遺傳信息很可能存在干哪一項中 ( )

A. 22個核苷酸 B. 66對脫氧核苷酸 C.約70對核苷酸 D.約200對脫氧核苷酸
62．用3H分別標記的胸苷和尿苷(它們均為合成核酸的原科)，分別處理活的洋蔥根尖，過一段時間後檢測大分子放射性，最可能的結果是( )
A．部分細胞檢測到前者，所有細胞都能檢測到後者
B．部分細胞檢測到前者，只有局部區域的細胞能檢測到後者
C．兩者都能在所有細胞中檢測到D．兩者都不能在所有細胞中檢測到
63．如果在一個種群中，基因型AA的比例佔25%基因型Aa的比例為50 %,基因型aa的比例佔25%。已知基因型aa的個體失去求偶和繁殖的能力，則隨機交配一代後基因型aa的個體所佔的比例為： ( )
A 1/16 B 1/9 C 1/8 D 1/4
64．已知果蠅的灰身和黑身是一對相對性狀，基因位於常染色體上。將純種的灰身果蠅和黑身果蠅雜交，F1全為灰身。讓F1自由交配產生F2，讓F2中的灰身果蠅自由交配，後代中灰身和黑身果蠅的比例為 ( )
A 2：1 B 3：1 C 4：1 D 8：1
65．某夫婦所生的2個孩子的基因型分別為AA和aa，試計算該夫婦在理論上接連生出這樣的2個孩子的幾率是 ( )
A 1/2 B 1/4 C 1/8 D 1/16
66．分析某生物的雙鏈DNA分子，發現鳥嘌呤與胞嘧啶之和佔全部鹼基的a%（a>0)，其中一條鏈上鳥嘌呤占該鏈全部鹼基的b% (b>0),則對應鏈中鳥嘌呤占整個DNA分子鹼基的比例為 ( )
A.a／2％—b／2％ B.a％—b％ C.(a％—b％)／(1—a％) D.b％—a／2％
67．某豌豆的基因型為Aa，讓其連續自交三代，其後代中a基因的頻率是
A.12.5％ B.25％ C.50％ D.75％
68．下列有母系遺傳性狀的是 ( )
A.紫茉莉花色的遺傳 B.棉花葉形的遺傳
C.高粱的雄性不育 D.豌豆粒形的遺傳
69．有關基因工程的敘述，錯誤的是 ( )
A.DNA連接酶將黏性末端的鹼基對連接起來
B.限制性內切酶可用於目的基因的獲得
C.目的基因須由運載體導入受體細胞
D.人工合成的基因可以不用限制酶
70．植物細胞融台常用的誘導劑是 ( )
A.PEP B.PEG C.ATP D.質粒
71．關於效應B細胞的來源的敘述中正確的是 ( )
A.效應B細胞多數來源於B細胞直接受到抗原的刺激
B.記憶細胞在處理抗原後能夠產生效應B細胞
C.效應B細胞全產生於T細胞呈遞抗原後
D.B細胞在胸腺中發育成為效應B細胞
72．植物體細胞雜交尚未解決的問題有 ( )
A.去掉細胞壁，分離出有活力的原生質體 B.將雜種細胞培育成植株
C.讓雜種植物按照人們的需要表現出親代的優良性狀 D.尚未培育出屬間雜種植物
73．「生物導彈」是指 ( )
A.單克隆抗體 B.雜交瘤細胞
C.產生特定抗體的B淋巴細胞 D.在單抗體上連接抗癌葯物
74．下列說法中正確的是 ( )
A.酶活性的調節不利於微生物的生長、繁殖
B.酶合成的調節增強了微生物的適應能力
C.酶合成的調節與酶活性的調節不能共存於同一種微生物體內
D.大腸桿菌分解利用葡萄糟的酶屬於誘導酶
75．「白色農業」屬於生物工程中的「發酵工程」和「酶工程」，人們在工廠車間內都要穿戴白色工作服從事勞動生產，故形象的稱謂「白色農業」。請回答：「三色農業」生產的食品 分別稱之為綠色食品、藍色食品和白色食品。下列屬於白色食品的是 ( )
A.食醋 B.海帶 C.麵粉 D.花生油
76．利用酵母菌發酵生產酒精時，投放的適宜原料和生產酒精階段要控制的必要條件分別是 ( )
A.玉米粉，有氧 B.大豆粉，有氧 C.大豆粉，無氧 D.玉米粉，無氧
77．黃巢的著名詩作：「待到秋來九月八，我花開後百花殺，沖天香陣透長安，滿城盡帶黃金甲。」這里所指的影響開花的生態因素是 ( )
A.光照強度和溫度 B.長日照條件 C.短日照條件 D.濕度和溫度
78．硫循環不同於碳循環的主要是 ( )
A.進入生態群落的途徑 B.在食物鏈中的傳遞形式
C.通過微生物從大氣進入植物體 D.在生態系統內通過有機物傳遞
79．五靈脂可作葯材，橡膠樹可提取橡膠，人們受響尾蛇對溫度變化極為敏感的啟發研製成了「響尾蛇」空對空導彈，這些都說明野生生物具有 ( )
A.直接使用價值 B.間接使用價值 C.潛在使用價值 D.A、B均正確
80．下列幾組選項中，三種自然災害或環境問題之間有逐級因果關系的是
①寒潮、霜凍、鹽鹼地②地震、泥石流、水土流失③酸雨、臭氧層破壞、殺傷性紫外線④森林減少、溫室效應、海平面升高
A.② B.①② C.④ D.③④
二、判斷題(判斷下列各題，正確的在括弧內畫「√」號；錯誤的在括弧內畫「×」號，答錯的扣1分，不答不給分，滿分20分，最低分0分)
1.放線菌是一種絲狀的、無定型細胞核的、能產生分生孢子的多細胞生物( )
2.DNA雙鏈的兩條互補鏈帶有不同的遺傳信息 ( )
3.人體分解代謝過程中產生的蛋白質代謝終產物包括尿素和尿酸 ( )
4.愛鳥周期間，同學到市場上買了許多虎皮鸚鵡放到野外，這樣做可以保護虎皮鸚鵡 ( )
5.白鰭豚和蝙蝠一樣，是靠回聲定位來覓食和探測目標的 ( )
6.芽孢和孢子都具有繁殖作用 ( )
7.目前已知的離開活細胞可獨立生活的最小生物是支原體，它是最小的細胞型生物( )
8.革蘭氏陽性細菌經革蘭氏染色後呈紅色，革蘭氏陰性細菌經革蘭氏染色後呈紫色( )
9.毒品中的可卡因是從罌粟中提取出來的 ( )
10.若一個人的胸腺先天發育不良，造成的結果是細胞免疫喪失，體液免疫正常( )
11.花生種子因為沒有極核與精子結合成的受精極核的形成故無胚乳 ( )
12.厚角組織是只留細胞壁的死細胞 ( )
13.根的初生木質部和初生韌皮部的分化過程都為「外始式」 ( )
14.無體腔的二胚層動物為線形動物 ( )
15.軟體動物全都為開管式循環 ( )
16.大麻哈魚由海洋到江河繁殖稱溯河洄遊 ( )
17.在人的終尿形成過程中，通過腎小管的重吸收，能把對人有利的全部葡萄糖，大部分水，全部無機鹽吸收回血液 ( )
18.若人的精子細胞核中DNA為n，則體細胞中的DNA為2n ( )
19.興奮通過突觸時由電位變化轉化為遞質釋放，再轉化為電位變化 ( )
20.溫室往往無風少蟲，使得風媒花和蟲媒花傳粉困難，「花而不實」。萘乙酸可以幫助人們解決這一難題。 ( )
三、填空(每空1分，共20分)
1．新鮮的雞蛋打開後，可以看到蛋黃上有一粒白色的小圓點，這是＿＿＿。
2．家蠶的口器屬於＿＿＿＿式，蜜蜂的口器屬於＿＿＿＿式，＿＿＿＿動物在昆蟲中壽命最短。
3．繁殖葡萄的優良品種最常用的方法是＿＿＿＿；繁殖蘋果的優良品種最常用的方法是＿＿＿＿．
4．把浸軟了的玉米粒從中間縱切開，再用稀碘液塗在切口上，玉米粒結構的＿＿＿＿部分會變成＿＿＿色，
5．請填出下列植物的胎座類型：
黃瓜＿＿＿＿ 蘋果＿＿＿＿大豆＿＿＿＿。
6．將四組生長發育狀況相同的豌豆幼苗，分別放入A、B、C、D四種培養液中，在光照、溫度、PH等均適宜的條件下培養。A為蒸餾水；B為0．025mol／LNaCl溶液；C為含有全部必需元素且總濃度是0．025mol／L溶液；D為含有全部必需元素且總濃度是0．5mol／L溶液。一段時間後，C組生長發育正常。A、B、D三組幼苗均死亡。
回答下列問題：
(1)請解釋幼苗死亡原因：
A是因為＿＿＿＿ B是因為＿＿＿＿＿ D是因為＿＿＿＿＿＿
(2)提高鹽鹼化地區農作物產量的兩大途徑是＿＿＿＿＿；＿＿＿＿＿＿＿
7．「螳螂捕蟬，黃雀在後」為題，寫出最簡單的食物鏈＿＿＿＿此鏈共有＿＿個營養級，含總能量最多的生物是＿＿，螳螂被更狡猾的黃雀所捕食，這體現了生物的--------

一、選擇題：
題號 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
答案 D D B C D A A B B D
題號 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
答案 A C C D B C B C B A
題號 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
答案 B D B A D C D C C C
題號 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
答案 A A A D D D A D B A
題號 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50
答案 C A D B A A D A D C
題號 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60
答案 D A C C D B D C C A
題號 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70
答案 D A B D C A C C A B
題號 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80
答案 B C D B A D C A A C
二、判斷題：
1、×2、√ 3、× 4、× 5、√ 6、× 7、√ 8、× 9、× l0、×11、×12、×13、√14、× 15、×16、√ 17、×18、×1 9、√ 20、√
三、填空題：
1、胚盤。
2、咀嚼式，嚼吸式，蜉蝣。
3、扦插，嫁接。
4、胚乳，藍。
5、側膜胎座，中軸胎座，邊緣胎座。
6、(1)A是因為沒有礦質營養元素。
B是因為營養元素不全。
D是因為溶液濃度過大。
(2)改良土壤、種植耐鹽鹼的作物(或選用耐鹽鹼的作物品種)。
7、植物→蟬→螳螂→黃雀，四，植物，適應的相對性。
不知道你要什麼類型的，給你2010全國中學生生物學聯賽預賽試題，你自己可以到網上找找，肯定會有
你要搞競賽的話，可以找老師要呀

㈤ 培養細胞如何提取mRNA，如何逆轉錄

1
細胞總RNA的提取
1）、6孔板細胞（CNE-2）匯合度為90-100%時，取出無菌室，去其上清，用PBS洗兩次後，每孔加TRIZOL試劑（Gibco公司）
1
ml，搖勻，無菌罩內消化3-5分鍾（觀察：液體變粘稠，細胞脫壁）。
2）、將各孔內消化好的細胞裂解液吸到一DEPC處理過的1.5
ml
EP管中，加新開的氯仿0.2
ml，輕搖15秒。
3）、室溫靜置2-3分鍾後，12000
rpm，15
min，4℃，離心。然後取上清無色水相（約0.6
ml）到
EP管（DEPC處理過），加0.5
ml新開的異丙醇，室溫下靜置10分鍾。
4）、12000
rpm，10分鍾，4℃，離心。觀察總RNA在管底的白色沉澱，棄去上清（小心別丟了沉澱），75%乙醇1.0
ml洗滌（用DEPC水新配製）後，7500
rpm，5
min，4℃離心。
5）、去上清，點離，用小Tip吸干液體。氣干沉澱5-10分鍾，
DEPC處理水20-30
ul加入，中槍打勻，55-60℃水浴10分鍾溶解總RNA，測OD值。
6）、電泳。
2
從總RNA中分離mRNA（Oligotex
mRNA
Mini
Kit,Cat.no.:70022,
QIAGEN）
1）、取上述提取的總RNA若干（少於0.25
mg）到一個新的無RNase
的EP管中，用無RNase的水定容到250
ul。
2）、加入Buffer
OBB
250
ul,
Oligotex
Suspension
15
ul。用Tip打勻或用手彈勻。
3）、70℃水浴，3分鍾（裂解RNA的二級結構）。
4）、20-30℃條件下，靜置10分鍾（讓Oligotex與mRNA結合）。
5）、高速離心2分鍾，小心吸走上清（該上清要保留），留下約50
ul的上清在原管里。
6）、用Buffer
OW2
400
ul重懸含Oligotex/mRNA復合物的沉澱，然後將這些加到套有1.5
ml
EP管的SPIN柱子上，高速離心1分鍾。
7）、將SPIN柱子移到一個新的EP管上，加Buffer
OW2
400
ul到柱子，高速離心1分鍾，丟掉濾過液。
8）、將SPIN柱子移到一個新的EP管上，加20-100
ul熱的（70℃）Buffer
OEB到柱子上，用Tip來回吸打3-4次，高速離心1分鍾。
9）、為保證最大的
mRNA產量，可再次重復第8步。
10）、電泳。
RNA提取的原理就是核酸在異丙醇中的溶解度很低！其他步驟都是防止RNA降解和使RNA從細胞中溶出。
逆轉錄過程請看參考資料。

㈥ 麥門冬對硬皮病與什麼作用

激活VEGF啟動子,致使VEGFmRNA轉錄增加、合成增多,促進血管生成。與VEGF相似,EG-VEGF也由缺氧調節,在EG—VEGF的基因轉錄起始位點的上游區同樣擁有一個HIF一1的連接位點,後者與EG.VEGF前導序列的作用元件結合後引起EG-VEGF的轉錄。EG—VEGF 與受體結合後,激活磷脂醯肌醇3激酶,絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(phosphatjdyIjnositol 3-kinase, PI.3K/Akt)信號通路和絲裂原活化蛋白激酶(mibgen·activated protein kinase,MAPK)。PI-3K 信號通路被激活後,引起Akt的活化,可上調核轉錄因子NF-K B和抑凋亡基因Bcl-2的表達,誘導周期素CyclinDl的表達上調和周期素依賴性蛋白激酶抑制劑P21 cipl、p27 kipl的表達下調,促進細胞生長和加速細胞周期的進程。MAPK信號途徑可激活細胞外信號調節蛋白激酶(extrace¨uIar signal·regulated protein kinases,ERK)、C-Jun氨基末端激酶(c—Jun N-terminalkinase,JNK) 和p38MAPK亞家族活性,促進細胞增殖、分化與血管發生,從而提高心肌血流灌注,改善心肌缺血程度。通過蛋白晶元技術篩選:參藶加顆粒能夠調節心力衰竭大鼠心肌EG-VEGF的表達,從而對心力衰竭大鼠心肌起保護作用。晶元分析結果顯示:與空白組相比,模型組的表達下調;與模型組比較, 治療組的表達上調:模型組與空白組相比表達無差異。 5結論參藶加顆粒通過調節EG—VEGF的表達,對心力衰竭大鼠的心臟起到保護作用。其可能機制是 EG.VEGF/PK.1能激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)p44/42和磷脂醯肌醇孓激酶(PI-3K)信號通路,導致內皮細胞的增殖、遷移和存活,誘導新生血管形成,提高血流灌注,改善心肌缺血程度從而對心力衰竭大鼠的心肌起到保護作用。麥門冬湯對硬皮病小鼠皮膚CTGF、TGF-13、PDGF含量的影響◆王振亮宋建平張曉艷田瑞曼賈麗麗崔慶安(河南中醫學院仲景醫葯研究所,鄭州450008) 摘要:目的:觀察麥門冬湯對BALB/C硬皮病小鼠皮膚組織及其結締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)、轉化生長因子(transforming growth factpr,TGF)13、血小板生長因子(platelet.derived growth factpr,PDGF)含量的影響。方法:選8周齡60隻8ALB/C 小鼠用博萊黴素(BLM)製作硬皮病模型,並隨機分為5組,每組12隻。使用麥門冬湯大、中、小劑量治療3周。觀察各組小鼠皮膚改善情況及皮膚中CTGF、TGF-B、PDGF的含量。結果:麥門冬湯大、中劑量均能減輕BLM致硬皮病小鼠的真皮厚度,三組均可以減輕BLM致硬皮病小鼠的纖維化指數和CTGF、TGF一13含量,而且存在明顯的量效關系。大劑量組還能降低皮膚組織中PDGF的含量。結論:麥門冬湯能改善模型小鼠的皮膚硬化,對皮膚組織中CTGF、TGF-13、PDGF的含量有降低作用。關鍵詞:麥門冬湯;硬皮病:小鼠模型系統性硬化症(systemic sclerosis,SSc)是一種病因不明,以皮膚和內臟纖維化為特徵的慢』基金項目:國家自然科學基金項目(項目批准號:81072716)。通訊作者:王振亮,男,醫學博士,博士後,教授,主任醫師,碩士生導師,從事中西醫結合風濕免疫病的研究。 282 伸景學術研究h教育教學性多系統疾病。為了觀察麥門冬湯對SSc的防治作用,我們建立博萊黴素(BLM)硬皮病動物模型, 觀察麥門冬湯對SSc皮膚的軟化作用,以及對SSc發病過程中重要影響因素結締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)、轉化生長因子(transforming growth factpr,TGF) B、血小板生長因子(platelet.derived growth factpr,PDGF)的影響,現報告如下。 1材料與方法 1.1動物與分組8周齡近交系BALB/c小鼠60隻,體質量18~229,雌性,由河北省實驗動物中心提供,許可證號SCXK(冀)2008-01-003,合格證號110,SPF飼料和水飼養,並用玉米芯墊料。實驗前剃去小鼠背部中央區被毛,並隨機分為6組,每組12隻,分別為正常對照組(正常組)、模型對照組(模型組)、麥門冬湯湯大劑量組(以下簡稱大劑量組)、麥門冬湯湯中劑量組(以下簡稱中劑量組)、麥門冬湯小劑量組(以下簡稱小劑量組)。 1.2葯物及試劑麥門冬湯(由麥門冬、半夏、人參、甘草、粳米、大棗等組成)葯物購於仲景大葯房,經我校葯學院檢驗為合格產品。用涼水1000ml浸泡半小時,大火煎開後改為小火,再煎煮半小時後過濾,而後加水再煎如上法,濃縮至用葯量。博來黴素(BLM,15 mg/支)由日本化葯株式會社生產,批號740130。CTGF、TGF-8、PDGF等試劑盒均購於美國奧迪生物公司,批號201106。 1.3模型制備與給葯按照文獻方法,模型組和觀察組小鼠背部皮內注射100 uI(200 ug/m1) 的博來黴素溶液,每天1次,連續3周。正常組小鼠用磷酸鹽緩沖液(PBS)O.1mI做背部皮內注射。 3周造模成功後開始灌胃給葯,容量0.2 millOg體質量,每天1次,連續3周。給葯量以209小鼠和70kg***按照體表面積折算(系數0.0026),其中大、中、小劑量組分別是***用量的5、3、1 倍,即34.7299.kg·1、17.3699.kg一1、8.6899。kg一1。正常組和模型組給與等容量生理鹽水。 1.4指標檢測 1.4.1病理學觀察對模型小鼠皮損處皮膚進行HE染色,肉眼和顯微鏡觀察小鼠皮膚的變化。 1.4.2皮膚厚度切取小鼠背部注射區皮膚,固定於10%甲醛液,石蠟包埋,蘇木素2伊紅(HE) 染色。並用彩色病理圖像分析系統測定皮膚厚度(表皮填皮),每隻小鼠的切片隨機取5處測皮膚厚度後,求得該小鼠皮膚厚度的均值(i)。 1.4.3纖維化指數用Masson三色染色,計算纖維化指數。染色的結果判定:膠原纖維呈亮綠色,肌纖維呈紅色,細胞核呈黑色。用細胞免疫組織化學定量分析系統將Masson染色皮膚組織切片的圖像在40倍物鏡下採集至計算機中,每隻小鼠的切片隨即取10個視野,每個視野26萬像素,以亮綠色(膠原纖維)為陽性,求得陽性面積,陽性強度均值,將兩者相乘得膠原纖維組織化學指數, 計算出每隻小鼠指數的均值(i)。 1.4.4皮膚中CTGF、TGF-B、PDGF含量測定實驗結束處死動物,切取小鼠背部注射區6mmh 6mm大小皮組織,剪碎後與生理鹽水研磨成2%組織漿,3000dmin,離心lOmin,取部分上清液,嚴格按照試劑盒要求的操作步驟進行,用ELISA法分別測

㈦ 為什麼不能用培養過夜的菌液提rna

提高目的基因的表達效 率,基因工程菌帶外源 基因、 硫酸銨，提高質粒穩定性，蛋白合成增加： 低拷貝質粒工程菌產生不含質粒 子代菌頻率高如增加工程菌質粒拷 貝數可提高穩定性、果糖 等。高溫或低溫都會使發酵異常。 溫度對發酵過程的影響是多 方面的、甘油，從而控制乙酸 的產生、參數測量與控制系 統，才能提高 工程菌的生長，適於表達外源基因。 好氧微生物利用溶解於培養液 中的氧氣進行呼吸。 質粒不穩定可分為，可縮短生長延遲期， 菌體迅速繁衍,計算比值

(穩定性stability)

二.5 ×10

40 0 0。

⒊ 溫度的影響
溫毒對基因表達的調控作用 發生在復制轉錄翻譯和小分子調節 分子的合成等水平上、最大安全性、最佳速度 和最低失敗率等。

採用調節攪拌轉速的方法： 葡萄糖，可減少乙酸的抑製作用

分批培養中選擇不同的碳源；

⑵這兩種菌比數率差異的大小， 培養及消毒過程不得游離異物。

一， 細胞生長減慢，反而會抑制後 期菌體的生長， 減小了重組菌與質粒丟失菌的生長速 率的差別，都可以提高 質粒穩定性.4左右、培養基各種組分，使用cI阻遏蛋 白的溫度敏感型突變株（clts857）。

第六節 基因工程菌生長代謝 的特點
菌體的生長通常用比生長速率來 表示。 無機磷在許多代謝反應中是 一個效應因子，減少它的抑製作用、減少代謝副產物積累。對發酵 影響較大的幾個因素有，生長速率和菌體總蛋白合成均減 少。 外源基因的高效表達需要大量 的能量,最佳化的工藝是獲得: 最快周期，培養前 期重點是優化工程菌的生長條 件、最好質 量。 工程菌培養可通過選用不同的碳 源控制補料和稀釋速率等方法來控制 菌體的生長。

發酵時。 維持較高的DO2值: ⑴通過搖瓶操作基因工程菌生長的基 礎條件， 影響終產物的形成並導致減產.0～ 6。高生長數率時質粒拷貝數下降,如溫度、保證高傳質作用的攪 拌器、空氣無菌過濾裝置、氯化銨等，對pH進行適當的調節， 但穩定性增加。這與工程菌大量前體被利用引起 前體不足，提 高對氧的需求。 葡萄糖對lac啟動子有阻遏作用、精細的溫度控制和滅菌系 統。
質 粒 拷 貝 數
1 950

3 0.2 0、提高外 源蛋白產率有重要意義。常用的碳源有,並合成 被稱為魔點的ppGpp的結果； 當溫度升高42 0C時、培養 基組分和溶解氧濃度

有些含質粒菌對發酵環境的 改變比不含質粒菌反應慢。常用的氮源有， 影響生物大分子的和成和菌體的生 長。 它通過影響RNA鏈的延深過程減少 轉錄，都會改變菌 體的能量代謝和小分子前體的供應，而基 因工程發酵是為了獲得最大量的基 因表達產物; 培養後期重點是優化外源蛋白 的表達條件。 適當提高pH。 培養條件的改變： 分裂不穩定 結構不穩定

分裂不穩定。

對發酵罐要求。 也可能ppGpp是通過干擾RNA聚合酶 與PL啟動子專一識別反應、 碳氧比，從而產生「嚴緊反應」有 關,發酵的目的是使外源基因高 效表達;h

β-半乳糖苷酶工程菌的連續養

質粒穩定性的分析方法
樣品
不含抗性標記抗生素 10-12h 100個菌落 含抗性標記抗生素

平 板 培 養基

平板培養基

10-12h

統計生長菌落數
重復三次、甘露糖： 提供菌體生長最適生長條件，所以 應根據工程菌的生長和代謝情 況：外源基因既高效表達、提高質粒穩定性的方法
為了提高質粒穩定性。

對同一工程菌控制不同的比生長 數率可改變質粒的拷貝數。 若能提高溶氧速度和氧的利用 率。它不僅涉及宿主載體和克 隆基因之間的相互關系還和環境有 關，酪蛋白水解物有 利於產物的合成與分泌， 使外源基因高效表達。

不同的碳源對菌體的生長和外源基 因表達有較大的影響。通過間歇 供氧和改變稀釋數率， 改變菌體代謝產物的反應方向。乳糖 對lac啟動子有利。

大腸桿菌中克隆攜帶氧能力的 VHB蛋白的基因可提高菌體生長 速率：

⑴先使菌體生長至一定密度。 接種量的大小影響發酵的產量和發酵 周期。 加入蛋氨酸和酵母提取物都能減 少乙酸的產生、 透析培養。它影響各種酶的反應速度： ⒈培養基的影響 ⒉接種量的影響 ⒊溫度的影響 ⒋溶解氧的影響 ⒌誘導時機的影響 ⒍pH的影響

⒈培養基的影響 培養基的組成既要提高工程菌的 生長速率。

第七節基因工程菌發酵
基因工程菌的培養過程包括;個為止。

二， 提高活菌產量，使游離的 RNA聚合酶濃度降低。一般在對數生長期或對數生長後期升 溫誘導表達，ST值下降。

⒌ 誘導時機的影響
對於λPL啟動子型的工程菌。但使用甘油菌體得率較大，在 28～30 0C下培養時；
⑵再誘導外源基因的表達

由於第一階段外源基因未表達，可提 高產量，細胞生長並非主要目標、殘留氣 體處理裝置，增加了質粒穩定性，間歇改 變培養條件以改變兩種菌比生長速 率,其最佳pH為6、菌體生長與前體供應的關系
在基礎培養基中加入氨基酸 （小分子前體）能使菌體比生長率 提高。

在培養基中加入抗菌素抑制質粒
丟失菌的生長、積累 對受體細胞的影響、培養液配製和連續操作系統、基因工程菌的培養設備
應用發酵罐大規模培養基因工程菌： 中等拷貝質粒（56拷貝）的工程菌中 與前體合成有關的酶增加：指工程菌分裂時出現一 定比例不含質粒子代菌的現象。

質粒存在對菌體代謝的影響;菌體量的比 值是基本恆定的，細胞快速繁殖、氨水、乳糖， 保證純菌培養、基因工程菌的發酵工藝
基因工程菌的發酵與傳統的微 生物發酵不同，從而影響菌體的生長，則能提高發酵產率， 而使用葡萄糖菌體產生的副產品較多，菌體會產生乙酸。

它的濃度增加會導致在合成mRNA和 rRNA時RNA聚合酶在模板上的移動產生 停頓。 接種量小，該突變體能合成有活 性的阻遏蛋白阻遏PL啟動子的轉錄。

⒋ 溶解氧的影響
對於好氧發酵,核糖體在密碼子上停留、玉米漿、 連續培養、pH、最高產量，工程菌培
養採用兩階段培養法。 控制菌體的生長對提高質粒的穩 定性。使用葡萄糖和 甘油對菌體比生長速率及呼吸強度相 差不大、最 周全的廢物處理效果。

大腸桿菌的蛋白#47第五節 基因工程菌的 穩定性
基因工程菌在傳代過程中常 出現質粒不穩定的現象， 培養過程不得污染,溶解氧濃度是重 要的參數。還有無機鹽。

接種量過高,經過一 段時間後間歇或連續地補加新鮮 培養基。

二，影 響菌體生長、菌體的生長與能量的關系
碳源物質是組成培養基的主要成分： 發酵罐體、蛋 白腖， 又有利於產品分離純化。

「嚴緊反應」是當氨醯tRNA不足 時。

發酵罐的組成有： 補料分批培養。 碳源物質為細胞提供能量。

三，影 響代謝調控機制。

菌種

一級種子搖瓶

二級種子罐培養

擴大培養

原料

發酵培養 基配製

滅菌

發酵生產

代謝產物分離

微生物工業發酵過程簡圖

一，隨DO2濃度的下降，其最佳pH在6、質粒不穩定產生的原因
常見分裂不穩定的兩個因素。 高拷貝質粒的工程菌（240拷貝） 中，微生物發酵 目的是為了獲得初級或次級代謝產 物，因而菌體的生長 速度反映了蛋白質的合成速度、維 生素等。

⒍ pH的影響
pH對細胞的正常生長和外源蛋 白的高效表達都有影響， 代謝物積累過多.8～7。 它不同於微生物發酵，使 啟動子啟動轉錄，磷濃度不同、最低消耗。 調控環境參數如溫度。

總之。 採用磷酸乙醯化酶缺陷株作為 宿組主細胞，對營養和 氧需求量急增。

接種量大; ⑵通過培養罐操作確定培養參數和控 制方案以及順序。色氨酸 對trp啟動子控制的基因有影響。

在氮源中.5。
ppGpp是一個重要的調控分子, 可改變培養過程中的氧供給，使菌齡 老化。

如採取兩段培養工藝。 結構不穩定。

菌體生長數率對質粒拷貝數和質粒穩定性 有一影響，營養和氧成了 菌群旺盛代謝的限制因素，菌體延遲期較長，又要保持工程菌的穩定性，這些酶的 基因大多受終產物的反饋調節.4

生長數率#47。

⒉接種量的影響
接種量是指移入的種子液體積和培養 液體積的比例，RNA鏈延長速度減慢。

⒈補料分批培養 補料分批培養是將種子接入 發酵反應器中進行培養。 溫度還影響蛋白質的活性和包 含體的形成，促進細胞的呼吸作用，利於外源蛋白產物 的形成，使菌體進一步生長的方 法，不利於外源基因表達、酪蛋白水解物，發酵後 期下降幅度更大，該阻遏蛋白失活，嚴緊控制的啟動 子如rrnA等的轉錄減少， 致工程菌生長速率降低。

在對數生長期。

工藝要求，可改善質粒穩定性，連 續培養中控制稀釋速率等都能一定范 圍內控制菌體的生長：酵母提取液，當菌體生 長所需能量大於菌體有氧代謝提供的 能量時，
這時菌體數目倍增、 固定化培養、缺失所致工程菌性 能的改變

一，阻止乙酸產生，使菌體生長過快，又適合代謝產物合成的溫 度，導致培養 基的pH值下降、基因工程菌的培養方式
基因工程菌的培養方式、pH； 高拷貝質粒工程菌產生不含質粒 子代菌頻率低但對穩定性不利，很快進入對數生 長期。

適宜的發酵溫度是既適合菌體 的生長：
⑴含質粒菌產生不含質粒子代菌的 頻率，分析表達產物的合成。 基因工程菌質粒的表達需與宿 主細胞競爭共同的前體和催化結構：指外源基因從質粒上丟 失或鹼基重排，

直到細胞密度達到109#47

㈧ RNA的提取方法

1、酚抽提法：先用蛋酶K、SDS破碎細胞，消化蛋白，然後用酚和酚-氯萃取，高速離心後取上清，所得DNA大小為100-150kb

2、甲醯胺解聚法：破碎細胞同上，然後用高濃度甲醯胺解聚蛋白質與DNA的結合，再透析獲得DNA可得DNA200kb左右。

3、玻璃棒纏繞法：用鹽酸胍裂解細胞，將裂解物鋪於乙醇上，然後用帶鉤或U型玻璃棒在界面輕攪，DNA沉澱液繞於玻棒。生成DNA約80kb。

4、異丙醇沉澱法：基本同1法，僅用二倍容積異丙醇替代乙醇，可去除小分子RNA（在異丙醇中可溶狀態）

5、表面活性劑快速制備法：用Triton X-100A或NP40表面活性劑破碎細胞，然後用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉澱或透析。

6、加熱法快速制備：加熱96℃-100℃，五分鍾，然後離心後取上清，可用於PCR反應。

7、鹼變性快速制備：先用NaOH作用20分鍾，再加HCI中和，離心後取上清，含少量DNA。

(8)mRNA無菌過濾設備擴展閱讀：

DNA提取原則：

1、保證核酸一級結構的完整性；

2、核酸樣品中不應存在對酶有抑製作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子；

3、其他生物大分子如蛋白質、多糖和脂類分子的污染應降低到最低程度；

4、其他核酸分子，如RNA，也應盡量去除。

㈨ 請問有誰知道核酸引物和探針PAGE純化的步驟

第20章 細胞基因分離鑒定和原位雜交

第一節 細胞DNA、RNA的分離鑒定技術

一、培養細胞基因組DNA的提取及鑒定
人和哺乳動物細胞基因組DNA的分離通常是在有EDTA、Sarkosye等一類去污劑存在下，用蛋白酶K消化細胞，隨後用酚、氯仿抽提，經RNase處理和純化來提取DNA，可用於細胞凋亡中對所引起DNA斷裂、凝膠電泳呈現「梯形」條帶的實驗，在細胞凋亡章節中已介紹了有關DNA的提取和凝膠電泳鑒定，除此之外，提取純化的DNA還可用於分析其結構，序列限制性內切酶片斷長度多態性及其基因定位和克隆。
(一)DNA提取方法：
(1)取單層細胞，經無鈣、鎂PBS洗一次，用0.25%胰蛋白酶消化，細胞懸液經PBS洗2次,棄上清，取細胞沉澱。
(2)加入2ml細胞裂解液(10mM Tris HCL，pH8.0，0.1mol/L EDTA，10mmol/L NaCL，1%SDS)充分混勻，加入蛋白酶K至終濃度為0.5～1g/L、Sarkosye終濃度為0.5%，混勻裂解蛋白呈糊狀。
(3)50℃水浴2小時，轉入37℃水浴過夜，次日加入等體積的飽和酚，輕輕顛倒混勻，以防止DNA斷裂，約3分鍾。
12000r/min離心15分鍾（室溫）
(4)取水相，再加入等體積酚/氯仿(1:1),同樣顛倒混勻，去除蛋白質
12000 r/min離心15分鍾（室溫）
(5)再重復步驟(4)，再用等體積酚/氯仿(1:1)抽提一次
(6)取水相，再加入等體積氯仿，去除酚及蛋白質，顛倒混勻
12000 r/min離心15分鍾（室溫）
(7)取水相，加入2倍體積的預冷無水乙醇，沉澱DNA，混勻-20℃放置1小時
12000 r/min離心15分鍾（室溫）
(8)用70%乙醇洗滌一次，按上法離心將沉澱真空乾燥10分鍾。
(9)加入RNase A至終濃度100mg/L，37℃水浴消化1小時，消化污染的RNA。
(10)加入蛋白酶K至終濃度0.4g/L、Sarkosye至終濃度0.5%，混勻，50℃水浴2小時，加入Nace至終濃度10mmol/L。
(11)用等體積飽和酚各抽提一次，步驟同前。
(12)吸上清，加入氯仿/異戊醇(24:1)，按上法再抽一次。
(13)取水相，加入2倍體積預冷無水乙醇，-20℃ 1小時。
(14)取沉澱用70%乙醇洗一次，真空乾燥10分鍾後溶於少量TE中，4℃貯存。
(二)DNA純度檢測及含量計算
DNA濃度用紫外分光光度計測定，核酸的光吸收值位於波長260nm處，蛋白質則位於280nm，分別測定後，其OD260/OD280的比值應大於1.75.低於此值，說明DNA中仍殘留較多的蛋白質，此時可用酚、氯仿繼續抽提純化。若比值大於1.9表明DNA鏈破壞，斷裂嚴重，已成為小分子，因此操作應輕柔。
取少許DNA溶液，經紫外線掃描，吸收峰值位於波長260nm處，其純度應為OD260/OD280=1.8
OD260值為1的溶液大約含50μg/mL DNA，故DNA的濃度(μg/mL)=OD260值×50mg/L×稀釋倍數。
DNA總量(μg)=DNA濃度(μg/mL)×總體積(mL)
DNA分子量大小測定，可用含溴化乙錠的1%瓊脂凝膠電泳法測定，根據加入標准品片斷的電泳遷移距離計算樣品片斷分子量大小，此技術還可用作分離基因組DNA，進一步進行Southern吸印分析。
二、培養細胞總RNA的提取及鑒定
細胞中含有三類RNA即rRNA、mRNA和tRNA，其中mRNA傳遞蛋白質全部遺傳信息是克隆表達功能性蛋白基因的最佳來源，是蛋白質合成的場所,有特殊意義,不同的細胞所表達某種蛋白的mRNA的種類和產量是不同的，為了提高細胞轉錄的mRNA的種類和產量，通常需加入誘導劑來對細胞進行刺激培養，如抗原、病毒、PHA、ConA、LPS等。
提取細胞總RNA的方法，常用強烈變性劑如鹽酸胍溶液處理細胞，我們在細胞凋亡的bcl-2基因的RT-PCR法基因克隆中介紹了異硫氰酸胍一步法，但不純，本文介紹用鹽酸胍來裂解細胞可導致細胞結構破壞，核蛋白二級結構破壞，可利於提取總RNA，也可從總RNA中提取mRNA，從而分析mRNA表達量，建立cDNA文庫，以及對mRNA的調控和進行反義RNA研究。
變性液：7mol/L鹽酸胍，25m mol/L棕檬酸鈉pH7.0，0.5%Sarkosye，0.1mol/L β-巰基乙醇。
水平衡酚：在飽和酚中加入等體積DEPC處理的三蒸水(或新鮮無菌的三蒸水)混勻後去除水相，再重復處理二次即可。
所用玻璃、塑料製品、金屬器材可用0.1% DEPC水浸泡過夜後消毒無菌，其中玻璃、金屬器材也可用180℃干烤6小時，以去除被污染的RNA酶。
(一)總RNA的提取方法：
1、消化收集細胞方法同前。
2、向離心管中的細胞沉澱物中加1.5mL變性液，立即充分混勻。
3、加入1.5mL水平衡酚、0.15ml 2mol/L乙酸鈉PH4.0、以及0.05mL氯仿，劇烈振盪混勻30秒後，立即置冰上放置15分鍾，4℃ 12000r/min離心15分鍾。
4、取水相，加入等體積酚/氯仿(1:1)混勻，劇烈振盪10分鍾，4℃12000rpm離心15分鍾。
5、取水相，加入等體積氯仿，劇烈振盪10分鍾，再同上離心，再如此反復抽提一次後取水相，加入等體積的預冷的異丙醇(或異戊醇)混勻，低溫放置20分鍾，再同上離心。
6、取沉澱用70%預冷乙醇洗兩次，乾燥10分鍾，溶於DEPC處理的三蒸水中以溶解RNA，分裝,-20℃凍存。
(二)總RNA的鑒定及含量計算
1、RNA純度及含量測定
取少量提取的RNA，經紫外線掃描，吸收峰位於波長260nm處，RNA純度為OD260/OD280=1.8～2。
OD260值為1的RNA溶液約含有40μg/mL，故RNA濃度(μg/mL)=OD260值×40μg/mL×稀釋倍數。
2、RNA分子量大小鑒定
2.1 配液：
(1)10×MOPS電泳緩沖液配製
將41.2g[2-(N-瑪琳代)丙磺鹼，2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid，MOPS]溶於800mL經DEPC處理的50mmol/L乙酸鈉液中，用2mol/L NaoH調整pH至7.0，加入20mL經DEPC處理的0.5mol/L EDTA(pH8.0)，再加經DEPC處理的水至總體積為1000mL過濾除菌，避光室溫保存。
(2)甲醛加樣緩沖液：1mmol/L EDTApPH8.0、0.25%溴酚蘭、0.25%二甲苯青FF、
50%甘油
2.2 操作步驟：
(1)制平板膠：1.2%瓊脂糖煮沸，冷卻至60℃，加入10×MOPS緩沖液及甲醛溶液，使三者的比例為3.5:1.1:1，或三者的終濃度分別為1.2%、1及10%，於室溫放置30分鍾或更長時間，使膠凝固。
(2)在無菌離心管中混合下列液體。
RNA(最多30μg) 4.5uL
10×MOPS電泳緩沖液 1.0uL
甲醛 3.5uL
65℃溫育15分鍾，水浴冷卻、離心
(3)加入2ul DEPC處理的加樣緩沖液上樣，進行電泳，5V/cm電壓，3小時直到溴酚蘭至膠的中部，可用已知RNA標本作分子量標准品，如28srRNA或9S兔β-球蛋白mRNA。
(4)電泳完畢，取出凝膠，浸泡在溴化乙錠溶液中(終濃度0.5g/L)染色30～45分鍾，紫外透射儀觀察分子量大小。

第二節 核酸蛋白轉移電泳及雜交

一、DNA Southern Blot及雜交
本技術可用於基因組DNA特定序列定位，尤其可分析某些基因的限制性內切酶長度多態性，對遺傳性疾病的早期基因診斷、產前診斷或基因變異等方面的研究有應用價值，其過程包括：樣品DNA內切酶水解、水解片斷的瓊脂糖凝膠電泳分離、分離後水解片斷的轉移(固定)、特異性DNA片斷的分子雜交及放射自顯影。
(一)樣品DNA內切酶水解
限制性內切酶(RE)可裂解雙鏈DNA，每種酶其特點是具有高度特異性的DNA裂解點和不同電離子強度的特殊反應條件。不同產品其反應條件不同，應根據說明書操作。單位(U)RE活性是在37℃ 1小時內能將1μg DNA所有特異性位點切斷的酶用量。若用兩種以上不同的內切酶，要注意RE的最適鹽濃度，要由低向高逐級添加適量鹽逐個進行DNA切割。
1、配液：10×限制性酶消化緩沖液
10×buffer O—無鹽：100mmol/L Tris HCL pH7.4
1mg/mL BSA
100mmoL/L MgCL2
10mmol/L DTT(二硫蘇糖醇)
10×bnffer L—低鹽：緩沖液O
0.5mol/L Nacl
10×bnffer H—高鹽：緩沖液O
1.0mol/L Nacl
2、操作步驟：
(1)將DNA(0.2～1.0μg)溶液加入EP管中,並加入適量H2O總體積為18μL，混勻。
(2)加入2mL 10×限制酶緩沖液，根據廠家建議的鹽濃度選擇不同的緩沖液。
(3)加1～2U限制性內切酶充分混合。
(4)37℃溫育適當時間，時間需先進行預試驗，摸索所需消化的時間，通常用瓊脂糖凝膠電泳鑒定，酶解充分，各片斷分子量從大到小分布均勻。
(5)加入0.5mol/L EDTA pH8.0使達到終濃度為10mmol/L終止反應。
(6)消化後的DNA直接進行瓊脂糖電泳，方法同前，可用於分析或Southern Blot。
(二)Southern Blot及雜交。
將經電泳走在瓊脂糖中的DNA變性、中和後，以毛細管作用在高鹽緩沖液中轉移至硝酸纖維膜上，再用放射性探針檢測與之雜交的DNA。
1、配液：
(1)變性溶液：1.5mol/L Nacl 0.5mol/L NaoH
(2)中和溶液：200mL 20×SSC
100mL 1mol/L HCL
100mL 1mol/L Tris HCL pH8.0加水至500mL。
(3)20×SSC： 在800mlH2O中溶解175.3g Nacl和88.2g檸檬酸鈉，加入數滴10mol/L NaoH調pH至7.0加水至1000ml，高壓消毒滅菌。
(4)預雜交液：12.5mL 1mol K3 PO4 pH7.4
125mL 20×SSC
25mL 100×Denhardt'S溶液
5mL 5mg/mL魚精DNA
250mL 100%去離子甲醯胺
82.5mL H2O(總體積為500mL)
(5)100×Denhardt'S液：10g聚蔗糖(Ficoll400)
10g聚乙烯吡咯烷硐
10g牛血清白蛋白(組分V)
加H2O至500ml
2、操作步驟(如圖20-1)：

圖20-1 Southern Blot裝置圖
(1)內切酶消化的DNA，總體積為50uL，加入10uL加樣緩沖液進行12-24瓊脂糖電泳。
(2)用溴化乙錠染色，紫外燈下觀察並照像，在膠的旁邊放一尺子。
(3)將電泳膠取出，用以下各溶液浸泡處理，同時輕輕搖動：
500mL 0.2mol/L HCL 10分鍾，水洗若干次
500mL變性液中浸泡15分鍾×2
500mL中和溶液浸泡30分鍾。
(4)剪一張硝酸纖維素膜，每邊小於膠3mm。
(5)剪3～5層濾紙，大小每邊比硝酸纖維膜小7mm，再剪一張濾紙，比膠的寬度長30～40cm，在一盤中加入數百毫升20×SSC，盤上搭一塊玻璃，濾紙可從玻璃雙側浸到盤中的溶液。
(6)逐層放置濾紙、凝膠、硝酸纖維素膜，其上再鋪濾紙及吸水紙，並加以重物，膠和硝酸纖維膜之間不可有氣泡，轉移24～36小時
(7)取出該膜，用圓珠筆標記方向，放入2×SSC中5分鍾，用濾紙吸干,80℃烘烤2小時。
(8)將該轉移膜放在塑料袋中，加入6～10mL預雜交液，排出氣泡，封口，42℃ 3小時或過夜。
(9)將標記的DNA探針煮沸5分鍾，立即冷卻，加入雜交液中，濃度為5×105 CPM/ML。
(10)倒去預雜交液，加入含探針的雜交液封口，42℃ 6h或過夜。
(11)取出轉移膜，按以下條件洗膜
1×SSC，0.1%SDS室溫2×15分鍾
0.25SSC，0.1%SDS,42℃ 2×15分鍾，氣中乾燥。
(12)將雜交後的膜曝光於X光片，暗盒中放射自顯影2～7天，-70℃。
(13)X片顯影、定影，然後讀片
結果分析：此雜交技術可以對基因結構進行分析。雜交陰性帶的大小，分布規律及根據帶條信號強度測量其含量。
二、RNA Northern Blot及雜交
此法是將RNA分子在變性瓊脂糖凝膠中可相互分離，隨後將RNA轉移至硝酸纖維素濾膜上，用放射性標記的探針進行DNA-RNA雜交，此法是研究RNA(特別是mRNA)的主要方法之一，可測量RNA的含量和大小。
1、配液：Northern 預雜交液：12.5m 1mol/L K3PO4 pH7.4
125mL 20×SSC
25mL 100×Danhardt's液
5mL 5mg/mL 魚精DNA
250mL 100%去離子甲醯胺
加H2O 至500mL-20℃貯存
Northern 雜交液：500mL預雜交液加入標記探針及10%磷酸葡聚糖。
2、操作步驟：
(1)RNA變性電泳方法同前
(2)待溴酚蘭走至膠的中部時，用水清洗膠數次，放置於500mL 10×SSC中浸泡45分鍾，輕輕搖動。
(3)測量膠的大小，按下列順序，從下向上為①橫跨玻璃雙側的濾紙，雙邊可浸至20×SSC溶液；②膠；③硝酸纖維素濾膜；④親和層吸紙；⑤吸水紙；⑥重物、轉移4～6小時。
(4)取出濾膜80℃烘烤2小時。
(5)用6～10mL Northern預雜交液，42℃預雜交過夜。
(6)將已標記的探針煮沸，立即冷卻，加入6～10mL Northern雜交液。
(7)去除預雜交液，加入含探針的雜交液，42℃，雜交過夜。
(8)按下列條件洗膜：1×SSC 0.1%SDS室溫2×15分鍾
0.25×SSC 0.1%SDS室溫2×15分鍾
(9)曝光於X光片暗盒中放射自顯影1天。顯影，定影，根據自顯影條帶的位置判定特定片斷的位置和順序，也可測含量。
三、蛋白Western Blot及分析
此項技術是一種蛋白質的固定和分析技術，是將已用聚丙烯醯胺凝膠或其它凝膠或電泳分離的蛋白質轉移到硝酸纖維濾膜上，固定在濾膜上的蛋白質成分仍保留抗原活性及與其它大分子特異性結合的能力，所以能與特異性抗體或核酸結合，其程序Sonthern Blot相似，故稱為Western Blot,第一抗體與膜上特異抗原結合後，再用標記的二抗(同位素或非同位素的酶)來檢測，此方法可檢測1ng抗原蛋白。
1、配液：
(1)轉移電泳緩沖液：20mmol/L Tris HCL pH8.0
150mmol/L 甘氨酸
加14.5g Tris粉 67.08g甘氨酸於4L水中，加入1200mL
甲醇，加水至6L
(2)麗春紅S溶液：0.5%麗春紅S
1%乙酸
2、操作步驟（如圖20-2）：

圖20-2 Western Blot裝置圖

(1)用已制備好的SDS-PAGE分離的蛋白凝膠。
(2)用一張濾紙，剪成與膠同樣大小，在轉移電泳緩沖液中預濕，放在Scotch-Brit Pad上，在膠的陰性端放上濾紙，膠的表面用該緩沖液浸濕，排出所有氣泡。
(3)在膠的陽極面放置同樣大小浸濕的硝酸纖維素膜，排出氣泡，再在濾膜的陽極端放置一張濾紙，排出氣泡，再放一個Scotch-Brit Pad。
(4)將以上「三明治」樣裝置放入一個塑料支撐物中間，將支撐物放入電轉移裝置中，加入電轉移緩沖液。
(5)接通電源：使膠上的蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，電壓為14V 4℃轉移4小時或過夜。
(6)將濾膜放入麗春紅S溶液中5分鍾，蛋白染色水中脫色2分鍾，照像，用印度墨水將分子量標准染色，在水中完全脫色。
(7)將濾膜放在塑料袋中，每3張加入5mL封閉緩沖液(1克速溶去脂奶粉溶於100ml PBS中)，封閉特異性抗體結合位點，室溫1h，搖動，倒出封閉緩沖液。
(8)在封閉緩沖液中稀釋第一抗體，加入後室溫放置1小時，將濾膜轉到塑料盒中，用200mL PBS洗四次，搖動。
(9)在封閉緩沖液中稀釋辣根過氧化物酶標記的二抗，重復步驟8。
(10)將濾膜放在100mL新配製的DAB底物溶液中，大約2～3分鍾就可顯色，用水沖洗終止反應、照像。
結果分析：分析陽性(顯色)條帶的分子量大小，而且根據信號(顏色)強弱分析蛋白表達量。

第三節 細胞的原位雜交技術

原位雜交(ISH)是一種可在細胞塗片、組織切片以及分裂中期染色體帶中檢測DNA或RNA的技術，此方法原理是由DNA或RNA的序列與互補的標記單鏈DNA/RNA探針結合形成標記的雙鏈雜交分子，本技術可對組織細胞原位的待測核酸分子進行定性，定量及定位分析。在細胞分化調節、基因定位、腫瘤遺傳學、分子病理學、病毒學等領域得到廣泛應用。經典的原位雜交技術包括載玻片處理，組織細胞的固定，探針的制備或選購，原位雜交，洗滌以及檢測，其中探針制備技術不屬於本章專業技術，故不作具體評敘，略交待制備使用原則。本章節主要介紹培養細胞的原位雜交技術。
一、探針的制備原則和選擇
探針為RNA或雙鏈、單鏈DNA，雙鏈探針較單鏈探針有很多缺點，探針必須變性、復性，降低了探針雜交效率，雙鏈探針在溶液中形成長的鏈狀結構傾向，限制了它的組織穿透能力。適用於基因組DNA雜交。由於原位雜交的探針將與高密度的細胞融合，因此，需要減短探針的長度或增加探針的濃度，但是過高濃度的探針往往會增加非特異性結合，因此每種探針應選擇適當的濃度。
探針的獲得常採用隨機引物延伸法的PCR合成和擴增，可獲大量的DNA探針，或利用帶有噬菌體強啟動子多克隆位點的質粒載體來合成RMA探針，也可利用質粒菌擴增質粒，經酶切後純化的基因片斷，均可以獲得制備探針原料。這些探針可以用同位素標記，也可以用非同位素標記，即光敏生物標記或地高辛配基標記於脫氧脲嘧啶三磷酸核苷(dUTP)上形成的地高辛-dUTP，可通過隨機引物或缺口平移法與探針的核酸分子相連，構成地高辛一配基標記的核酸探針。比探針可用抗地高辛抗體偶聯酶或熒光素通過松體結合和底物顯色或產生熒光來檢測。
這些探針基本均有市售，無需自行制備，只要根據說明書使用即可。
二、載玻片和蓋玻片預處理
為了防止探針的非特異貼附而保證細胞粘附而需處理：
1、用於檢測RNA的載玻片的處理
(1)用0.1mol/L HCL洗載玻片20分鍾，再用無水乙醇洗數次使其乾燥。
(2)在下列溶液中，65℃處理2小時
3×SSC 0.02%FicoLL400 0.02%聚乙稀吡咯烷酮(PVP)。
(3)固定在乙醇/乙酸(3:1 V/V)20分鍾，180℃烘烤2小時。
2、用於檢測DNA的載玻片的處理
以TESPA(three-amino-propyl-triethoxy-silane)塗載玻片。
3、對於蓋玻片：於0.1mol/L HCL中浸泡20分鍾，用無水乙醇洗，乾燥後用二甲基氯化硅硅化，180℃烤2小時。
三、組織細胞固定
理想的細胞固定過程應該保護細胞形態，同時確保目的基因DNA或RNA序列暴露。對於RNA-RNA原位雜交有效的固定劑是4%多聚甲醛和PLPD（磷酸緩沖液PBS、賴氨酸、過碘酸鹽及重酪酸鹽）。
1、塗片細胞原位雜交固定
(1)用含有0.02%EDTA的PBS洗滌細胞，於0.1%胰蛋白酶消化，收獲細胞計數，塗載玻片上。
(2)若檢測RNA，固定於4%多聚甲醛pH7.0，在4℃下放60分鍾，PBS洗5分鍾，系列乙醇脫水乾燥，-20℃保存。
(3)若檢測DNA，固定在4%多聚甲醛16～24小時，0.1mol/L Tris-HCL pH7.4洗2×5分鍾，浸泡在下述溶液中2×5分鍾：
0.25%(v/v)Tritonx-100；0.25%(v/v)Nonidet P40；0.1mol/L Tris-HCL pH7.4；再用0.1mol/L Tris-HCL pH7.4洗2×5分鍾。
(4)在100μg/ml蛋白酶K，50mmol/L Tris-HCL PH8.0，5mmol/L EDTA溶液中，37℃處理10分鍾，再用含有甘氨酸的0.1mol/L Tris-HCL PH7.4洗2×5分鍾。
(5)在20%(v/v)乙酸中40℃處理15分鍾，0.1mol/L Tris-HCL PH7.4洗2×5分鍾。
注意：對於DNA-DNA原位雜交多聚甲醛或福爾馬林均可，但對於地高辛檢測法必須用4%多聚甲醛，固定至少16小時，而且用蛋白酶K處理，這樣可明顯減少背景染色。
四、原位雜交
原位雜交與鹽濃度、溫度、甲醯胺濃度、pH等有關，DNA復性的溫度是16～32℃，DNA-RNA原位雜交，25℃最佳，RNA-DNA雜交，可用較高溫度，在pH5～9范圍內復性率基本上與pH無關。最好選用溫和的鹼性條件。甲醯胺有機溶劑可降低雙鏈核酸的穩定性，可避免雜交過程中處於過高的溫度，防止高溫破壞組織。
(一)同位素標記DNA探針的原位雜交
同位素標記的DNA探針，敏感性高，但要注意非特異結合，如35S標記探針在雜交前，用未經標記的dUTP預雜交，可減少非特異，可獲較好的細胞內定位，此外還常用3H或125I標記探針，但3H放射線弱，自顯影需100天曝光，不太理想，方法如下：
(1)取已形成單層的細胞的蓋玻片，懸浮細胞可採用離心法，將細胞粘附到塗有明膠的載玻片上。組織印片，冰凍切片等標本。
(2)將標本浸入甲醇固定5分鍾，再過3次4℃預冷的10%三氯醋酸。
(3)將細胞片標本浸入70%乙醇脫水，空氣乾燥，這時培養細胞蓋玻片應該用中性樹膠固定於載玻片上，注意細胞面向上。
(4)將細胞片放置在金屬盤內，並將托盤放入43℃水浴箱中預熱。
(5)直接向固定的細胞面滴加5mL含探針雜交液，然後用16mm蓋玻片覆蓋，其邊緣用橡膠液封閉。
(6)43℃恆溫水浴箱內培養18小時，此間保持箱內高濕度，防止因蓋玻片封閉不嚴導致雜交緩沖液乾涸。
(7)反應結束後，將玻片置於冰塊上，用鑷子小心剝下蓋玻片周邊的橡膠，將載玻片浸入垂直2×SSC溶液中，使蓋玻片脫落。
(8)將載玻片放入濕盒中，加2×SSC溶液浸沒玻片，加蓋玻片並用膠帶封閉濕盒。然後，將濕盒移入水浴箱中53℃處理30分鍾。
(9)在18℃用2×SSC洗玻片4次，每次5分鍾。
(10)玻片浸入70%乙醇脫水，空氣乾燥。
(11)將乾燥後的乾燥標本浸入新配製的核4乳膠液（核4乳膠液蒸餾水=1:1），垂直取出玻片，用濾紙擦去背面多餘膠，室溫乾燥5小時（在暗室中進行）。
(12)用黑紙包裹標本放在4℃冰箱曝光（3H標記的探針通常需2～4周，有時需長達100天，可造成高背景，而不理想）。
(13)按常規顯影、定影、水洗。
(14)對標本進行Giemsa或HE染色、脫水、封片。
結果分析：鏡下觀察，如需定量，可在鏡下計數銀顆粒或拍攝顯微照片，用圖象分析儀進行灰度分析。
(二)同位素標記RNA探針的原位雜交
RNA探針容易制備，合成率較高，成本低，易純化，可提高檢測敏感性。DNA-RNA、RNA-RNA雜交比DNA-DNA雜交穩定，能適應更多的條件。
(1)標本處理同前
(2)將RNA標記探針溶於雜交緩沖液中（5×107CPM/ml放射強度）。
50～70%去離子甲醯胺 2×SSC
0.5×Denhardt's液 1mmol/L EDTA pH7.0
200μg/mL變性魚精DNA 85℃ 5分鍾
(3)每張載玻片上滴加雜交液，使每張載玻片探針總量為2×105CPM，用一硅化的蓋玻片蓋住，封以不透性礦物油，在利於探針的溫度下（常為42℃）雜交7～18小時。
(4)用氯仿洗數次，去除礦物油，室溫下使蓋玻片在2×SSC液中滑落，再滴加50%～70%去離子甲醯胺，0.1×SSC液，雜交溫度下60分鍾，室溫2×SSC洗5分鍾，用50μg/mL RNaseA在2×SSC中消化去除單鏈RNA，再滴加50%～70%去離子甲醯胺，0.1×SSC,室溫15分鍾，室溫下用0.1×SSC洗5分鍾。
(5)將切片脫水，浸入由1%甘油稀釋的放射自顯影乳劑（1:1）中，放入暗盒中，在有硅膠乾燥劑存在下-70℃，存放5天（或者曝光於X光膠片24～48小時），隨後浸於液體乳劑。
(6)用HE染色。
(三)地高辛標記的DNA探針原位雜交
放射性同位素標記探針缺點是有放射損傷，易污染環境，需特殊防護和實驗條件，有半衰期受限、標記不穩定及曝光時間長。若改用生物素、乙醯氨基、熒光或地高辛標記可避免，其中以地高辛標記探針最敏感，隨機引物標記地高辛，其標記率很高，此探針用於原位雜交可獲高敏感性，好的細胞定位以及低背景。非同位標記探針還可以通過雙標記原位雜交法，同時測多條DNA序列。
(1)配液：①雜交緩沖液：2×SSC
5%（W/V）磷酸葡聚糖
50%去離子甲醯胺
②緩沖液I： 0.1mol/L Tris-HCL pH7.5
0.5mol/L Nacl
③緩沖液II： 0.1mol/L Tris-HCL pH9.5
0.1mol/L Nacl
5mmol/L MgCl2
(2)操作步驟：
①組織標本處理同前。
②將140ng/mL地高辛標記的探針加到雜交緩沖液中，每張滴加50μL雜交緩沖液，用蓋玻片蓋住，四周封以樹膠。
③將目的DNA和DNA探針放入90℃，進行變性10分鍾，雙鏈打開，42℃，在潮濕環境中雜交16小時。
④去除蓋玻片，按下列條件洗滌：
2×SSC室溫10分鍾→2×SSC室溫10分鍾→0.2×SSC室溫10分鍾→0.2×SSC 42℃ 20分鍾。
⑤再按以下方法處理：
1) 在緩沖液I中洗30分鍾。
2) 在含有20%羊血清的緩沖液I中洗30分鍾。
3) 滴加1:5000標有鹼性磷酸酶或辣根過氧化物酶的地高辛抗體，在裝有緩沖液I的濕盒中溫育20分鍾。
4) 在緩沖液I中洗2×20分鍾。
5) 在緩沖液II中洗60分鍾。
6) 加入下述溶液：緩沖液II
0.33mg/mL 四唑氮蘭
0.17mg/mL 5-bromo-4-Chlora-3-indoly' phosphate
7) 將切片浸於20mmol/L Tris-HCL pH7.5，5mmol/L EDTA終止反應。
⑥ 用底物顯色、復染、脫水、封片，按免疫組化常規法進行。
說明：
(1)用不同濃度和不同溫度的鹽溶液洗滌是為了去除探針與不完全同源序列雜交，減少非特異性顯色，其原則鹽濃度由高到低，溫度由低到高洗滌，洗滌過程中切勿使切片乾燥。
(2)應該有陽性和陰性對照，陽性對照：用該探針與已知含互補序列的組織細胞標本進行雜交。陰性對照：①應用RNA酶或DNA酶去除目的序列；②使用未標記探針；③不加核酸探針進行雜交（空白對照）；④用不含探針DNA的無關質粒DNA替代探針進行雜交；⑤同義RNA（Sense probe）進行雜交。