『壹』 生物分離高手進
這寫起來復雜了....... 很多地方都有這樣的實驗步驟啊，我看了一下 下面這個，還可以
酶的分離簡單，就是麻煩，時間挺長的
酶的分離純化方法簡介
生物細胞產生的酶有兩類：一類由細胞內產生後分泌到細胞外進行作用的酶，稱為細胞外酶。這類酶大都是水解酶，如酶法生產葡萄糖所用的兩種澱粉酶，就是由枯草桿菌和根酶發酵過程中分泌的。這類酶一般含量較高，容易得到；另一類酶在細胞內產生後並不分泌到細胞外，而在細胞內起催化作用，稱為細胞內酶，如檸檬酸、肌苷酸、味精的發酵生產所進行的一系列化學反應，就是在多種酶催化下在細胞內進行的，在類酶在細胞內往往與細胞結構結合，有一定的分布區域，催化的反應具有一定的順序性，使許多反應能有條不紊地進行。
酶的來源多為生物細胞。生物細胞內產生的總的酶量雖然是很高的，但每一種酶的含量卻很低，如胰臟中期消化作用的水解酶種類很多，但各種酶的含量卻差別很大。
因此，在提取某一種酶時，首先應當根據需要，選擇含此酶最豐富的材料，如胰臟是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、澱粉酶和脂酶的好材料。由於從動物內臟或植物果實中提取酶制劑受到原料的限制，如不能綜合利用，成本又很大。目前工業上大多採用培養微生物的方法來獲得大量的酶制劑。從微生物中來生產酶制劑的優點有很多，既不受氣候地理條件限制，而且動植物體內酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，產酶量又豐富，還可以通過選育菌種來提高產量，用廉價原料可以大量生產。
由於在生物組織中，除了我們所需要的某一種酶之外，往往還有許多其它酶和一般蛋白質以及其他雜質，因此為製取某酶制劑時，必須經過分純化的手續。
酶是具有催化活性的蛋白質，蛋白質很容易變性，所以在酶的提純過程中應避免用強酸強鹼，保持在較低的溫度下操作。在提純的過程中通過測定酶的催化活性可以比較容易跟蹤酶在分離提純過程中的去向。酶的催化活性又可以作為選擇分離純化方法和操作條件的指標，在整個酶的分離純化過程中的每一步驟，始終要測定酶的總活力和比活力，這樣才能知道經過某一步驟回收到多少酶，純度提高了多少，從而決定著一步驟的取捨。
酶的分離純化一般包括三個基本步驟：即抽提、純化、結晶或制劑。首先將所需的酶從原料中引入溶液，此時不可避免地夾帶著一些雜質，然後再將此酶從溶液中選擇性地分離出來，或者從此溶液中選擇性地除去雜質，然後製成純化的酶制劑。下面就酶的分離純化的常用方法作一綜合介紹：
一、預處理及固液分離技術
1.細胞破碎（cell disruption）
高壓均質器法：此法可用於破碎酵母菌、大腸菌、假單胞菌、桿菌甚至黑麴黴菌。將細胞懸浮液在高壓下通入一個孔徑可調的排放孔中，菌體從高壓環境轉到低壓環境，細胞就容易破碎。菌懸液一次通過均質器的細胞破碎率在12%-67%。細胞破碎率與細胞的種類有關。要達到90%以上的細胞破碎率，起碼要將菌懸液通過均質器兩次。最好是提高操作壓力，減少操作次數。但有人報道，當操作壓力達到175Mpa時，破碎率可達100%。當壓力超過70Mpa時，細胞破碎率上升較為緩慢。高壓均質器的閥門是影響細胞破碎率的重要因素。絲狀菌會堵塞均質器的閥門，尤其高濃度菌體時更是如此。在豐富培養基上比在合成培養基上生長的大腸菌更難破碎。
容菌酶處理法：蛋清中含有豐富的溶菌酶，價格便宜，常用來裂解細胞。具體做法是：溶壁微球菌(micrococcus lysodeikticus)43kg，置於0.5%的氯化鈉溶液中，使細胞濃度為5%（乾重），在35℃用0.68kg（乾重）的蛋清處理20min，得到的細胞碎片用相同體積的乙醇處理，用離心機將細胞碎片和胞內蛋白質除去，再將乙醇濃度提高到75%（體積分數），可以得到純度為5%的過氧化氫酶1500g。
2.離心
離心分離過程可分為離心過濾、離心沉澱、離心分離3種類型，所使用的設備有過濾式離心機、沉降式離心機和離心機。過濾式離心機的轉鼓壁上開有小孔，壁上有過濾介質，一般可用於處理懸浮固體顆粒較大、固體含量較高的場合。沉降式離心機用於分離固體濃度較低的固液分離，如發酵液中的菌體，用鹽析法或有機溶劑處理過的蛋白質等。分離機用於分離兩種互不相溶的、密度有微小差別的乳濁液或含微量固體微粒的乳濁液。
在生物領域採用的離心機系統，除了應具備離心機的一般要求外，還應滿足生物生產的技術要求，這包括滅菌、冷卻、密封，以保證產品不受污染並不污染環境。現代哦離心機裝置包括以下三個步驟，並進行程序控制：離心、離心系統的滅菌及就地清洗。如阿法-拉伐公司離心機產品的裝置，具有雙重軸向密封，密封由裝在轉筒主軸上下的碳化硅動環和固定環組成，密封由水連續冷卻和潤滑，可防止產品被污染，也可防止生產過程中排出的廢物對環境的污染。該離心機又如一個密閉的壓力容器，可在121℃溫度下進行蒸汽滅菌，該離心設備設有環繞離心機轉筒的冷卻夾套，對懸浮液和濃縮的固體都能進行充分的冷卻，並能有效地控制溫度，這對於生物製品是非常重要的。如BTPX205型離心機可用於細胞收集、培養液的凈化和細胞碎片的分離，可用於疫苗、酶制劑等的提取。該機的其他輔助系統及控制系統也較為完善，如設有壓力指示器、力量計、溫度感測器和液面感測器。
3.膜分離技術
在蛋白質純化過程中主要用到的膜分離技術多為超濾。在靜壓作用下降溶液通過孔徑非常小的濾膜，使溶液中分子量較小的溶質透過薄膜，而大分子被截留於膜表面。大多數超濾膜是由一層非常薄的功能膜與較厚的支撐膜結合在一起而組成的。功能膜決定了膜的孔徑，而支撐膜提供機械強度以抵抗靜壓力。超濾濃縮的優點是：操作條件溫和，無相變化，對生物活性物質沒有破壞。
超濾系統主要由料液貯罐、泵、超濾器、透過液收集罐組成，料液經泵打入超濾器，水及低分子量物質排出超濾器外，被濃縮的料液在料液貯罐、泵、及超濾器中循環。當料液濃縮至一定的倍數後即可作為進一步處理的濃縮料液。
超濾應用於蛋白質類物質的濃縮和脫鹽過程中時應注意以下問題：第一，在超濾循環過程中，由於泵和葉輪與料液的摩擦放熱作用，料液的溫度會逐漸升高，會造成蛋白質分子的損失。因此，料液貯罐應加冷卻系統，並安裝自動測溫及控制系統。第二，某些酶的輔助因子散失為問題：一些酶含有輔助因子，其分子量小，超濾時易從透過液中排除掉，因而在超濾前或超濾後要添加一定濃度的的輔助因子。
還可將超濾與親和層析相結合以提高分離純度。其工作原理是：當溶液中欲被分離的蛋白質不受阻礙地通過超濾膜的孔隙時，如果在膜的一側結合著親和配基，該蛋白質就會與配基結合因而結聚在膜的這一側。不與配基結合的其他物質就將穿過孔而被帶走。再用適宜的洗脫劑將該蛋白質洗脫下來，洗脫液用於進一步的分離純化。
4.泡沫分離
原理：將氣體通入含多種組分的溶液中，由於這些組分的表面活性由差異，因此在溶液的表面，某些組分將形成泡沫，泡沫的穩定性取決於操作條件及溶液的生物學特性。泡沫中含有更多的表面活性成分，故泡沫的組分種類及其含量與溶液中的不相同。這樣，溶液中的組分舅得以分離。
蛋白質較易吸附與氣液界面，這有利於其結構的穩定。泡沫分離過程是：蛋白質從主體溶液中擴散到氣液界面，該過程可能是可逆的也可能是不可逆的；分子發生重排，一般認為在空氣-水界面會形成兩種類型的膜，一種是稀膜，另一種是濃膜，可能會發生由多個分子聚集在一起的現象。在氣液界面形成的蛋白質膜可以是單層的也可以是多層的。膜的類型取決於主體溶液及氣液界面上蛋白質的特性、結構和濃度。
泡沫分離的目的，一方面提高酶蛋白的富集率（泡沫中蛋白質的濃度/最初溶液中蛋白質濃度），另一方面提高酶蛋白的提取率（泡沫中蛋白質的提取率/最初的蛋白質質量），或使多組分混合物中某一組分的分配系數最大。
二、抽提
沉澱
1. 鹽析
常用的鹽析劑是硫酸銨，其溶解度大、價格便宜。硫酸銨沉澱蛋白質的能力很強，其飽和溶液能使大多數的蛋白質沉澱下來。對酶沒有破壞作用。
pH的控制：應從酶的溶解度與穩定性兩個方面考慮，在酶等電點時其溶解度最小易沉澱，但有些酶再等電點時穩定性較差，因此要選擇最佳pH值.一般要求在酶最穩定的pH值的前提下再考慮最適宜酶沉澱的pH值。在操作中一旦確定最佳pH值後，在添加硫酸銨之前甲酸或鹼調節好酶液的pH值，要盡量避免溶液pH值的波動以免破壞酶的穩定性。在添加硫酸銨時要注意攪拌，並注意硫酸銨的加入速度，一般是由少到多，緩慢加入，硫酸銨盡可能磨成細粉。
溫度的控制：有些酶在較高溫度下穩定性能較好，可在常溫下進行鹽析操作，而對於大多數酶，盡可能在低溫下操作。
酶液的凈置：加完硫酸銨後，酶液要靜置一段時間，使酶蛋白完全沉澱下來，酶靜置後，就不要再加以攪拌。
2．有機溶劑沉澱
有機溶劑選擇：可用於酶蛋白沉澱的有機溶劑包括醇類物質等，如甲醇、乙醇、異丙醇。乙醇的親水性能較好，可防止蛋白質的變性，酶蛋白在其中的溶解度也較低。
有機溶劑沉澱操作：有機溶劑一般都使蛋白質變性，當溫度較高時變性蛋白質分子就會變成永久失活。因此用有機溶劑處理時最好在0℃以下進行。用有機溶劑沉澱得到的酶蛋白不要放置過久，要盡快加水溶解。
3.聚合物絮凝劑沉澱
聚合物絮凝劑，如葡聚糖和聚乙二醇，與酶分子爭奪水分子，具有脫水作用使酶沉澱。聚乙二醇作為一種沉澱劑的優點是在水溶液中，其濃度可達到50%，濃度為6%-12%的蛋白質大都可以沉澱下來。這種試劑不需要低溫操作，而且對蛋白質的穩定還有一定的保護作用。聚乙二醇不會被吸附，故在離子交換吸附前不必去除。
4．用金屬離子和絡合物沉澱
酶和其他蛋白質都會形成金屬鹽，其溶解度較低。用金屬離子沉澱的缺點是酶與金屬離子相互作用後，可逆變化較差，尤其是用巰基衍生物，它結合的]金屬離子會催化酶變性而失活。
5．用特殊試劑沉澱法
用鏈黴素可選擇性去除核酸，從而使胞內酶沉澱出來。鏈黴素鹽（濃度為0.5-1.0mg/mg蛋白質）對於選擇性沉澱核酸的效果比錳離子還要好，酶不易失活。
6．親和沉澱
將親和反應的高度選擇性、低處理量特性與沉澱操作的大處理量、地選擇性有機結合形成了親和沉澱技術。將配基與可溶性載體偶聯後形成載體-配基復合物，該復合物與生物分子結合後在一定條件下可以沉澱出來。
配基-載體復合物可以選擇性地與蛋白質結合，溶液中的pH值、離子強度及蛋白質濃度等條件對親和結合的影響力並不大，只有競爭性的配基會降低產物與原配基的親和結合力，甚至使親和結合發生逆轉。
引導產生沉澱的方法有：離子交聯；加入帶相反電荷的聚合物；加入帶相反電荷的疏水基團；改變pH值，誘導產生疏水沉澱；溫度誘導產生沉澱。
親和結合：將親和配基加入到含有目的物蛋白質的溶液中，調節好有關沉澱的條件，使之有利於親和結合。
洗滌：為經過處理的粗製液中發生親和沉澱可能會發生非特異性結合，尤其是使用帶電的聚合物，離子交換的效應將使其他蛋白質共同沉澱，因此在分離目的物之前要洗滌沉澱物。其做法是：加入適當的清洗劑重新溶解沉澱，再沉澱；或在專一性洗脫之前，徹底清洗沉澱。在上述過程中要始終保持目的蛋白質與配基處於親和結合狀態。
配基-載體復合物與目的蛋白質的分離：分離結束之後，要確保回收目的蛋白質和配基-載體復合物，目的蛋白質要達到一定的純度，回收率要高。
『貳』 常用的蛋白質分離純化方法有哪幾種各自的作用原理是什麼
常用的蛋白質純化方法有離子交換色譜、親和色譜、電泳、疏水色譜等等
離子交換色譜：蛋白質和氨基酸一樣會兩性解離，所帶電荷決定於溶液pH。pH小於pI時蛋白質帶正電，pH大於pI時蛋白質帶負電。不同蛋白質等電點的蛋白質在同一個溶液中，表面電荷情況不同。離子交換就是利用不同蛋白質在同一溶液中表面電荷的差異來實現分離的。
親和色譜：生物大分子有一個特性，某些分子或基因對它們有特異性很強的吸附作用。如鎳柱中Ni可以與His標簽的蛋白結合，這種只針對一種或一類物質的吸附就是親和色譜的原理。
電泳：SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳，SDS能斷裂分子內和分子間氫鍵，破壞蛋白質的二級和三級結構，強還原劑能使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂，蛋白質在一定濃度的含有強還原劑的SDS溶液中， 與SDS分子按比例結合，形成帶負電荷的SDS-蛋白質復合物，這種復合物由於結合大量的SDS，使蛋白質喪失了原有的電荷狀態形成僅保持原有分子大小為特徵的負離子團塊，從而降低或消除了各種蛋白質分子之間天然的電荷差異，由於SDS與蛋白質的結合是按重量成比例的，因此在進行電泳時，蛋白質分子的遷移速度取決於分子大小。
疏水色譜：疏水色譜基於蛋白質表面的疏水區與介質疏水配體間的相互作用，在高濃度鹽作用下，蛋白質的疏水區表面上有序排列的水分子通過鹽離子的破壞被釋放，裸露的疏水區與疏水配體相互作用而被吸附。疏水色譜就是利用樣品中各組分在色譜填料上配基相互作用的差異，在洗脫時各組分移動速度不同而達到分離的目的。隨著鹽離子濃度的降低，疏水作用降低，蛋白質的水化層又形成，蛋白質被解吸附。
『叄』 超濾膜是什麼
你好，下面是有關超濾膜的介紹，希望對你有用
順祝您學習進步，望採納謝謝
超濾膜科技名詞定義中文名稱：超濾膜英文名稱：ultrafiltrationmembrane;hyperfiltrationmembrane定義：膜狀的超濾材料。應用學科：生物化學與分子生物學（一級學科）；方法與技術（二級學科）以上內容由全國科學技術名詞審定委員會審定公布求助編輯網路名片超濾膜，是一種孔徑規格一致，額定孔徑范圍為0.001-0.02微米的微孔過濾膜。在膜的一側施以適當壓力，就能篩出小於孔徑的溶質分子，以分離分子量大於500道爾頓、粒徑大於2～20納米的顆粒。超濾膜是最早開發的高分子分離膜之一，在60年代超濾裝置就實現了工業化。
目錄
簡介超濾膜的工業應用十分廣泛，已成為新型化工單元操作之一。用於分離、濃縮、純化生物製品、醫葯製品以及食品工業中；還用於血液處理、廢水處理和超純水制備中的終端處理裝置。在我國已成功地利用超濾膜進行了中草葯的濃縮提純。超濾膜隨著技術的進步，其篩選功能必將得到改進和加強，對人類社會的貢獻也將越來越大。
『肆』 【求助】超濾離心是怎麼回事
超濾離心機是使用帶超濾膜的離心管，這個膜有分子量的區別，可以截留大於回膜孔徑的答分子，一般的離心機就可以了，還要選好你的離心管體積，這樣才能和你離心機配套使用 情非所屬(站內聯系TA)一般一百左右一根，特殊的可能更貴，有50ml，10ml，一般的離心機都可以，只要管子能套上，同一種物質在膜完好不堵塞的情況下可以重復下，但是不能太多次數，兩三次就好了！
『伍』 超濾離心管怎麼使用
蛋白濃縮和換Buffer通常使用的超濾管，常用Millipore的Amicon-Ultra-15超濾管（MWCO10kD）。也有其它型號的、不同體積大小和超濾管可選，視目的蛋白的分子量與濃縮前體積、濃縮目標體積而定。可重復使用。
1、選擇合適的超濾管，主要考慮MWCO和濃縮體積，通常應截留分子量不應大於目的蛋白分子量的1/3，比如目的蛋白分子量為35kDa，就可以選擇10kDa截留分子量的超濾管。若目的蛋白分子量為10kD左右，則可以用截留分子量3kD的超濾管。
2、新買來的超濾是乾燥的，使用前加入MilliQ水，水量完全過膜，冰浴或冰箱里預冷幾分鍾。然後將水倒出，即可加入蛋白液，加入的多少，以不超過管頂的白線為准。操作要輕，加入蛋白液前，超濾管需要插在冰上預冷。
3、平衡。質量和重心二者都要達到平衡。注意轉速和加速度不可太快，否則直接損壞超濾膜。開始離心超濾（離心機預冷至4度）。膜與轉軸的方向根據說明書調整（角轉離心機的情況是膜與軸垂直）。在實際使用中，一般轉速開的比說明書里的要低，這樣可以延長離心管的使用壽命。
4、當濃縮到剩下1ml時，【取50ul國產Bradford溶液，加入10ul流穿，看有沒變藍色，以此判斷超濾管是否漏掉蛋白。如果管漏了，將上層和流穿重新倒入新管中開始超濾。要精確判斷是否漏管，用5mg/ml的BSA離心10min，再取流穿，跑蛋白膠或Bradford粗測】，繼續加入剩下的蛋白液濃縮（在冰上操作，防止蛋白受熱），直到所有濃縮液都加完為止。離心過程中注意是否發生蛋白沉澱，導致堵管。若發生沉澱，要確定沉澱的具體原因，是蛋白濃度過高還是Buffer不合適；前者可用多根超濾管同時超濾，降低濃度的辦法解決，後者的方法是換不同的Buffer，直到蛋白不發生沉澱為止。
5、前面幾步用以濃縮蛋白，如果要換Buffer，在總蛋白液濃縮至1ml左右的時候，輕輕加入新的Buffer（經0.22um超濾膜超濾），再濃縮至1ml左右，連續三次，最後一次的濃縮終體積根據需要的蛋白濃度而定，一般不多於500ul，也有濃縮至200ul以內的情況。按照每次至少10倍左右的體積濃縮算，三次達到1000倍以上，基本上可以達到換buffer的目的。
6、取出最終蛋白濃縮液的操作在冰上操作，用黃槍頭（200ul）取，輕輕順著邊緣插入槍頭，輕輕吹打、混勻蛋白液，注意不要碰到超濾膜，然後吸取濃縮液，每次吸接近200ul，直到吸完。管底剩下的最後一點濃縮液不必吸取，否則難度太大，有可能損壞超濾膜。最後加入MilliQ水到超濾管中，沒過超濾膜，防止膜失水變干。
7、以下是處理超濾管，重復利用超濾管的步驟。
8、倒出超濾管里的水，用milliQ水輕輕潤洗幾次，【若管底有可見的蛋白沉澱，可以先加入水，然後用槍頭吹打，注意不要碰到膜，吹打至沉澱懸起，然後倒掉，不可用自來水猛沖】然後加入0.2M的NaOH溶液，室溫放置20min，期間平衡超濾管。再離心10min。倒出殘留的NaOH溶液，將管芯浸入MilliQ水的燒杯(1或2L)中,放置幾個小時,再換新的水,放置幾個小時，不斷稀釋NaOH濃度。50ml管和蓋子用自來水洗，內壁再用MilliQ水洗干凈。
9、取出浸沒的管芯，加至接近滿的MilliQ水，50ml管也加滿MilliQ水，將管芯慢慢放入50ml
離心管，排出部分水，然後蓋上蓋子，放4度保存，直到下次使用。一般來說，按照上述步驟和注意事項，每根管用三四年不會壞。
『陸』 常用的蛋白質分離純化方法有哪幾種各自的作用原理是什麼
分離蛋白質混合物的各種方法主要是根據蛋白質在溶液中的以下性質：1）分子大小；2）溶解度；3）電荷；4）吸附性質；5）對其它分子的生物學親和力等進行分離。
常見的分離提純蛋白質的方法有：
1、鹽析與有機溶劑沉澱：在蛋白質溶液中加入大量中性鹽，以破壞蛋白質的膠體性質，使蛋白質從溶液中沉澱析出，稱為鹽析。常用的中性鹽有：硫酸銨、氯化鈉、硫酸鈉等。鹽析時，溶液的pH在蛋白質的等電點處效果最好。凡能與水以任意比例混合的有機溶劑，如乙醇、甲醇、丙酮等，均可引起蛋白質沉澱。2、電泳法：蛋白質分子在高於或低於其pI的溶液中帶凈的負或正電荷，因此在電場中可以移動。電泳遷移率的大小主要取決於蛋白質分子所帶電荷量以及分子大小。3、透析法：利用透析袋膜的超濾性質，可將大分子物質與小分子物質分離開。4、層析法：利用混合物中各組分理化性質的差異，在相互接觸的兩相（固定相與流動相）之間的分布不同而進行分離。主要有離子交換層析，凝膠層析，吸附層析及親和層析等，其中凝膠層析可用於測定蛋白質的分子量。5、分子篩：又稱凝膠過濾法，蛋白質溶液加於柱之頂部，任其往下滲漏，小分子蛋白質進入孔內，因而在柱中滯留時間較長，大分子蛋白質不能進入孔內而徑直流出，因此不同大小的蛋白質得以分離。6、超速離心：利用物質密度的不同，經超速離心後，分布於不同的液層而分離。超速離心也可用來測定蛋白質的分子量，蛋白質的分子量與其沉降系數S成正比。
『柒』 離心分離技術與膜分離技術是一回事嗎
一）微濾
鑒於微孔濾膜的分離特徵，微孔濾膜的應用范圍主要是從氣相和液相中截留微粒、細菌以及其他污染物，以達到凈化、分離、濃縮的目的。
（二）超濾
超濾技術是一種廣泛用於水的凈化，溶液分離、濃縮，以及從廢水中提取有用物質，廢水凈化再利用領域的高新技術。
（三）納濾
納濾的主要應用領域涉及：食品工業、植物深加工、飲料工業、農產品深加工、生物醫葯、生物發酵、精細化工、環保工業。
（四）反滲透
由於反滲透分離技術的先進、高效和節能的特點，在國民經濟各個部門都得到了廣泛的應用，主要應用於水處理和熱敏感性物質的濃縮，主要應用領域包括以下：食品工業、牛奶工業、飲料工業、植物（農產品）深加工、生物醫葯、海水、苦鹹水淡化、電力、電子、醫葯行業工藝用水、無菌無熱源純水、食品飲料工業、化工及其它工業的工藝用水等領域 （五）其他常用膜分離過程
除了以上四種常用的膜分離過程，另外還有滲析、控制釋放、膜感測器、膜法氣體分離等。
『捌』 離心管怎樣用來沉澱的辨認
可以將沉澱後逐層分離出的液體導出離心管，然後利用試管等可以測量體積的器具測量，不過一般都是直接讀離心管的刻度。
『玖』 0.5ml超濾離心管的原理是什麼
0.5ml超濾離心管的原理是根據標稱分子量限值的不同，典型處理時間為10到30分鍾。根據相關信息查詢顯示，超濾膜的垂直設計也最大程度降低了溶質極化造成的濾膜結垢，死體積設計能有效防止過度離心使樣本幹掉而造成樣本損失。
『拾』 如何進行超濾膜離心純化蛋白
直接使用超濾的中空纖維膜即可，無需離心。