包涵體變性後不和樹脂結合

① 包涵體染色的方法有哪些原理是什麼

包涵體染色的方法有哪些？原理是什麼
包涵體染色的方法有哪些？原理是什麼
包涵體染色的方法有哪些？原理是什麼

蛋白包涵體-溶解原理及方法2009年03月15日；維持包涵體內蛋白質結構的作用力是分子內的作用力，；1.遵循標准；包涵體蛋白質的溶解同樣是一個工藝的關鍵的步驟；(1)快速溶解的動力學；；(2)與蛋白質的結合是可逆的；；(3)對細胞碎片的分離方法沒有干擾作用；；(4)對溫度沒有依賴作用；；(5)抑制蛋白質酶的降解作用；；(6)與蛋白質的氨基沒有化學修飾作用；；

維持包涵體內蛋白質結構的作用力是分子內的作用力，這種作用力也維持天然蛋白質的穩定性的結構。先前有報道這種作用力是共價鍵結合的，但是，現在趨向於一致，就是維持包涵體內部的蛋白質的緊密的結構的是非共價鍵的作用力。二硫鍵，無論是正確的還是錯誤的二硫鍵，在維持內部蛋白質的緊密的結構中都沒有發揮直接的作用。最經常的獲得活性蛋白質的第一步是溶解這些包涵體蛋白質，溶解液是使這些包涵體蛋白質完全變性的成分，當蛋白質被溶解以後，則進入到蛋白質的體外折疊的過程。

1. 遵循標准

包涵體蛋白質的溶解同樣是一個工藝的關鍵的步驟。溶劑的選擇會影響後續的操作、最終的各種蛋白質的收率以及最終的成本，必須遵循以下的標准：

(1) 快速溶解的動力學；

(2) 與蛋白質的結合是可逆的；

(3) 對細胞碎片的分離方法沒有干擾作用；

(4) 對溫度沒有依賴作用；

(5) 抑制蛋白質酶的降解作用；

(6) 與蛋白質的氨基沒有化學修飾作用；

(7) 在可能的情況下，選擇最低的溶解濃度和廉價的溶劑，並適於以後的復性方法。

2. 溶解包涵體的試劑

最經常使用溶解包涵體的試劑包括離液劑或者去垢劑。

最經常使用的溶解和制備蛋白質的離子型的離液劑最早於1969年Hatefi等人發展的離子型的去垢劑如SDS是另外一種溶解包涵體蛋白質和膜蛋白質的試劑，但是一般不用來大規模的生產，而是用來定性。除了強酸、強鹼和利用有機溶劑來提取疏水性很強的蛋白質以外，其他的變性方法如非可逆的共價修飾在工業的大規模生產中很少用到。一旦蛋白質被溶解，蛋白質中的巰基很容易快速地氧化並形成共價的聚集體或者分子內錯配的二硫鍵，然後這些蛋白質就不能再進行折疊。為了防止氧化，可以使這些基團或者利用緩沖液中含有低分子量的疏基試劑保持在還原的狀態或形成磺酸鹽或者形成混合的二硫鍵。

（1）去垢劑

去垢劑是一種最經濟的溶解包涵體蛋白質的方法，一個最大的優點是溶解的蛋白質有可能保持全部的生物活性，說明在此條件下保持了蛋白質的四級結構。最重要的是稀釋以後蛋白質的聚集比其它溶劑生成的很
少。陽離子型、陰離子型的和非離子型的去垢劑都可以使用，使用時的濃度一般高於去垢劑的臨界膠束濃度（CMC ），通常是0.5-5%。

SDS僅僅在大量生產牛生長激素、干擾素和白介素-2中用到。SDS由於具有較低的臨界膠束濃度（CMC）而使得結合到蛋白質分子上的SDS比較難於除去。由於N-十二烷肌氨酸它的CMC比SDS高0.4%，也被用來溶解包涵體蛋白質並可用稀釋的方法使蛋白質復性，殘余的去垢劑可以使用陰離子交換色譜或者超濾的方法除去。這種去垢劑是一種比較溫和的去垢劑，可以選擇性地溶解一些包涵體，但是不能溶解完全的變性的蛋白質的聚集體和大腸桿菌的內膜的蛋白質分子。使用去垢劑一個主要的缺點是對以後的純化和復性的步驟的干擾，去垢劑結合到蛋白質上的強度大離子交換色譜復性蛋白質小不同，比較難於除去，並干擾離子交換和疏水相互作用色譜的過程，在變性的濃度時超濾膜會吸附這些變性劑。所以復性後需要盡量洗滌這些去垢劑，也可以使用環狀糊精鏈狀糊精或者環狀澱粉從復性緩沖液中提取去垢劑。

一個不容忽視的問題是去垢劑可以溶解全部的膜蛋白質中的蛋白質酶，這些蛋白質酶的活性在去垢劑的存在的情況下被活化，可能造成溶解和復性過程的收率的降低。蛋白質復性的收率可以通過以下的方法來提高： a) 先期使用可以溶解膜蛋白質但是不溶解包涵體蛋白質的溶劑盡量洗滌包涵體蛋白質；

b) 包涵體的含有的菌體碎片被完全除去；

c) 溶解包涵體的液體中含有蛋白質酶的抑制劑，如EDTA，苯甲基磺醯氟（PMSF ）等 。

（2）離液劑

其它的離液劑也被用來溶解包涵體蛋白質，最主要的溶解包涵體蛋白質的離液劑是鹽酸胍和尿素，這是最經常使用的溶解試劑，一般情況下選擇6-8mo1/L的濃度，蛋白質濃度在1-10mg/mL。

在溶解色氨酸合成酶A的過程，發現陽離子的溶解能力順序是Gdm+ > Li+ > K+ > Na+，陰離子的順序是SCN- > I- > Br- >Cr-。一些離液劑由於它們的溶液比鹽酸胍和尿素有更高的密度和黏度而不適合用於溶解包涵體，因為利用離心和色譜分離起來比較困難。

為了溶解包涵體蛋白質需要的尿素或者鹽酸胍的濃度根據蛋白質的不同而不同。如果蛋白質天然形態需要溶解的變性劑的濃度不能獲得，則在溶解包涵體時需要首先確定離液劑的濃度。

鹽酸胍由於比較貴，所以一般用來溶解一些附加值比較高的葯物蛋白質分子，選擇鹽酸胍作為溶解試劑，是因為鹽酸胍是一種比脲更為強烈的變性劑，甚至可以溶解脲所不能溶解的包涵體；尿素，由於可能被自發的形成的氰酸鹽或者已有的氰酸鹽的污染，特別是在鹼性環境中，從而造成蛋白質的自由的氨基被不可逆的修飾。消除此種影響的方法是用陰離子的緩沖系統如Tris-HCl溶解脲或者脲在使用之前利用陰離子交換色譜純化，並且配製的溶解和復性的緩沖液在當天使用。脲溶液中影響蛋白質變性的因素與鹽酸胍的不同。溶在脲中的蛋白質受到pH和離子強度的影響，從而影響電荷的蛋白質殘基之間的電荷作用，但是由於鹽酸胍含有高濃度的離子強度，所以這兩個因素的影響很少。

（3）混合溶劑

一般情況下去垢劑並不聯合使用，Lilly等人發現去垢劑和尿素的混合液有效的摩爾濃度較低。尿素和去垢
劑型的鹽混合可以使蛋白質變性，但是尿素和非去垢劑的鹽如氯化鈉反而降低包涵體蛋白質的溶解性，所以要避免使用。

去垢劑結合其他的試劑或者溶解增強劑也被使用，發現尿素和乙酸，尿素和二甲亞楓，尿素和高pH等是比較有效的溶解包涵體蛋白質的方法。

高壓（1-2kbar）、超聲也可以溶解包涵體蛋白質，此時使用的溶解試劑濃度可以比較低，便於後續的復性步驟。

3. 極端pH

酸鹼度也是比較廉價的有效的溶解包涵體的方法。最經常使用酸的是有機酸，濃度在5-80%之間。Gavif和Better使用低的（pH≤2.6）和高溫（85℃ ）溶解抗真菌的重組蛋白質的膚段，低溫和高PH需要溶解時間要長。Reddy和合作者也使用20%乙酸溶解一種麥芽糖結合的蛋白質。但是，同樣的一些不可逆的修飾作用或者酸降解會在極端pH下發生，所以此種方法並不是經常使用的溶解包涵體的方法。

高pH（≥12）也被用來溶解生長激素和原胰島素。在高pH下一些蛋白質同樣可能發生非可逆的變性，原因在於半胱氨酸在鹼性條件下的脫硫過程。所以這種方法盡管比較簡單、廉價，同樣僅僅用於一些特定的蛋白質，特別對於葯用蛋白質一般不採用這種方法。

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摘要 基因重組蛋白在大腸桿菌中表達時，由於表達量高，往往形成無生物活性的包涵體。包涵體必須經過變性和復性的過程才能獲得有活性的重組蛋白。如何提高基因重組蛋白質的復性率，是生物工程技術的一個研究熱點。對近年來的重組蛋白質的復性方法做一評述，為研究蛋白質折疊以及復性技術的進一步應用提供依據。
關鍵詞 重組蛋白 包涵體 復性 二硫鍵
到目前為止，人們表達的重組蛋白質已有4000多種，其中用E.coli表達的蛋白質要佔90%以上，盡管基因重組技術為大規模生產目標蛋白質提供了嶄新的途徑，然而人們在分離純化時卻遇到了意想不到的困難，即這些蛋白質在E.coli中絕大多數是以包涵體形式存在，重組蛋白不僅不能分泌到細胞外，反而在細胞內聚集成沒有生物活性的直徑約0.1~3.0μm的固體顆粒[1]。自從應用大腸桿菌體系表達基因工程產品以來，人們就一直期望得到高活性、高產量的重組蛋白。不可溶、無生物活性的包涵體必須經過變性、復性才能獲得天然結構以及生物活性，因此應該選擇一個合適的復性過程來實現蛋白質的正確折疊，獲得生物活性，近年來的研究可以使復雜的疏水蛋白、多結構域蛋白、寡聚蛋白、含二硫鍵蛋白在體外成功復性。
包涵體形成的原因

重組蛋白在宿主系統中高水平表達時，無論是原核表達體系或真核表達體系甚至高等真核表達體系，都會形成包涵體[2]。主要因為在重組蛋白的表達過程中，缺乏某些蛋白質折疊過程中需要的酶和輔助因子，或環境不適，無法形成正確的次級鍵等原因形成的[3]。

1、 表達量過高，研究發現在低表達時很少形成包涵體，表達量越高越容易形成包涵體。原因可能是合成速度太快，以至於沒有足夠的時間進行折疊，二硫鍵不能正確配對，過多的蛋白間的非特異性結合，蛋白質無法達到足夠的溶解度等。

2、 重組蛋白的氨基酸組成，一般說來含硫氨基酸越多越容易形成包涵體。

3、 重組蛋白所處的環境：發酵溫度高或胞內pH接近蛋白的等電點時容易形成包涵體。

4、 重組蛋白是大腸桿菌的異源蛋白，由於缺少真核生物中翻譯後修飾所需酶類，致使中間體大量積累，容易形成包涵體沉澱。

5、 有報道認為，豐富的培養基有利於活性蛋白質的表達，當培養條件不佳時，容易形成包涵體。
減少包涵體形成的策略

1、 降低重組菌的生長溫度，降低培養溫度是減少包涵體形成的最常用的方法，較低的生長溫度降低了無活性聚集體形成的速率和疏水相互作用，從而可減少包涵體的形成[4]。

2、 添加可促進重組蛋白質可溶性表達的生長添加劑，培養E.coli時添加高濃度的多醇類、蔗糖或非代謝糖可以阻止分泌到周質的蛋白質聚集反應，在最適濃度范圍內添加這些添加劑不會影響細胞的生長、蛋白質的合成或運輸，其它促重組蛋白質可溶性表達的生長添加劑還有乙醇（誘導熱休克蛋白的表達）、低分子量的巰基或二硫化合物（影響細胞周質的還原態，從而影響二硫鍵的形成）和NaCl[5]。

3、 供給豐富的培養基，創造最佳培養條件，如供氧、pH等。

包涵體的分離及溶解

對於生物制葯工業來說，包涵體的形成也是有利的，不僅可獲得高表達、高純度的重組蛋白質，還可避免細胞水解酶對重組蛋白質的破壞。由於包涵體是蛋白質聚集而成的緻密顆粒，分離的第一步是對培養收集的細胞進行破碎，比較有效的方法是高壓勻漿結合溶菌酶處理，然後5000~20000g離心，可使大部分包涵體沉澱，與可溶性蛋白分離，接著，包涵體沉澱需用去污劑（Triton X-100或脫氧膽酸鈉）和低濃度變性劑（2mol/L尿素或鹽酸胍等）洗滌除去脂類和膜蛋白，這一步很重要，否則會導致包涵體溶解和復性的過程中重組蛋白質的降解[6、7、8]。

包涵體的溶解必須用很強的變性劑，如8mol/L尿素、6~8mol/L鹽酸胍，通過離子間的相互作用破壞包涵體蛋白間的氫鍵而增溶蛋白。其中尿素的增溶效果稍差，異氰鹽酸胍最強；去污劑，如SDS[7]，可以破壞蛋白內的疏水鍵，可以增溶幾乎所有的蛋白，但由於無法徹底去除而不允許用在制葯行業中；酸，如70%甲酸[9]，可以破壞蛋白的次級鍵從而增溶蛋白，這種方法只適合少數蛋白質。對於含有半胱氨酸的蛋白，在增溶時應加入還原劑（如DTT、GSH、β-ME）打開蛋白質中所有二硫鍵，對於目標蛋白沒有二硫鍵的有時也應使用還原劑，為含二硫鍵的雜蛋白會影響包涵體的溶解，同時還應加入金屬螯合劑，如EDTA或EGTA，用來螯合Cu2+、Fe3+等金屬離子與還原狀態的巰基發生氧化反應[10]。

蛋白質的折疊機理

包涵體蛋白在變性劑作用下，為可溶性伸展態，在變性劑去除或濃度降低時，就會自發的從變性的熱不穩
狀態向熱力學穩定狀態轉變，形成具有生物活性的天然結構[11]。然而在去除變性劑的同時，重組蛋白質在體外折疊，分子間存在大量錯誤折疊和聚合，復性效率往往很低，包涵體蛋白折疊復性的效率實際上取決於正確折疊過程與聚集過程之間的競爭[1]。對於蛋白質的折疊機制，目前有多種不同的假設，但很多學者認為有一個「熔球態」的中間狀態，在「熔球態」中，蛋白質的二級結構已經基本形成，其空間結構也初具規模，再做一些局部調整就可形成正確的立體結構，總之，蛋白質的具體步驟可用下式描述[12、13、14]：
伸展態→中間體→後期中間體→天然態體→聚集體

在折疊反應中，從伸展態到中間體的速度是非常快的，只需要幾毫秒，但從中間體轉變為天然態的過程比較緩慢，是一個限速過程。聚集過程與復性過程相互競爭，故而應盡量避免聚集體的產生。一般認為，蛋白質在復性過程中涉及兩種疏水作用，一是分子內的疏水相互作用，可促進蛋白質正確折疊；一是部分折疊的肽鏈分子間的疏水相互作用，在復性過程中，部分折疊的中間體的疏水簇外露，分子間的疏水相互作用會導致蛋白質聚集。蛋白質的立體結構雖然由其氨基酸的順序決定，然而伸展肽鏈折疊為天然活性結構的過程還受到周圍環境的影響，如溫度、pH值、離子強度、復性時間等因素的影響。

提高重組蛋白質折疊復性的方法

一個有效的、理想的折疊復性方法應具備以下幾個特點：活性蛋白質的回收率高；正確復性的產物易於與錯誤折疊蛋白質分離；折疊復性後應得到濃度較高的蛋白質產品；折疊復性方法易於放大；復性過程耗時較少[15]。

1、 透析、稀釋和超濾復性法：這三種方法是最傳統也是應用最普遍的蛋白質折疊復性方法，復性活性回收率低，而且難於與雜蛋白分離。透析法耗時長，易形成無活性蛋白質聚集體；超濾法在膜上聚集變性，易造成膜污染；稀釋法處理量太大，不利於工業放大[16]。

2、 高蛋白濃度下的復性方法：一個成功的復性過程在於能夠在高蛋白濃度下仍能得到較高的復性率。一個方法是把變性蛋白緩慢連續或不連續地加入到復性液中[17]。在兩次蛋白加入之間，應有足夠的時間間隔使蛋白質折疊通過了易聚集的中間體階段。這是由於完全折疊的蛋白通常不會與正在折疊的蛋白一起聚集。第二種方法是用溫度跳躍策略[4]。變性蛋白在低溫下復性折疊以減少聚集，直到易聚集的中間體大都轉化為不易聚集的後期中間體後，溫度快速升高來促進後期中間體快速折疊為蛋白的天然構象。第三種方法是復性在中等的變性劑濃度下進行[18]，變性劑濃度應高到足以有效防止聚集，同時又必須低到能夠引發正確復性。

3、 添加促進劑的復性方法：包涵體蛋白質折疊復性促進劑的促進作用可以分為：穩定正確折疊蛋白質的天然結構、改變錯誤折疊蛋白質的穩定性、增加折疊復性中間體的溶解性、增加非折疊蛋白質的溶解性。通常使用的添加劑有：a、共溶劑：如PEG6000~20000，通過與中間體特異的形成非聚集的復合物，可以阻止蛋白質分子間的相互碰撞機會，減少蛋白質的聚集；b、去污劑及表面活性劑：如Trition X-100、CHAPs、磷脂、磺基甜菜鹼等對蛋白質復性有促進作用，但它們能與蛋白質結合，很難去除；c、氧化-還原劑：對於含有二硫鍵的蛋白，復性過程中應加入氧化還原體系，如GSH/GSSG、DTT/GSSG、DTE/GSSG等，氧化還原系統通過促進不正確形成的二硫鍵快速交換反應，提高了正確配對的二硫鍵的產率[19]；d、小分子的添加劑：如鹽酸胍或尿素、烷基脲、碳酸醯胺類等，都可阻止蛋白聚集，它們的作用可能為：穩定蛋白的活性狀態、降低非正確折疊的穩定性、增加折疊中間體的穩定性、增加解折疊狀態的穩定性。e、0.4~0.6M L-Arg：L-Arg能使得不正確折疊的蛋白質結構以及不正確連接的二硫鍵變得不穩定，使折疊向正確方向進行，可大幅度地提高包涵體蛋白質的折疊效率。f、添加分子伴侶和折疊酶：分子伴侶是指能夠結合和穩定

② 包涵體復性過程中，用鹽酸胍和尿素哪個好，有什麼區別

包涵體復性過程中，用鹽酸胍和尿素哪個好，有什麼區別
① 包涵體就是蛋白的變性聚集後的產物,6M鹽酸胍及8M尿素是作為溶解包涵體的溶劑.
② 復性的過程是逐步去除鹽酸胍或者尿素,從而使得蛋白天然構象逐步形成.
所以一般如果起始使用的是6M鹽酸胍進行包涵體溶解,這個過程中逐步降低的是鹽酸胍的濃度.

③ 用尿素變性再復性的方法透析包涵體以後，為什麼要去除尿素

比如還原劑要看是否有其他緩沖液了。洗滌包涵體應該不需要金屬離子吧，EDTA這兩樣和金屬離子會有反應，單純尿素不會被金屬離子影響

④ 帶gst標簽的蛋白以包涵體形式表達，復性後仍不能掛柱，為什麼

因為是融合蛋白，GST標簽蛋白和目的基因蛋白融合在一起形成了一個更大的蛋白。

⑤ 包涵體變復性的包涵體變性

稀釋復性：直接加入水或緩沖液，放置過夜，缺點是體積增加較大，變性劑稀釋速度太快，不易控制。目前稀釋法主要有一次稀釋、分段稀釋和連續稀釋三種方式。
透析復性：好處是不增加體積，通過逐漸降低外透液濃度來控制變性劑去除速度，有人稱易形成無活性蛋白質聚體，且不適合大規模操作，無法應用到生產規模。
超濾復性：在生產中較多的使用，規模較大，易於對透析速度進行控制，缺點是不適合樣品量較少的情況，且有些蛋白可能在超濾過程中不可逆的變性。
柱上復性：是最近研究較多並成功的在生產中應用的一種復性方法，包涵體蛋白變性後，在色譜柱上復性，大致可分成疏水柱復性及凝膠柱復性兩類。其中的凝膠柱復性均是用Sephacry1S-100或Superdex75 等分子篩填料，柱較長（40cm-100cm不等）。相比稀釋和透析兩種方法，色譜柱復性回收率高（高達90%以上）、快速、易放大，樣品稀釋倍數小（一般五倍左右）
高蛋白質濃度下的復性：通常有兩種方法，一是緩慢地連續或不連續地將變性蛋白加入到復性緩沖液中，使得蛋白質在加入過程中或加入階段之間有足夠的時間進行折疊復性；二是採用溫度跳躍式復性，即讓蛋白質先在低溫下折疊復性以減少蛋白質聚集的形成，當形成聚集體的中間體已經減少時，迅速提高溫度以促進蛋白質折疊復性。
此外，吸附法、反膠束法和雙水相萃取法等都可用蛋白質的復性。 復性是一個非常復雜的過程，除與蛋白質復性的過程式控制制相關外，還很大程度上與蛋白質本身的性質有關，有些蛋白非常容易復性，如牛胰RNA酶有12對二硫鍵，在較寬松的條件下復性效率可以達到95%以上，而有一些蛋白至今沒有發現能夠對其進行復性的方法如IL-11，很多蛋白的復性效率只有百分之零點幾，如在純化IL-2時以十二烷基硫酸鈉溶液中加入銅離子（0.05%SDS，7.5-30u mol/l CuCl2）的方法，25-37°C下反應3小時，再EDTA至1m mol/l終止反應，復性後的二聚體低於1%。[6]一般說來，蛋白質的復性效率在20%左右。
影響復性效率的因素
蛋白質的復性濃度：正確折疊的蛋白質的得率低通常是由於多肽鏈之間的聚集作用，蛋白質的濃度是使蛋白質聚集的主要因素，因而，一般濃度控制在0.1-1mg/ml；如果變性蛋白加入復性液中過快，容易形成絮狀沉澱，可能是蛋白重新凝聚的緣故。所以我們採用再水浴和磁力攪拌下，逐滴加入變性蛋白，使變性蛋白在復性液中始終處於低濃度狀態。
pH和溫度：復性緩沖液的pH值必須在7.0以上，這樣可以防止自由硫醇的質子化作用影響正確配對的二硫鍵的形成，過高或過低會降低復性效率，最適宜的復性pH值一般是8.0-9.0。
此外，影響復性效率的因素還有，變性劑的起始濃度和去除速度、氧化還原電勢、離子強度、共溶劑和其他添加劑的存在與否等。
提高包涵體蛋白的復性產率
氧化-還原轉換系統
對於含有二硫鍵的蛋白，復性過程應能夠促使二硫鍵形成。常用的方法有：空氣氧化法、使用氧化交換系統、混合硫化物法、谷胱甘肽再氧化法及DTT再氧化法.
最常用的氧化交換系統是GSH/GSSG,而cysteine/cystine、cysteamine/cystamine、DTT/GSSG、DTE/GSSG等也都有應用。氧化交換系統通過促使不正確形成的二硫鍵的快速交換反應提高了正確配對的二硫鍵的產率。通常使用1-3m mol/l還原型巰基試劑,還原型和氧化型巰基試劑的比例通常為10：1—5：1。
添加低分子化合物
低分子化合物自身並不能加速蛋白質的折疊，但可能通過破壞錯誤折疊中間體的穩定性，或增加折疊中間體和未折疊分子的可溶性來提高復性產率。如鹽酸胍、脲、烷基脲、以及碳酸醯胺類等，在非變性濃度下是很有效的促進劑。蛋白質的輔因子、配基或底物亦可起到很好的促折疊作用，如蛋白質的輔因子Zn2+或Cu2+可以穩定蛋白質的折疊中間體,從而防止了蛋白質的聚集，加入濃度大於0.4 mol/lTris緩沖液可提高包涵體蛋白質的折疊效率。濃度為0.4-0.6M L-Arg有助於增加復性中間產物的溶解度。成功的應用於很多蛋白如t-PA的復性中，可以抑制二聚體的形成。
PEG-NaSO4兩相法
用PEG和NaSO4作為成相劑,然後加入鹽酸胍，再把變性的還原的蛋白質溶液加入其中進行復性,但這種方法需復性的變性蛋白質的濃度必須低。
分子伴侶和折疊酶等
這類蛋白質主要包括硫氧還蛋白二硫鍵異構酶、肽醯-輔氨醯順反異構酶、分子伴侶、FK506結合蛋白、Cyclophilin等。分子伴侶和折疊酶等不僅可在細胞內調節蛋白質的折疊和聚集過程的平衡，而且可在體外促進蛋白質的折疊復性。
其它
提高復性率的策略還有許多，如：非離子型去垢劑，尤其是離子型或兩性離子去垢劑或表面活性劑CHAPs、Triton X-100、磷脂、laury lmaltosid、Sarkosyl等對蛋白質復性有促進作用；待折疊復性的蛋白質的抗體可有效協助其復性；多聚離子化合物如肝素不僅可以促進蛋白質的作用，而且具有穩定天然蛋白質的作用。[10] 根據具體的蛋白性質和需要，可以從生化、免疫、物理性質等方面對蛋白質的復性效率進行檢測。
凝膠電泳：一般可以用非變性的聚丙烯醯胺凝膠電泳可以檢測變性和天然狀態的蛋白質，或用非還原的聚丙烯醯胺電泳檢測有二硫鍵的蛋白復性後二硫鍵的配對情況。
光譜學方法：可以用紫外差光譜、熒光光譜、圓二色性光譜（CD）等，利用兩種狀態下的光譜學特徵進行復性情況的檢測，但一般只用於復性研究中的過程檢測。
色譜方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由於兩種狀態的蛋白色譜行為不同，
生物學活性及比活測定：一般用細胞方法或生化方法進行測定，較好的反映了復性蛋白的活性，值得注意的是，不同的測活方法測得的結果不同，而且常常不能完全反映體內活性。
黏度和濁度測定：復性後的蛋白溶解度增加，變性狀態時由於疏水殘基暴露，一般水溶性很差，大多形成可見的沉澱析出。
免疫學方法：如ELISA、WESTERN等，特別是對結構決定簇的抗體檢驗，比較真實的反映了蛋白質的折疊狀態。
在正常的生理條件下，組成蛋白質的多肽鏈都能以獨特的方式進行折疊，形成自己特有的空間結構，以執行某一些生命活動。當外界環境改變時，可能造成基因突變和蛋白質序列改變，錯誤剪接和運輸，錯誤折疊和異常聚積，形成對機體有害的反應，引起構象病的發生和無生物活性、不可溶的包涵體形成。目前對包涵體形成和復性過程中發生聚集的機制尚不清楚，許多已建立的高效復性方法是在反復實驗和優化的基礎上建立的，且沒有普遍性，但從這許許多多的個例中發現了一些規律：如聚集的發生是由鏈間的疏水相互作用介導、聚集具有相對特異性、折疊中間體可能具有不同的作用等等，並利用這些知識建立了一些重組蛋白質高效復興性的方法。相信隨著結構生物學、生物信息學、蛋白質工程學及相關新技術和新設備的發展和完善，在不久的將來，預測和設計最佳復性方案將成為可能。

⑥ 包涵體蛋白可以先純化再復性嗎

包涵體用8M尿素還不溶解該怎麼①包涵體就是蛋白的變性聚集後的產物，6M鹽酸胍及8M尿素是作為溶解包涵體的溶劑。②復性的過程是逐步去除鹽酸胍或者尿素，從而使得蛋白天然構象逐步形成。所以一般如果起始使用的是6M鹽酸胍進行包涵體溶解，這個過程中逐步降低的是鹽酸胍的濃度。

⑦ 在包涵體細胞的變性與復性中實驗中，最有可能用到哪個

您好！您這里可能有些概念錯誤。
① 包涵體就是蛋白的變性聚集後的產物，6M鹽酸胍及8M尿素是作為溶解包涵體的溶劑。
② 復性的過程是逐步去除鹽酸胍或者尿素，從而使得蛋白天然構象逐步形成。
所以一般如果起始使用的是6M鹽酸胍進行包涵體溶解，這個過程中逐步降低的是鹽酸胍的濃度。梯度離心或者差速離心去除細胞碎片，一般1000r/min左右就差不多可以達到效果。包涵體是表達過快的蛋白來不及折疊而形成的蛋白團，所以一般蛋白純度能夠達到95%以上，用6M鹽酸胍就基本把包涵體分開，再超濾一下加上緩沖液就基本上很純了

⑧ 包涵體蛋白不變性復性能做WB嗎

可以啊，包涵體蛋白只是二硫鍵折疊不正確，並不會影響到他們與抗體結合，而且你做western的時候蛋白都是變性的啊（SDS-PAGE階段）。需要做包涵體復性的是需要有活性的蛋白時才用（比如重組蛋白酶活性分析）。

⑨ 包涵體蛋白變性復性後還要不要純化

那要看純度了，合適的話就不用了。
沒有達到你的要求的話，就需要再次精純。

⑩ 在包涵體蛋白的變性與復性實驗中，最有可能用到以下哪種實驗技術

包涵體外源基原核細胞表達尤其腸桿菌高效表達形由膜包裹高密度、溶性蛋白質顆粒顯微鏡觀察高折射區與胞質其明顯區別