pcr濾芯吸頭實驗記錄

⑴ 逆轉錄PCR的實驗步驟用到哪些試劑和儀器

• 一、實驗器具與材料：

• 1、移液器：1ml、200μl、20μl、10μl、2μl

• 2、吸頭：1ml、200μl、20μl

• 3、勻漿管：5ml

• 4、吸頭台：放置1ml吸頭的一個，放置20μl吸頭的一個

• 5、EP管：1.5ml、0.2ml、100μl

• 6、試劑瓶：2個60ml的棕色試劑瓶（廣口，帶蓋）；1個125ml的白色試劑瓶（放無水乙醇）

• 7、量筒：50ml、250ml、500ml

• 8、容量瓶：250ml、500ml、1000ml

• 9、試管架：5ml、1.5ml、20μl

• 10、鹽水瓶：250ml、500ml各2個備用，一個裝無水乙醇，另一個裝DEPC水

• 11、鋁制飯盒：4個

• 12、塑料小飯盒：1個

• 13、大瓷缸：2個

• 14、錫泊紙：一卷

• 15、卷紙：2卷

• 16、三角燒瓶：帶蓋，稍大

• 二、實驗器具的處理與准備

• 1、塑料製品：（包括槍頭、EP管、勻漿管等）

• 先將DEPC水從容量瓶中倒入瓷缸中，將塑料製品逐個浸泡其中，其中小槍頭需要吸管打入DEPC水，過夜，然後高壓，再烤乾備用，實驗前將槍頭等放入吸頭台，再高壓一次（EP管）

• 2、玻璃製品：泡酸過夜，沖洗干凈，蒙錫紙烤乾備用（DEPC水泡）（洗凈後先泡1‰DEPC過夜，再烤乾）

• 3、勻漿器：（包括剪刀、鑷子）先洗凈後，再高壓（不需要泡DEPC）

• 三、試劑配製：

• 1、DEPC水：吸出1ml放在1000ml雙蒸水中配成1‰DEPC水，放在1000ml容量瓶中靜置4小時備用。

• 2、75%乙醇：用無水乙醇DEPC水配，然後放-20℃保存（其中DEPC水需先高壓）

• 3、異丙醇：放入棕色瓶中

• 4、氯仿：放入棕色瓶中

• 5、瓊脂糖

• 僅供參考

⑵ pcr實驗所用的帶濾芯的吸頭需要無菌嗎

據我理解就是普通滅過菌的吸頭。唯一能再進階一點的，就是可能要用於RNA實驗，所以需要的是經過無RNA酶處理的槍頭。 做這些都是為了防止有外源的核酸干擾到擴增實驗。

⑶ 在基因擴增檢驗中。用帶濾芯的吸頭是為什麼

主要應該是防止氣溶膠污染吧

⑷ pcr實驗室面積是否有嚴格要求

基因擴增實驗又稱PCR實驗，其特點是能將微量的DNA大幅增加，PCR是分子生物學研究和實驗的常規方法，廣泛應用於生物學各個領域，例如：艾滋病檢測、乙型肝炎、禽疫病、癌基因的檢測和診斷，DNA指紋、個體識別、親子鑒定及法醫物證，動、植物檢疫，動物及其衍生產品檢測，動物飼料、化妝品、食品衛生檢測，轉基因作物與轉基因微生物檢測等。

一、PCR實驗室布局

PCR實驗室原則上為試劑准備區、樣品制備區、擴增區和擴增產物分析區四個單獨的工作區域並設有專用走廊，各工作區域應設緩沖間，工作區與緩沖間宜安裝連鎖裝置。不同功能的工作區應是分隔獨立的，各工作區有明顯的標志，不能直通，如果緊密相連，需安裝物品傳遞窗。前兩區為擴增前區，後兩區為擴增後區，擴增前區與擴增後區應嚴格分開。實驗材料、試劑、記錄紙、筆、清潔材料等，只能從擴增前區流向擴增後區，即從試劑准備區→樣品制備區→擴增區→擴增產物分析區，不得逆向流動。實驗室的氣流也應從擴增前區流向擴增後區，不得逆向流動。各工作區頂部應安裝紫外燈，紫外燈的波長為254nm，每20㎡一支40W的紫外燈。

二、實驗室各區功能及主要設備

1、試劑准備區：主要進行試劑的制備、分裝和主反應混合液的制備。試劑和用於樣品製作的材料應直接運送至該區，不得經過其它區域。試劑原材料必須貯存在本區內，並在本區內制備成所需的試劑。本區主要設備有天平、冰箱、離心機、加樣器、振盪器等。

對於氣流壓力的控制，本區並沒有嚴格的要求。

2、樣品制備區：主要進行樣品的保存、核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴增反應管和測定DNA的合成。本區主要設備有冰箱、生物安全櫃、離心機、加樣器、振盪器、恆溫水浴等。

本區的壓力梯度要求為：相對於鄰近區域為正壓，以避免從鄰近區進入本區的氣溶膠污染。

3、擴增區：主要進行DNA擴增。此外，已制備的DNA模板 (來自樣品制備區)的加入和主反應混合液(來自試劑准備區)制備成反應混合液等也可在本區內進行。本區主要設備有：擴增儀、冰箱、離心機、加樣器等。

本區的壓力梯度要求為：相對於鄰近區域為負壓，以避免氣溶膠從本區漏出。

4、擴增產物分析區：擴增產物的測定。本區主要設備有酶標儀、洗板機、加樣器和水浴箱等。

本區的壓力梯度的要求為：相對於鄰近區域為負壓，以避免擴增產物從本區擴散至其它區域。



三、PCR實驗室通風系

⑸ PCR實驗問題交流，有沒有做PCR實驗操作的

（轉載，僅供參考）
實時熒光定量PCR實驗檢測微量感染因子時，容易因為污染的而導致各種問題，因此，進行PCR操作時，操作人員應該嚴格遵守一些操作規程，最大程度地降低可能出現的PCR污染或杜絕污染的出現。
（1）劃分操作區：目前，普通PCR尚不能做到單人單管，實現完全閉管操作，但無論是否能夠達到單人單管，均要求實驗操作在三個不同的區域內進行，PCR的前處理和後處理要在不同的隔離區內進行：
① 標本處理區，包括擴增摸板的制備；
② PCR擴增區，包括反應液的配製和PCR擴增；
③ 產物分析區，凝膠電泳分析，產物拍照及重組克隆的制備。
各工作區要有一定的隔離，操作器材專用，要有一定的方向性。如：標本制備→PCR擴增→產物分析→產物處理。
切記：產物分析區的產物及器材不要拿到其他兩個工作區。
（2）分裝試劑：PCR擴增所需要的試劑均應在裝有紫外燈的超凈工作台或負壓工作台配製和分裝。所有的加樣器和吸頭需固定放於其中，不能用來吸取擴增後的DNA和其他來源的DNA：
① PCR用水應為高壓的雙蒸水；
② 引物和dNTP用高壓的雙蒸水在無PCR擴增產物區配製；
③ 引物和dNTP應分裝儲存，分裝時應標明時間，以備發生污染時查找原因。
(3) 實驗操作注意事項 盡管擴增序列的殘留污染大部分是假陽性反應的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進行擴增反應是謹慎認真，在樣品的收集、抽提和擴增的所有環節都應該注意：
① 戴一次性手套，若不小心濺上反應液，立即更換手套；
② 使用一次性吸頭，嚴禁與PCR產物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露於空氣中，避免氣溶膠的污染；
③ 避免反應液飛濺，打開反應管時為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體於管底。若不小心濺到手套或桌面上，應立刻更換手套並用稀酸擦拭桌面；
④ 操作多份樣品時，制備反應混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然後分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應的精確度；
⑤ 最後加入反應模板，加入後蓋緊反應管；
⑥ 操作時設立陰陽性對照和空白對照，即可驗證PCR反應的可靠性，又可以協助判斷擴增系統的可信性；
⑦ 盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由於加樣器最容易受產物氣溶膠或標本DNA的污染，最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過程中加樣器應該專用，不能交叉使用，尤其是PCR產物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區；
⑧ 重復實驗，驗證結果，慎下結論。

⑹ PCR實驗操作注意事項有哪些

1、必須在無菌無塵環境下進行操作；

2、檢測人員必須通過國家臨檢中心業務培訓並取得合格證書；

3、必須擁有標準的的PCR熒光實驗室；

4、後PCR區PCR完成以後，應該留出一個專門用於反應後處理樣品的地方。

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PCR實驗特點：

1、靈敏度高：PCR實驗產物的生成量是以指數方式增加的，能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達3個RFU；在細菌學中最小檢出率為3個細菌。

2、簡便、快速：PCR實驗反應一般在2～4 小時完成擴增反應。擴增產物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。

3、純度要求低：不需要分離病毒或細菌及培養細胞，DNA 粗製品及RNA均可作為擴增模板。可直接用臨床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發、細胞、活組織等DNA擴增檢測。

參考資料來源：網路-PCR實驗室

⑺ PT-PCR操作流程

是RT-PCR啊。

一、實驗器具與材料：
1、移液槍：1ml、200μl、20μl、10μl、2μl
2、吸頭：1ml、200μl、20μl
3、勻漿管：5ml
4、吸頭台：放置1ml吸頭的一個，放置20μl吸頭的一個
5、EP管：1.5ml、0.2ml、100μl
6、試劑瓶：2個60ml的棕色試劑瓶（廣口，帶蓋）
1個125ml的白色試劑瓶（放無水乙醇）
7、量筒：50ml、250ml、500ml
8、容量瓶：250ml、500ml、1000ml
9、試管架：5ml、1.5ml、20μl
10、鹽水瓶：250ml、500ml各2個備用，一個裝無水乙醇，另一個裝DEPC水
11、鋁制飯盒：4個
12、塑料小飯盒：1個
13、大瓷缸：2個
14、錫泊紙：一卷
15、卷紙：2卷
16、三角燒瓶：帶蓋，稍大
二、實驗器具的處理與准備
1、塑料製品：（包括槍頭、EP管、勻漿管等）
先將DEPC水從容量瓶中倒入瓷缸中，將塑料製品逐個浸泡其中，其中小槍頭需要吸管打入DEPC水，過夜，然後高壓，再烤乾備用，實驗前將槍頭等放入吸頭台，再高壓一次（EP管）
2、玻璃製品：泡酸過夜，沖洗干凈，蒙錫紙烤乾備用（DEPC水泡）（洗凈後先泡1‰DEPC過夜，再烤乾）
3、勻漿器：（包括剪刀、鑷子）先洗凈後，再高壓（不需要泡DEPC）
三、試劑配製：
1、DEPC水：吸出1ml放在1000ml雙蒸水中配成1‰DEPC水，放在1000ml容量瓶中靜置4小時備用。
2、75%乙醇：用無水乙醇 DEPC水配，然後放-20℃保存（其中DEPC水需先高壓）
3、異丙醇：放入棕色瓶中
4、氯仿：放入棕色瓶中
5、瓊脂糖
四、幾種緩沖液的配製：
1、電泳緩沖液：
Tris 54g
硼酸 27.5g
0.5M EDTA 20ml？ pH8.0
蒸溜水 1000ml
5×TBE （貯存液）
再將5×TBE稀釋10倍成0.5TBE就可以在電泳時使用（即工作液濃度），如取50ml貯存液 450ml水--→500ml工作緩沖液
2、上樣緩沖液：
0.25%溴酚藍
0.25%二甲苯青FF
30%甘油
6×緩沖液，4℃保存
五、瓊脂糖凝膠的配製：
1、1.0%：
1.0g瓊脂糖 100ml電泳緩沖液，微波爐中火30秒至沸騰，熔化的瓊脂物冷卻至60℃時加入10mg/ml溴化乙錠2.5μl，充分混勻，將溫熱的凝膠倒入已置好梳子的膠膜中，在室溫下放置30-45min後現進行電泳。
2、1.5%:
同上，將瓊脂糖的量改為1.5g

六、需購置的Rt-PCR材料：
（生工. Tel. 2236106.）
Taq酶（含MgCl2 Buffer） 200u 70.00
dNTP: 1支
oligo(dT)15: 1 OD 40.00 promega
M-MLV: 1支 250.00 promega (Buffer)
RNasin: 1支 110
-- -20℃
DEPC 5g 110.00
Trizol 100ml/1瓶 Invitrogen Life technologies
-- 4℃
Marker: 10μg 0.2μg/ml 150.00 科威
（1543. 994. 697. 515. 377. 231）
七、引物合成

正義：5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′
反義：5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′
2、par-4:
正義：5′-GGGACCTCGGAACTCAAC-3′
反義：5′-TGTATCTGCCTGGGACTG-3′
3、退火溫度計算
2（A T） 4（G C）
正反義平均數，再上下波動度（±4℃，或±5℃）
4、引物各合成5 OD，每OD一瓶分裝好
5、引物稀釋：
加DEPC水量為（μl）
= ? nmol / OD × 管上所標OD數×100
是為10p mol / μl 濃度的引物溶液
八、PCR產物電泳
先將1-10μl左右PCR產物，加已點在紙上的溴酸蘭，反復吸打混勻後進行電泳，一般電流為10mA，電源100V，電泳30分鍾，紫外燈下觀察，滿意的結果掃描列印。
九、幾個注意點：
1、逆轉錄的關鍵步驟是立即冰水浴？
2、Rt時，先打開PCR預熱30分鍾。
3、RNA抽提前，打開離心機預冷。
TRIzol法抽提總RNA
細胞1×107
組織100mg
↓
加1mlTRIzol
細胞用1ml加樣器吹至液體澄清且無細胞團塊
↓
勻漿（要徹底，後轉至EP管）
（組織勻漿量>100mg時分裝1ml/每EP管）
↓
顛倒混勻10下，室溫5分鍾
↓
加氯仿1/5體積（0.2ml）（必須按總體積的1/5）
↓
顛倒混勻10下，室溫5分鍾
↓
4℃，離心12000g，15分鍾
↓
轉上層水相（約400μl）於另一1.5mlEP管中
↓
加等體積異丙醇（約400μl），混勻室溫10分鍾
↓
4℃，離心12000g，10分鍾
↓
棄上清
↓
加冰預冷的75%乙醇（用DEPC水配）1ml
↓
4℃離心7500g，5分鍾
↓
棄上清，空氣乾燥5-10分鍾（不能完全乾燥）
↓
溶於DEPC水中至20μl（10μl-20μl）
（可在55-60℃水中，<10分鍾助溶）

註：
1、RNA若用於核酸轉移應溶解於樣本緩沖液中，否則DEPC溶解
2、細胞組織加TRIzol勻漿後，可在-60℃放置至少一個月（甚至可一年以上）
3、RNA在75%乙醇中，2-8℃至少可保存一周，-20℃至少可保存一年

兩步法RT-PCR
（第一步：逆轉錄反應）
試劑 濃度 體積 終濃度
RNA 23μl(11.5μl)
Oligo(dT)15 0.05μg/μl 4μl(2μl) 0.005μg/μl
（稀釋10倍後用）
↓
混勻，離心，70℃ 5min
↓
立即冰水浴，稍離心
↓
試劑 濃度 體積 終濃度
M-MLV Buffer 5× 8μl (4μl) 1×
dNTP 10mM 2μl (1μl) 0.5mM
RNasin 40U/μl 1μl (0.5μl) 20μ
M-MLV 200U/μl 2μl (1μl) 200U
總體積40μl（20μl）
↓
混勻，離心，42℃ 60min
↓
95℃ 10min（破壞MLV）
↓
4℃保存
兩步法RT-PCR
（第二步：PCR反應）
總體積20μl(50μl)
試劑 濃度 體積 終濃度
Taq Buffer 10× 2μl (5μl_) 1×
MgCl2 25mM 1.2μl (3μl) 1.5mM
dNTP 10mM 0.2μl (0.5μl) <200uM
上游引物 10pmol/μl 0.3μl (1μl) 10pmol
下游引物 10pmol/μl 0.3μl (1μl) 10pmol
cDNA模板 X (?) (1-10μl)
DEPC水 20μl-4.3μl-X

Taq酶 2.5U/μl 0.3μl (1μl) 2.5U/μl
↓
混勻
↓
97℃，5分鍾
↓
立即冰水浴
↓
混勻
↓
95℃ 5分 預變性
94℃ 30秒 變性
X℃ 40秒 退火
72℃ 30秒 延伸
72℃ 7分 終末延伸
28-36循環，4℃保溫
三、電泳：
加1-10μl PCR產物 溴芬蘭（1-2.5μl）混勻，加樣，電泳。
注意：Taq酶、M-MLV、Rnasin等-20℃保存，操作時置於冰上。DNTP勿反復凍融。

⑻ PCR實驗過程中的注意事項

PCR產物的電泳檢測時間 一般為48h以內,有些最好於當日電泳檢測,大於48h後帶型不規則甚至消失.
PCR反應的關鍵環節有①模板核酸的制備,②引物的質量與特異性,③酶的質量及, ④PCR循環條件.尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究.
酶切分析：
根據PCR產物中限制性內切酶的位點,用相應的酶切、電泳分離後,獲得符合理論的片段,此法既能進行產物的鑒定,又能對靶基因分型,還能進行變異性研究. 分子雜交：分子雜交是檢測PCR產物特異性的有力證據,也是檢測PCR 產物鹼基突變的有效方法. Southern印跡雜交： 在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈(內部寡核苷酸)標記後做探針,與PCR產物雜交.此法既可作特異性鑒定,又可以提高檢測PCR產物的靈敏度,還可知其分子量及條帶形狀,主要用於科研. 斑點雜交： 將PCR產物點在硝酸纖維素膜或尼膜薄膜上,再用內部寡核苷酸探針雜交,觀察有無著色斑點,主要用於PCR產物特異性鑒定及變異分析. 氯仿抽提掉蛋白質和其它細胞組份,用乙醇或異丙醇沉澱 核酸.提取的核酸即可作為模板用於PCR反應.一般臨床檢測標本,可採用快速簡便的方法溶解細胞,裂解病原體,消化除去染色體的蛋白質使靶基因游離,直接用於PCR擴增.RNA模板提取一般採用異硫氰酸胍或蛋白酶K法,要防止RNase降解RNA.
溫度與時間的設置： 基於PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個溫度點.在標准反應中採用三溫度點法,雙鏈DNA在90～95℃變性,再迅速冷卻至40 ～60℃,引物退火並結合到靶序列上,然後快速升溫至70～75℃,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物鏈沿模板延伸.對於較短靶基因(長度為100～300bp時)可採用二溫度點法, 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一,一般採用94℃變性,65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性).
實驗操作注意事項 盡管擴增序列的殘留污染大部分是假陽性反應的原因,樣品間的交叉污染也是原因之一.因此,不僅要在進行擴增反應是謹慎認真,在樣品的收集、抽提和擴增的所有環節都應該注意：
1. 戴一次性手套,若不小心濺上反應液,立即更換手套；
2. 使用一次性吸頭,嚴禁與PCR產物分析室的吸頭混用,吸頭不要長時間暴露於空氣中,避免氣溶膠的污染；
3. 避免反應液飛濺,打開反應管時為避免此種情況,開蓋前稍離心收集液體於管底.若不小心濺到手套或桌面上,應立刻更換手套並用稀酸擦拭桌面；
4. 操作多份樣品時,制備反應混合液,先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好,然後分裝,這樣即可以減少操作,避免污染,又可以增加反應的精確度；
5. 最後加入反應模板,加入後蓋緊反應管；
6. 操作時設立陰陽性對照和空白對照,即可驗證PCR反應的可靠性,又可以協助判斷擴增系統的可信性；
7. 盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器,由於加樣器最容易受產物氣溶膠或標本DNA的污染,最好使用可替換或高壓處理的加樣器.如沒有這種特殊的加樣器,至少PCR操作過程中加樣器應該專用,不能交叉使用,尤其是PCR產物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區；
8. 重復實驗,驗證結果,慎下結論.

⑼ 怎樣進行濾芯吸頭的質量檢測

濾芯洗頭的質量想要檢測的可以上專業的檢測機構進行。

⑽ pcr實驗室是什麼

摘要 建立PCR實驗室的基本條件 臨床基因擴增實驗室採用PCR技術用於臨床基因診斷，由於PCR技術對所檢測的核酸模板進行大量擴增，容易出現實驗室污染導致臨床檢測標本假陽性結果；另外由於PCR技術要求高、影響因素多（特別是RNA標本），實驗過程處理不當易導致核酸模板無擴增現象，導致臨床標本假陰性結果。因此臨床基因擴增檢驗實驗室技術驗收和規范化管理是PCR技術本身需要，也是在臨床上順利應用該技術前提。 二、PCR實驗室驗收准備工作 （一）硬體准備——實驗室基本建設 1.根據文件要求，臨床基因擴增檢驗實驗室原則上分為四個單獨的工作區域：試劑貯存和准備區；標本制備區；擴增反應混合物配製和擴增區；擴增產物分析區，如使用全自動封閉分析儀器檢測，此區域可不設。 2.各工作區域必須有明確的標記，避免不同工作區域內的設備、物品混用。 3.進入各工作區域必須嚴格按照單一流向進行，即試劑貯存和准備區→標本制備區→擴增反應混合物配製和擴增區→擴增產物分析區。 4.不同的工作區域使用不同的工作服（不同的顏色）。工作人員離開各工作區域時，不得將工作服帶出。 5.工作區域儀器設備配置標准 （1）試劑貯存和准備區 2～8℃和-15℃冰箱：混勻器；微量加樣器（覆蓋1～1000μl）；移動紫外燈（近工作檯面）；消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）；專用工作服和工作鞋；專用辦公用品等。 （2）標本制備區 2～8℃冰箱，-20℃或-80℃冰箱；高速台式冷凍離心機；混勻器；水浴箱或加熱模塊；微量加樣器（覆蓋1～1000μl）；可移動紫外燈（近工作檯面）；超凈工作台，消耗品；一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）；專用工作服和工作鞋；專用辦公用品等。 （3）擴增反應混合物配製和擴增區核酸擴增儀；微量加樣器（覆蓋1～1000μl）；可移動紫外燈（近工作檯面）；消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）；專用工作服和工作鞋；專用辦公用品等。 （4）擴增產物分析區視檢測方法不同而定。基本儀器設備如下：微量加樣器（覆蓋1～200μl）；可移動紫外燈（近工作檯面）；消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）；專用工作服和工作鞋；專用辦公用品等。 （二）軟體建設——質