A. 蛋白過鎳柱純化的原理和步驟是什麼
Ni柱中的氯化鎳可以與有HIs（組蛋白）標簽的蛋白結合，也可以與咪唑結合。
步驟是：過柱子前可以選擇Ni柱重生，也就是往柱子里倒氯化鎳，一個柱長體積就行了，然後平衡柱子，拿你自己的buffer，給蛋白提供最適的環境，我一般平衡4個柱長，然後蛋白上樣，你可以讓他自己掛，這樣掛柱子的效果好一些，如果流速太慢，可以加個恆流泵，但是一定不能太快，太快掛柱效果差，當然你也可以選擇循環掛柱，就是恆流泵的一頭接你裝蛋白的燒杯，從柱子中留下來的液體還用同一個燒杯接回去。掛完之後，按理想來講，你的蛋白在Ni柱中與Ni就結合了，雜蛋白多數在燒杯里，留下來了，當然肯定有少量雜蛋白也掛上了，這時候你要梯度洗脫，拿咪唑和你的buffer配，一般從0 20mM 40mM。。。。100mM這樣洗脫（當你不知道你的蛋白大概在什麼時候出來的時候）我指的是咪唑的終濃度。咪唑加入之後，會和蛋白爭奪與Ni的結合位點，雜蛋白、你的目的蛋白，會在不同的濃度被洗脫下來，洗完之後，你可以用200mM咪唑洗柱子，清理一切蛋白，然後平衡幾次，是否選擇重生你自己定咯~然後放上20%乙醇保存柱子就可以咯~
過的蛋白用不同的管子收下，然後SDS-page檢測在哪個管子里。
這是我的經驗，樓主可以多方面參考下別人的。喜歡推薦我的答案哦，~\(≧▽≦)/~
B. 鎳柱純化時，鎳離子被洗脫下來掉到蛋白溶液里對蛋白有影響嗎透析時只有透析掉咪唑為什麼不說把鎳離子透析
Ni離子是重金屬，進入蛋白中肯定是有影響的，如果這個蛋白是用於人體或者動植物的肯定是不行的。Ni柱重新掛Ni確實是必須要脫Ni的，但一般是先用咪唑把蛋白全部洗下來後才脫Ni的，所以一般不太可能進入蛋白溶液中，如果進入了你可以重新用另一根柱子（這個柱子得保證結合你的蛋白），將蛋白溶液穿過這個柱子，讓蛋白結合至柱子上，而Ni則和流穿液一起流穿，在把蛋白洗脫下來即可；至於透析，沒試過，不好說，但Ni畢竟是離子，小分子，應該能透析掉的啊。希望我的回答對你有幫助。
C. 為什麼鎳柱純化洗脫下來的酶透析後就沒有活性了
向透析後的酶加入輔助因子，觀察酶活是否可以恢復。用以EDTA螯合金屬離子的酶做為對照。第二可以加入非輔助因子的離子來增加離子強度，觀察酶活是否恢復。
輔助因子是金屬離子的情況。用EDTA做對照就是人工降低離子濃度。然後向實驗組和對照組都加入金屬離子，看功能是否可以恢復。如果兩組都能恢復，說明的確是由於缺少金屬離子造成酶活的喪失。
酶活力的度量單位。1961年國際酶學會議規定：1個酶活力單位是指在特定條件（25℃，其它為最適條件）下，在1分鍾內能轉化1微摩爾底物的酶量，或是轉化底物中1微摩爾的有關基團的酶量。
定義
指酶催化一定化學反應的能力。
單位
在特定條件下，1分鍾內轉化1微摩爾底物所需的酶量為一個活力單位(U)。溫度規定為25度，其他條件取反應的最適條件。
比活力
每毫克酶蛋白所具有的酶活力。單位是u/mg。比活力越高則酶越純。
轉化數
每分子酶或每個酶活性中心在單位時間內能催化的底物分子數(TN)。相當於酶反應的速度常數kp。也稱為催化常數（Kcat）。1/kp稱為催化周期。碳酸酐酶是已知轉換數最高的酶之一，高達36×106每分，催化周期為1.7微秒。
D. 鎳柱純化蛋白後，鎳柱結塊了，怎麼辦
柱子的填料已經變形，要超聲處理，復性，加氯化鎳再生。
E. ni柱純化蛋白的原理，鎳柱純化總有一條雜蛋白怎麼辦
his標簽與鎳金屬離子的結合作用是ni柱純化蛋白的原理。
總有一條雜蛋白，有可能是非特異性結合。你可以嘗試優化蛋白洗脫方法，將你的目的蛋白與雜蛋白進行分離。
F. 蛋白純化過鎳柱以後為什麼會沉澱啊
蛋白濃度過高的時候，會發生聚集而沉澱。有些不易溶蛋白隨著鎳柱的專富集作用就會沉澱屬。
由於不知道你實驗目的，簡單認為你要純化表達的蛋白，解決方法：
1. 換更強親水肽段載體pet50（從酶切鏈接開始做），但是這樣會在表達出來蛋白中增加非目的蛋白成分
2. 不要用最佳濃度咪唑洗脫，用稍差一些的，這樣洗脫出來蛋白速度慢，濃度低，但是看你是否對濃度要求了。
3. 重新設計引物把輸水片段刪掉，這樣增加可溶性再表達純化
4. 考慮在沉澱里加入稀鹽，促溶。但不知對你實驗是否有影響
G. 純化蛋白得鎳柱使用後怎麼處理
你好，蛋白保存是個比較棘手的問題，就我的理解來講：蛋白的保存很大程度上依賴於蛋白本身的結構穩定性，其次和保存條件優化有關；盡量避免蛋白的反復凍融，這會對蛋白的結構和活性造成破壞；像你說到的第二天就要用，根本沒必要放在-70℃低溫，一般來講，盡量安排好實驗周期，在3天內用完蛋白（4℃保存）是理想條件；如果不得不保存，要分裝，留下馬上就用的放在4℃，其他放低溫，每次取1隻；如果有凍干機，凍成乾粉再放到-70比液態低溫更好，再溶解也會好很多（但很多蛋白還是會有失活問題）；關於保護劑，如果蛋白穩定性不強，一般會加甘油（5%-50%濃度）和疊氮鈉（抑菌），這樣一來，取出時，不得不做透析或脫鹽，以去除甘油和疊氮鈉，會帶來損失，相比而言，凍乾粉就好很多；關於咪唑的去除問題，如果確信咪唑的存在對你後續的實驗沒影響，可以不去；但實際上，很多實驗都會受到咪唑的影響，或者說一旦實驗有疑問，你就無法判定是否是因為咪唑，所以建議你去咪唑，去咪唑的方式包括：透析、濃縮管離心、脫鹽柱。個人認為，去除效率、最省時、蛋白回收率最高的法是脫鹽柱。我目前想到的就這么多，歡迎繼續討論，祝實驗順利！
H. 鎳柱純化後為什麼用平衡緩沖液平衡後即可再次使用
PMSF為蛋白酶抑制劑，在純化過程中，為了防止細菌本身的蛋白酶降解待純化的目的蛋白，通常在破碎菌體，上柱的過程中會加PMSF。使用時請注意防護，有毒。
I. 純化後的蛋白在含有高濃度nacl的情況下濃縮容易沉澱嗎
理由相信，濃度越高，對保存蛋白質越有利。加入 PEG 和更換 緩沖液種類是一種值得試驗的方法，但結果如何還在兩可之間，沒試過就不會知道。
鎳柱下來以後，溶液中混有相當多咪唑和議定含量的Ni，都有可能引起蛋白質不穩定變性沉澱。
我在純化一種蛋白質時，也遇到過相同的情況，雖然蛋白質不同，但是也許能有幫助。
鎳柱後，用含 EDTA 的緩沖液透析，除去 Ni ，再過 DEAE 離子交換柱，之後透析再濃縮，分裝小管，-80度保存。一次使用一支。
理論上說蛋白質應在高濃度情況下保存，但當緩沖溶液中含有大量鹽而且目的蛋白中含有大量輸水氨基酸的情況下，高濃度就不利於保存。
在這種情況下，如果你不想太多的稀釋蛋白，可以選擇適當脫鹽，如透析、凝膠過濾、超濾等，但應保持緩沖液具有一定的離子強度（500mM NaCl這個濃度太高，可以降到100），如果還不行的話，可以添加甘油至終濃度5%左右。
Ni純化最好不要用Tris，可能會影響Ni的結合。