酸蒸餾純化趕酸系統電源220v50hz溫度1040℃

Ⅰ 趕酸溫度和注意事項

一般趕酸溫度不要超過150度，因為長時間加熱會對消解管的壽命產生不利影響。

如果測汞，趕酸溫度一般在110左右，其他元素在130-150之間都可以。如果覺得趕酸時間太長或者酸氣腐蝕太嚴重，可以考慮真空趕酸系統。在140度下40分鍾可以把酸從8ml趕到1ml。並且所有酸蒸汽都被鹼液吸收。汞由於沸點偏低，是極易揮發元素，因此前處理過程中控制溫度尤為重要。

趕酸儀的使用注意事項：樣品處理需要用到各種不同的酸，如鹽酸、硝酸等。大部分酸具有揮發性而且對人體有害，因此建議在通風的環境下使用儀器，並做好各種防護措施。使用含HClO4的消解劑時，控制好HClO4量和消解溫度等條件，安全才有保障，否則有燃燒、爆炸的危險。

在說明書介紹的工作環境下使用，不用時要拔掉電源，清潔石墨塊表面污垢時，要用布輕擦，盡量不使用有機溶劑，不能損壞表面的塗層。儀器長期不用時，按說明書介紹的存儲環境存放。

Ⅱ 冰醋酸蒸餾溫度

冰醋酸蒸餾溫度：16攝氏度。

一般情況下混合物的沸點低於混合物中任意一個組分的沸點，其熔點16 .6℃，沸點117 .9℃，什麼溫度合適跟其中混有的其他組分的量和其熔沸點有關，如果是水的話在100℃應該沒問題，不過對於這些沸點稍高的物質建議回收時採用減壓蒸餾。

乙酸二聚物

乙酸的晶體結構顯示 ，分子間通過氫鍵結合為二聚體（亦稱二締結物），二聚體也存在於120℃的蒸汽狀態。二聚體有較高的穩定性，已經通過冰點降低測定分子量法以及X光衍射證明了分子量較小的羧酸如甲酸、乙酸在固態及液態，甚至氣態以二聚體形式存在。當乙酸與水溶和的時候，二聚體間的氫鍵會很快的斷裂。其它的羧酸也有類似的二聚現象。

以上內容參考：網路-乙酸

Ⅲ 有機實驗乙酸乙酯的制備中首次蒸餾為什麼要求蒸餾產物為反應物的1/2

常用有機溶劑的純化-丙酮 沸點56.2℃，折光率1.358 8，相對密度0.789 9。 普通丙酮常含有少量的水及甲醇、乙醛等還原性雜質。其純化方法有： ⑴於250mL丙酮中加入2.5g高錳酸鉀迴流，若高錳酸鉀紫色很快消失，再加入少量高錳酸鉀繼續迴流，至紫色不褪為止。然後將丙酮蒸出，用無水碳酸鉀或無水硫酸鈣乾燥，過濾後蒸餾，收集55~56.5℃的餾分。用此法純化丙酮時，須注意丙酮中含還原性物質不能太多，否則會過多消耗高錳酸鉀和丙酮，使處理時間增長。 ⑵將100mL丙酮裝入分液漏斗中，先加入4mL10%硝酸銀溶液，再加入3.6mL1mol/L氫氧化鈉溶液，振搖10min，分出丙酮層，再加入無水硫酸鉀或無水硫酸鈣進行乾燥。最後蒸餾收集55~56.5℃餾分。此法比方法⑴要快，但硝酸銀較貴，只宜做小量純化用。常用有機溶劑的純化－四氫呋喃 沸點67℃(64.5℃)，折光率1.405 0，相對密度0.889 2。四氫呋喃與水能混溶，並常含有少量水分及過氧化物。如要製得無水四氫呋喃，可用氫化鋁鋰在隔絕潮氣下迴流（通常1000mL約需2~4g氫化鋁鋰）除去其中的水和過氧化物，然後蒸餾，收集66℃的餾分蒸餾時不要蒸干，將剩餘少量殘液即倒出）。精製後的液體加入鈉絲並應在氮氣氛中保存。處理四氫呋喃時，應先用小量進行試驗，在確定其中只有少量水和過氧化物，作用不致過於激烈時，方可進行純化。四氫呋喃中的過氧化物可用酸化的碘化鉀溶液來檢驗。如過氧化物較多，應另行處理為宜。常用有機溶劑的純化－二氧六環 沸點101.5℃，熔點12℃，折光率1.442 4，相對密度1.033 6。二氧六環能與水任意混合，常含有少量二乙醇縮醛與水，久貯的二氧六環可能含有過氧化物（鑒定和除去參閱乙醚）。二氧六環的純化方法，在500mL二氧六環中加入8mL濃鹽酸和50mL水的溶液，迴流6~10h，在迴流過程中，慢慢通入氮氣以除去生成的乙醛。冷卻後，加入固體氫氧化鉀，直到不能再溶解為止，分去水層，再用固體氫氧化鉀乾燥24h。然後過濾，在金屬鈉存在下加熱迴流8~12h，最後在金屬鈉存在下蒸餾，壓入飢絲密封保存。精製過的1,4-二氧環己烷應當避免與空氣接觸。常用有機溶劑的純化－吡啶沸點115.5℃，折光率1.509 5，相對密度0.981 9。分析純的吡啶含有少量水分，可供一般實驗用。如要製得無水吡啶，可將吡啶與粒氫氧化鉀（鈉）一同迴流，然後隔絕潮氣蒸出備用。乾燥的吡啶吸水性很強，保存時應將容器口用石蠟封好。常用有機溶劑的純化－石油醚石油醚為輕質石油產品，是低相對分子質量烷烴類的混合物。其沸程為30~150℃，收集的溫度區間一般為30℃左右。有30~60℃，60~90℃，90~120℃等沸程規格的石油醚。其中含有少量不飽和烴，沸點與烷烴相近，用蒸餾法無法分離。石油醚的精製通常將石油醚用其體積的濃硫酸洗滌2~3次，再用10%硫酸加入高錳酸鉀配成的飽和溶液洗滌，直至水層中的紫色不再消失為止。然後再用水洗，經無水氯化鈣乾燥後蒸餾。若需絕對乾燥的石油醚，可加入鈉絲（與純化無水乙醚相同）。常用有機溶劑的純化－甲醇 沸點64.96℃，折光率1.328 8，相對密度0.791 4。普通未精製的甲醇含有0.02%丙酮和0.1%水。而工業甲醇中這些雜質的含量達0.5%~1%。為了製得純度達99.9%以上的甲醇，可將甲醇用分餾柱分餾。收集64℃的餾分，再用鎂去水（與制備無水乙醇相同）。甲醇有毒，處理時應防止吸入其蒸氣。 常用有機溶劑的純化－乙酸乙酯沸點77.06℃，折光率1.372 3，相對密度0.900 3。乙酸乙酯一般含量為95%~98%, 含有少量水、乙醇和乙酸。可用下法純化：於1000mL乙酸乙酯中加入100mL乙酸酐，10滴濃硫酸，加熱迴流4h，除去乙醇和水等雜質，然後進行蒸餾。餾液用20~30g無水碳酸鉀振盪，再蒸餾。產物沸點為77℃，純度可達以上99%。常用有機溶劑的純化－乙醚沸點34.51℃，折光率1.352 6，相對密度0.713 78。普通乙醚常含有2%乙醇和0.5%水。久藏的乙醚常含有少量過氧化物過氧化物的檢驗和除去：在干凈和試管中放入2~3滴濃硫酸，1mL2%碘化鉀溶液（若碘化鉀溶液已被空氣氧化，可用稀亞硫酸鈉溶液滴到黃色消失）和1~2滴澱粉溶液，混合均勻後加入乙醚，出現藍色即表示有過氧化物存在。除去過氧化物可用新配製的硫酸亞鐵稀溶液（配製方法是FeSO4?H2O60g，100mL水和6mL濃硫酸）。將100mL乙醚和10mL新配製的硫酸亞鐵溶液放在分液漏斗中洗數次，至無過氧化物為止。醇和水的檢驗和除去：乙醚中放入少許高錳酸鉀粉末和一粒氫氧化鈉。放置後，氫氧化鈉表面附有棕色樹脂，即證明有醇存在。水的存在用無水硫酸銅檢驗。先用無水氯化鈣除去大部分水，再經金屬鈉乾燥。其方法是：將100mL乙醚放在乾燥錐形瓶中，加入20~25g無水氯化鈣，瓶口用軟木塞塞緊，放置一天以上，並間斷搖動，然後蒸餾，收集33~37℃的餾分。用壓鈉機將1g金屬鈉直接壓成鈉絲放於盛乙醚的瓶中，用帶有氯化鈣乾燥管的軟木塞塞住。或在木塞中插一末端拉成毛細管的玻璃管，這樣，既可防止潮氣浸入，又可使產生的氣體逸出。放置至無氣泡發生即可使用；放置後，若鈉絲表面已變黃變粗時，須再蒸一次，然後再壓入鈉絲。常用有機溶劑的純化－乙醇 沸點78.5℃，折光率1.361 6，相對密度0.789 3。制備無水乙醇的方法很多，根據對無水乙醇質量的要求不同而選擇不同的方法。若要求98%~99%的乙醇，可採用下列方法： ⑴利用苯、水和乙醇形成低共沸混合物的性質，將苯加入乙醇中，進行分餾，在64.9℃時蒸出苯、水、乙醇的三元恆沸混合物，多餘的苯在68.3與乙醇形成二元恆沸混合物被蒸出，最後蒸出乙醇。工業多採用此法。 ⑵用生石灰脫水。於100mL95%乙醇中加入新鮮的塊狀生石灰20g，迴流3~5h，然後進行蒸餾。若要99%以上的乙醇，可採用下列方法： ⑴在100mL99%乙醇中，加入7g金屬鈉，待反應完畢，再加入27.5g鄰苯二甲酸二乙酯或25g草酸二乙酯，迴流2~3h，然後進行蒸餾。金屬鈉雖能與乙醇中的水作用，產生氫手和氫氧化鈉，但所生成的氫氧化鈉又與乙醇發生平衡反應，因此單獨使用金屬鈉不能完全除去乙醇中的水，須加入過量的高沸點酯，如鄰苯二甲酸二乙酯與生成的氫氧化鈉作用，抑制上述反應，從而達到進一步脫水的目的。 ⑵在60mL99%乙醇中，加入5g鎂和0.5g碘，待鎂溶解生成醇鎂後，再加入900mL99%乙醇，迴流5h後，蒸餾，可得到99.9%乙醇。由於乙醇具有非常強的吸濕性，所以在操作時，動作要迅速，盡量減少轉移次數以防止空氣中的水分進入，同時所用儀器必須事前乾燥好。 常用有機溶劑的純化－DMSO 沸點189℃，熔點18.5℃,折光率1.4783，相對密度1.100。二甲基亞碸能與水混合，可用分子篩長期放置加以乾燥。然後減壓蒸餾，收集76℃/1600Pa(12mmHg)餾分。蒸餾時，溫度不可高於90℃，否則會發生歧化反應生成二甲碸和二甲硫醚。也可用氧化鈣、氫化鈣、氧化鋇或無水硫酸鋇來乾燥，然後減壓蒸餾。也可用部分結晶的方法純化。二甲基亞碸與某些物質混合時可能發生爆炸，例如氫化鈉、高碘酸或高氯酸鎂等應予注意。常用有機溶劑的純化－DMF N，N-二甲基甲醯胺 沸點149~156℃，折光率1.430 5，相對密度0.948 7。無色液體，與多數有機溶劑和水可任意混合，對有機和無機化合物的溶解性能較好。 N，N-二甲基甲醯胺含有少量水分。常壓蒸餾時有些分解，產生二甲胺和一氧化碳。在有酸或鹼存在時，分解加快。所以加入固體氫氧化鉀（鈉）在室溫放置數小時後，即有部分分解。因此，最常用硫酸鈣、硫酸鎂、氧化鋇、硅膠或分子篩乾燥，然後減壓蒸餾，收集76℃/4800Pa(36mmHg)的餾分。其中如含水較多時，可加入其1/10體積的苯，在常壓及80℃以下蒸去水和苯，然後再用無水硫酸鎂或氧化鋇乾燥，最後進行減壓蒸餾。純化後的N，N-二甲基甲醯胺要避光貯存。 N，N-二甲基甲醯胺中如有游離胺存在，可用2，4二硝基氟苯產生顏色來檢查。常用有機溶劑的純化－二氯甲烷沸點40℃，折光率1.424 2，相對密度1.326 6。使用二氯甲烷比氯仿安全，因此常常用它來代替氯仿作為比水重的萃取劑。普通的二氯甲烷一般都能直接做萃取劑用。如需純化，可用5%碳酸鈉溶液洗滌，再用水洗滌，然後用無水氯化鈣乾燥，蒸餾收集40~41℃的餾分，保存在棕色瓶中。沸點101.5℃，熔點12℃，折光率1.442 4，相對密度1.033 6。二氧六環能與水任意混合，常含有少量二乙醇縮醛與水，久貯的二氧六環可能含有過氧化物（鑒定和除去參閱乙醚）。二氧六環的純化方法，在500mL二氧六環中加入8mL濃鹽酸和50mL水的溶液，迴流6~10h，在迴流過程中，慢慢通入氮氣以除去生成的乙醛。冷卻後，加入固體氫氧化鉀，直到不能再溶解為止，分去水層，再用固體氫氧化鉀乾燥24h。然後過濾，在金屬鈉存在下加熱迴流8~12h，最後在金屬鈉存在下蒸餾，壓入飢絲密封保存。精製過的1,4-二氧環己烷應當避免與空氣接觸。常用有機溶劑的純化－二硫化碳沸點46.25℃，折光率1.631 9，相對密度1.2632。二硫化碳為有毒化合物，能使血液神經組織中毒。具有高度的揮發性和易燃性，因此，使用時應避免與其蒸氣接觸。對二硫化碳純度要求不高的實驗，在二硫化碳中加入少量無水氯化鈣乾燥幾小時，在水浴55℃~65℃下加熱蒸餾、收集。如需要制備較純的二硫化碳，在試劑級的二硫化碳中加入0.5%高錳酸鉀水溶液洗滌三次。除去硫化氫再用汞不斷振盪以除去硫。最後用2.5%硫酸汞溶液洗滌，除去所有的硫化氫（洗至沒有惡臭為止），再經氯化鈣乾燥，蒸餾收集。常用有機溶劑的純化－氯仿沸點61.7℃，折光率1.445 9，相對密度1.483 2。氯仿在日光下易氧化成氯氣、氯化氫和光氣（劇毒），故氯仿應貯於棕色瓶中。市場上供應的氯仿多用1%酒精做穩定劑，以消除產生的光氣。氯仿中乙醇的檢驗可用碘仿反應；游離氯化氫的檢驗可用硝酸銀的醇溶液。除去乙醇可將氯仿用其二分之一體積的水振搖數次分離下層的氯仿，用氯化鈣乾燥24h，然後蒸餾。另一種純化方法：將氯仿與少量濃硫酸一起振動兩三次。每200mL氯仿用10mL濃硫酸，分去酸層以後的氯仿用水洗滌，乾燥，然後蒸餾。除去乙醇後的無水氯仿應保存在棕色瓶中並避光存放，以免光化作用產生光氣。常用有機溶劑的純化-苯 沸點80.1℃，折光率1.501 1，相對密度0.87865。普通苯常含有少量水和噻吩，噻吩和沸點84℃，與苯接近，不能用蒸餾的方法除去。噻吩的檢驗：取1mL苯加入2mL溶有2mg吲哚醌的濃硫酸，振盪片刻，若酸層號藍綠色，即表示有噻吩存在。噻吩和水的除去：將苯裝入分液漏斗中，加入相當於苯體積七分之一的濃硫酸，振搖使噻吩磺化，棄去酸液，再加入新的濃硫酸，重復操作幾次，直到酸層呈現無色或淡黃色並檢驗無噻吩為止。將上述無噻吩的苯依次用10%碳酸鈉溶液和水洗至中性，再用%C 蒸餾液體沸點在140℃以下時，用水冷凝管；沸點在140℃ 以上者，如用水冷凝管，在冷凝管接頭處容易爆裂，故應改用空氣冷凝管。蒸餾低沸點易燃或有毒液體時，可在尾接管的支接管接一根長橡皮管，通入水槽的下水管內或引入室外，並將接受瓶在冰水浴中冷卻。如果蒸餾出的產品易潮分解，可在尾接管的支管處接一個氯化鈣乾燥管，以防潮氣進入。使用水冷凝管時，冷凝水應從冷凝管的下口流入，上口流出，以保證冷凝管的套管內充滿水。水冷凝管的種類很多，常用的為直形冷凝管。 安裝儀器的順序一般都是自下而上，從左到右。要穩妥端正，無論從正面或側面觀察，全套儀器裝置的軸線都要在同一平面內。 2．蒸餾操作 加料：將待蒸餾液通過玻璃漏斗小心倒入蒸餾瓶中，要注意不使液體從支管流出。加入幾粒助沸物，安好溫度計。再一次檢查儀器的各部分連接是否緊密和妥善。 加熱：用水冷凝管時，先由冷凝管下口緩緩通入冷水，自上口流出引至水槽中，然後開始加熱。加熱時可以看見蒸餾瓶中的液體逐漸沸騰，蒸氣逐漸上升。溫度計的讀數也略有上升。當蒸氣的頂端到達溫度計水銀球部位時，溫度計讀數就急劇上升。這時應適當調小煤氣燈的火焰或降低加熱電爐或電熱套的電壓，使加熱速度略為減慢，蒸氣頂端停留在原處，使瓶頸上部和溫度計受熱，讓水銀球上液滴和蒸氣溫度達到平衡。然後再稍稍加大火焰，進行蒸餾。控制加熱溫度，調節蒸餾速度，通常以每秒1～2滴為宜。在整個蒸餾過程中，應使溫度計水銀球上常有被冷凝的液滴。此時的溫度即為液體與蒸氣平衡時的溫度，溫度計的讀數就是液體（餾出物）的沸點。蒸餾時加熱的火焰不能太大，否則會在蒸餾瓶的頸部造成過熱現象，使一部分液體的蒸氣直接受到火焰的熱量，這樣由溫度計讀得的沸點就會偏高；另一方面，蒸餾也不能進行得太慢，否則由於溫度計的水銀球不能被餾出液蒸氣充分浸潤使溫度計上所讀得的沸點偏低或不規范。 觀察沸點及收集餾液：進行蒸餾前，至少要准備兩個接受瓶。因為在達到預期物質的沸點之前，帶有沸點較低的液體先蒸出。這部分餾液稱為「前餾分」或「餾頭」。前餾分蒸完，溫度趨於穩定後，蒸出的就是較純的物質，這時應更換一個潔凈乾燥的接受瓶接受，記下這部分液體開始餾出時和最後一滴時溫度計的讀數，即是該餾分的沸程（沸點范圍）。一般液體中或多或少地含有一些高沸點雜質，在所需要的餾分蒸出後，若再繼續升高加熱溫度，溫度計的讀數會顯著升高，若維持原來的加熱溫度，就不會再有餾液蒸出，溫度會突然下降。這時就應停止蒸餾。即使雜質含量極少，也不要蒸干，以免蒸餾瓶破裂及發生其他意外事故。 蒸餾完畢，應先停止加熱，然後停止通水，拆下儀器。拆除儀器的順序和裝配的順序相反，先取下接受器，然後拆下尾接管、冷凝管、蒸餾頭和蒸餾瓶等

Ⅳ 純化水設備怎麼做安裝確認呢

本文來自：深圳市科瑞環保設備有限公司
（一）純化水設備安裝確認所需文件

①由質量部門或技術部門認可的流程圖、系統描述及設計參數；

②純化水設備及管路安裝調試記錄；

③儀器儀表的鑒定記錄；

④設備操作手冊及標准操作、維修規程。

（二）純化水設備安裝確認的主要內容

純化水設備的安裝確認主要是根據生產要求，檢查水處理設備和管道系統的安裝是否合格，檢查儀表的校準以及操作、維修規程的編寫。

1.純化水設備的安裝確認

純化水的安裝確認是指機器設備安裝後，對照設計圖紙及供應商的技術資料，檢查安裝是否符合設計及規范。純化水處設備主要有機械過濾器、活性炭過濾器、水泵、(蒸餾水機)等，檢查的項目有電氣、連接管道、蒸汽、儀表、供水、過濾器等的安裝、連接情況。

2.純化水設備管道分配系統的安裝確認

（1）管道及閥門的材料

管道選用不銹鋼（304、316L等型號）。不銹鋼材料的特點是：①鈍化後呈化學惰性；②易於消毒；③工作溫度范圍廣。

（2）管道的連接和試壓

如前所述，純化水輸送管道應採用熱熔式氬弧焊焊接，要求內壁光滑，應檢查焊接質量。一般採用自動氬弧熱熔式焊機，根據設備手冊先確定焊接控制參數，如電流大小、頻率等，然後再按照此焊接參數幾個接頭，如符合要求，以後在安裝時可控制在這些焊接參數內，可保證焊縫平整光滑。焊接結束後再用去離子水進行試壓，實驗壓力為工作壓力的1.5倍，無滲漏為合格。

（3）管道的清洗、鈍化、消毒

不銹鋼管道的處理（清洗、鈍化、消毒）可大致分為純化水循環預沖洗→鹼液循環清洗→純化水沖洗→鈍化→純化水再次沖洗→排放→純蒸汽消毒等幾個步驟。

①純化水循環預沖洗：用一個貯液罐和一台水泵，與需鈍化的管道連成一個循環通路，在貯液罐中注入足夠的常溫去離子水，用水泵加以循環，15min後打開排水閥，邊循環邊排放，最好能裝一隻流量計。

②鹼液循環清洗：准備NaOH化學純試劑，加入熱水（溫度不低於70℃）配置成1%（體積濃度）的鹼液，用泵進行循環，時間不少於30min，然後排放。

③沖洗：將純化水加入，啟動水泵，打開排水閥排放，直到各出口點水的電阻率與罐中水的電阻率一致，排放時間至少30min。

④鈍化：a.用純化水及化學純的硝酸配製8%的酸液，在49～52℃溫度下循環60min後排放。b.或用3%氫氟酸（體積分數）、20%硝酸（體積分數）、77%純化水配製溶液，溶液溫度在25～35℃，循環處理10～20min。然後排放。

⑤初始沖洗：用常溫純化水沖洗，時間不少於5min。

⑥最後沖洗：再次沖洗，直到進、出口純化水的電阻率一致。

⑦純蒸汽消毒：將清潔蒸汽通入整個不銹鋼管道系統，每個使用點至少沖洗15min。

上述清洗、鈍化、消毒過程及其參數應加以記錄。

（4）完整性試驗

貯水罐上安裝的各種通氣過濾器必須做完整性試驗。

（三）儀器儀表的校準

純化水設備上所有的儀器儀表必須定期校驗或認可，使誤差控制在允許的范圍內。純化水設備常用的儀表有：電阻（導）儀、時間控制器、流量計、溫度控制儀/記錄儀、壓力表以及分析水質用的各種儀器。需要強調的是紫外燈（UV）等應引起格外的重視，紫外燈校準的參數是：波長、光強度以及顯示使用時間的時鍾。

（四）操作手冊

列出純化水設備中所有設備操作手冊和日常操作、維修單。

註：一般的水處理公司都會上門幫你安裝服務的。

Ⅳ 測鉛前處理用的硝酸濃度是多大的

測鉛前處理用的硝酸濃度是多大的
HNO3-HCLO4消化測量重金屬,首先了解濕法消化
濕法消化：又稱濕灰化法或濕氧化法，在適量的食品中加入氧化性強酸，並同時加熱消煮，使有機物質分解氧化成CO2，水和各種氣體，為加速氧化進行，可同時加入各種催化劑，這種破壞食品中有機物質的方法就叫做濕法消化。含有大量有機物的生物樣品通常採用混酸進行濕法消解，用於濕法消解的混酸包括HN03-HCLO4、HN03-HCl03-HClO4、HNo3-HClO4-H2SO4、HN03-H2S04、H2SO4-H2O2和HNO3-H202。其中沸點在120℃以上的硝酸是廣泛使用的預氧化劑，它可破壞樣品中的有機質；硫稿鄭拍酸具有強脫水能力，可使有機物炭化，使難溶物質部分降解並提高混合酸的沸點；熱的高氯酸是最強的氧化劑和脫水劑，由於其沸點較高，可在除去硝酸以後繼續氧化樣品。在含有硫酸的混合酸中過氧化氫的氧化作用是基於過一硫酸的形成，由於硫酸的脫水作用，該混合溶液可迅速分解有機物質。當樣品基體含有較多的無機物時，多採用含鹽酸的混合酸進行消解；而氫氟酸主要用於分解含硅酸鹽的樣品。酸消化通常在玻璃或聚四氟乙烯容器中進行。由於濕法消解過程中的溫度一般較低(<200℃)，待測物不容易發生揮發損失，也不易與所用容器發生反應，但有時會發生待測物與消解混合液中產生的沉澱發生共沉澱的現象，其中最常見的例子就是當用含硫酸的混合酸分解高鈣樣品時，樣品中待測的鉛會與分解過程中形成的硫酸鈣產生共沉澱，從而影響鉛的測定。
做濕法消解時一般用硝酸+高氯酸或濃硫酸+高氯酸,比例一般為4:1,但如果你的樣品是高脂肪,高蛋白,高糖的話比例應用5:1,這是防止在加熱消解過程中爆沸.消解終點應是開始冒白色煙霧即可,最後再加蒸餾水趕酸,也是有白色煙霧即可.
1、溶液顏色還是處於深棕色時瓶口卻開始冒白煙了，這是不是高氯酸揮發沒了，這時是應添加適量的硝酸還是硝酸和高氯酸的混合酸（4：1）？並不是高氯酸揮發沒了,這時候你應該加適量硝酸,因為高氯酸在製作工藝容易中含有鉛污染,如果你樣品多加了,而空白沒加的話,造成結果偏差.。濕法消解容易造成空白較高，大多數試劑廠家的硝酸含鉛量都不低。
2、怎麼樣控制溶液防止消化過程中炭化，如果出現炭化對結果有多大影響？最好用燒杯並在上面加蓋表面皿迴流或者用三角瓶上加一漏斗。另外注意消解的溫度，剛開始消解時溫度不能太高，先在100度消解，等紅棕色煙散後慢慢提高溫度。硝酸的沸點在130度，高氯酸在200度以上。如果消解時出現碳化的趨勢應取下放置到室溫後繼續加混合酸消解，直到樣品清亮透明。.消化過程中顏色一變深就馬上加幾滴硝酸,讓顏色變回來.盡量避免炭化，測定鉛的話炭化的影響不大,但要絕對避免燒干,這樣鉛就跑沒了.
3、趕酸時如果白色煙霧沒有排凈，還需要加水繼續趕酸嗎？如果趕酸趕不幹凈的話，是不是對照樣的吸光度會偏高？
趕酸與否要看測定的元素還有是否採用火焰等，大部份金屬元素濕法消解上AAS是不用趕酸的,但是一定要把溶液裡面的氮氧化物(加了硝酸後的那些黃煙)趕掉大部分,一般的話都要求基體要有酸介質,所以不用蒸干,但有的要蒸干再補加鹽酸及水..
濕法消解操作簡便，可一次處理較大量樣品，適用於生物樣品中痕量金屬元素分析。該法的缺點是：①若要將樣品完全消解需要消耗大量的酸，且需高溫加熱(必要時溫度>300℃)，從而導致器壁及試劑給樣品帶來沾污，消解前將所用容器用1：1HN03加熱清洗並將所用酸溶液進行亞沸蒸餾可除去其中的微量金屬元素干擾；②某些混酸對消解後元素的光譜測定存在干擾，例如當溶液中含有較多的HClO4或H2SO4時會對叢岩元素的石墨爐原子吸收測定帶來干擾，測定前將溶液蒸發至近鍵羨干可除去此類干擾。3濕法消解時間長，比如豬肉含油脂比較多，相對蔬菜來說比較難消化，茶葉消解過程中會產氣泡，途中需取下冷卻一下，白酒、黃酒在消解前需先蒸至小體積。目前一種新型的消解技術已越來越受到人們的關注，那就是微波消解。
微波消解原理：通常,介質材料由極性分子和非極性分子組成。在電磁場作用下,極性分子從原來的隨機分布狀態轉向按照電場的極性排列取向。在高頻電磁作用下,這些取向按交變電磁場的變化而變化,極性分子在微波電磁場中快速旋轉和離子在微波場中的快速遷移、相互摩擦,迅速提高反應物溫度,激發分子高速度旋轉和振動,使之處於反應的准備狀態或亞穩態,促使物質與酸等試劑發生反應被消解。
微波消解技術具有高效快速、試劑用量少、環境污染小等優點。1．加熱快、升溫高，消解能力強，大大縮短了溶樣時間。
消解各類樣品可在幾分鍾—二十幾分鍾內完成，比電熱板消解速度快10-100倍。如凱氏定氮法消解試樣需3-6小時，用微波消解只需9-18分鍾，快20倍左右。還能消解許多傳統方法難以消解的樣品，如鋯英石。快速消解的原因來自於微波對樣品溶液的直接加熱和罐內迅速形成的高溫高壓。這點我們後面還要講。
2.消耗政溶劑少，空白位低。
消解一個樣品一般只需15ml的酸溶液，只有傳統方法用酸量的幾分之一。因為密閉消解酸不會揮發損失，不必為保持酸的體積而繼續加酸，節省了試劑，也大大降低了分析空白值,減少了試劑帶入的雜質元素的干擾，空白值明顯減小了。
3.避免了揮發損失和樣品的沾污，提高了分析的准確度和精密度，回收率實驗獲得令人滿意的結果。
採用密閉的消解罐，避免了樣品中或在消解過程中形成的揮發性組份的損失，保證了測量結果的准確性。也避免了樣品之間的相互污染和外部環境的污染，適於痕量及超純分析和易揮發元素（如As、Hg）的檢測。電熱板上加熱揮發性成分跑掉了，空氣中的灰塵等落入燒杯，或幾個杯子靠近，濺出物相互污染。揮發損失少了，試劑帶入的干擾元素少了，受污染的情況也減少了，自然回收率實驗更滿意。微波消解系統能實時顯示反應過程中密閉罐內的壓力、溫度和時間三個參數。並能准確控制，反應的重復性好，准確度和精密度都提高了。
4.降低了勞動強度，改善了工作環境.
過去，在電熱板上煮酸，消解樣品，盡管有通風櫃，仍然是周圍酸霧繚繞。不僅分析人員深受其害，也腐蝕了實驗室內其他設備。現在在密閉的罐中消解，揮發的酸大大減少，有效的改善了分析人員的工作環境。由於消解樣品的速度加快，分析時間縮短，同時分析的准確度與精密度又得以提高，顯著的降低了勞動強度提高了工作效率。
5.節省電的消耗，降低分析成本。
微波密閉消解不僅節省試劑，還節省電能。如：消解1克奶粉，用800W微波加熱，只需8分鍾消解完畢。而用1.5KW的電熱板加熱需3個小時，不僅時間縮短到1/22，耗電量也下降到1/26，降低了分析成本。
微波制樣具有這許多優點,使它具有極強的生命力。

Ⅵ 為什麼可以用水蒸餾法純化肉桂酸的粗產品

肉桂酸在水裡的溶解度小，與水不發生反應，而且有一定的蒸汽壓。

Ⅶ 請問有誰知道核酸引物和探針PAGE純化的步驟

第20章 細胞基因分離鑒定和原位雜交

第一節 細胞DNA、RNA的分離鑒定技術

一、培養細胞基因組DNA的提取及鑒定
人和哺乳動物細胞基因組DNA的分離通常是在有EDTA、Sarkosye等一類去污劑存在下，用蛋白酶K消化細胞，隨後用酚、氯仿抽提，經RNase處理和純化來提取DNA，可用於細胞凋亡中對所引起DNA斷裂、凝膠電泳呈現「梯形」條帶的實驗，在細胞凋亡章節中已介紹了有關DNA的提取和凝膠電泳鑒定，除此之外，提取純化的DNA還可用於分析其結構，序列限制性內切酶片斷長度多態性及其基因定位和克隆。
(一)DNA提取方法：
(1)取單層細胞，經無鈣、鎂PBS洗一次，用0.25%胰蛋白酶消化，細胞懸液經PBS洗2次,棄上清，取細胞沉澱。
(2)加入2ml細胞裂解液(10mM Tris HCL，pH8.0，0.1mol/L EDTA，10mmol/L NaCL，1%SDS)充分混勻，加入蛋白酶K至終濃度為0.5～1g/L、Sarkosye終濃度為0.5%，混勻裂解蛋白呈糊狀。
(3)50℃水浴2小時，轉入37℃水浴過夜，次日加入等體積的飽和酚，輕輕顛倒混勻，以防止DNA斷裂，約3分鍾。
12000r/min離心15分鍾（室溫）
(4)取水相，再加入等體積酚/氯仿(1:1),同樣顛倒混勻，去除蛋白質
12000 r/min離心15分鍾（室溫）
(5)再重復步驟(4)，再用等體積酚/氯仿(1:1)抽提一次
(6)取水相，再加入等體積氯仿，去除酚及蛋白質，顛倒混勻
12000 r/min離心15分鍾（室溫）
(7)取水相，加入2倍體積的預冷無水乙醇，沉澱DNA，混勻-20℃放置1小時
12000 r/min離心15分鍾（室溫）
(8)用70%乙醇洗滌一次，按上法離心將沉澱真空乾燥10分鍾。
(9)加入RNase A至終濃度100mg/L，37℃水浴消化1小時，消化污染的RNA。
(10)加入蛋白酶K至終濃度0.4g/L、Sarkosye至終濃度0.5%，混勻，50℃水浴2小時，加入Nace至終濃度10mmol/L。
(11)用等體積飽和酚各抽提一次，步驟同前。
(12)吸上清，加入氯仿/異戊醇(24:1)，按上法再抽一次。
(13)取水相，加入2倍體積預冷無水乙醇，-20℃ 1小時。
(14)取沉澱用70%乙醇洗一次，真空乾燥10分鍾後溶於少量TE中，4℃貯存。
(二)DNA純度檢測及含量計算
DNA濃度用紫外分光光度計測定，核酸的光吸收值位於波長260nm處，蛋白質則位於280nm，分別測定後，其OD260/OD280的比值應大於1.75.低於此值，說明DNA中仍殘留較多的蛋白質，此時可用酚、氯仿繼續抽提純化。若比值大於1.9表明DNA鏈破壞，斷裂嚴重，已成為小分子，因此操作應輕柔。
取少許DNA溶液，經紫外線掃描，吸收峰值位於波長260nm處，其純度應為OD260/OD280=1.8
OD260值為1的溶液大約含50μg/mL DNA，故DNA的濃度(μg/mL)=OD260值×50mg/L×稀釋倍數。
DNA總量(μg)=DNA濃度(μg/mL)×總體積(mL)
DNA分子量大小測定，可用含溴化乙錠的1%瓊脂凝膠電泳法測定，根據加入標准品片斷的電泳遷移距離計算樣品片斷分子量大小，此技術還可用作分離基因組DNA，進一步進行Southern吸印分析。
二、培養細胞總RNA的提取及鑒定
細胞中含有三類RNA即rRNA、mRNA和tRNA，其中mRNA傳遞蛋白質全部遺傳信息是克隆表達功能性蛋白基因的最佳來源，是蛋白質合成的場所,有特殊意義,不同的細胞所表達某種蛋白的mRNA的種類和產量是不同的，為了提高細胞轉錄的mRNA的種類和產量，通常需加入誘導劑來對細胞進行刺激培養，如抗原、病毒、PHA、ConA、LPS等。
提取細胞總RNA的方法，常用強烈變性劑如鹽酸胍溶液處理細胞，我們在細胞凋亡的bcl-2基因的RT-PCR法基因克隆中介紹了異硫氰酸胍一步法，但不純，本文介紹用鹽酸胍來裂解細胞可導致細胞結構破壞，核蛋白二級結構破壞，可利於提取總RNA，也可從總RNA中提取mRNA，從而分析mRNA表達量，建立cDNA文庫，以及對mRNA的調控和進行反義RNA研究。
變性液：7mol/L鹽酸胍，25m mol/L棕檬酸鈉pH7.0，0.5%Sarkosye，0.1mol/L β-巰基乙醇。
水平衡酚：在飽和酚中加入等體積DEPC處理的三蒸水(或新鮮無菌的三蒸水)混勻後去除水相，再重復處理二次即可。
所用玻璃、塑料製品、金屬器材可用0.1% DEPC水浸泡過夜後消毒無菌，其中玻璃、金屬器材也可用180℃干烤6小時，以去除被污染的RNA酶。
(一)總RNA的提取方法：
1、消化收集細胞方法同前。
2、向離心管中的細胞沉澱物中加1.5mL變性液，立即充分混勻。
3、加入1.5mL水平衡酚、0.15ml 2mol/L乙酸鈉PH4.0、以及0.05mL氯仿，劇烈振盪混勻30秒後，立即置冰上放置15分鍾，4℃ 12000r/min離心15分鍾。
4、取水相，加入等體積酚/氯仿(1:1)混勻，劇烈振盪10分鍾，4℃12000rpm離心15分鍾。
5、取水相，加入等體積氯仿，劇烈振盪10分鍾，再同上離心，再如此反復抽提一次後取水相，加入等體積的預冷的異丙醇(或異戊醇)混勻，低溫放置20分鍾，再同上離心。
6、取沉澱用70%預冷乙醇洗兩次，乾燥10分鍾，溶於DEPC處理的三蒸水中以溶解RNA，分裝,-20℃凍存。
(二)總RNA的鑒定及含量計算
1、RNA純度及含量測定
取少量提取的RNA，經紫外線掃描，吸收峰位於波長260nm處，RNA純度為OD260/OD280=1.8～2。
OD260值為1的RNA溶液約含有40μg/mL，故RNA濃度(μg/mL)=OD260值×40μg/mL×稀釋倍數。
2、RNA分子量大小鑒定
2.1 配液：
(1)10×MOPS電泳緩沖液配製
將41.2g[2-(N-瑪琳代)丙磺鹼，2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid，MOPS]溶於800mL經DEPC處理的50mmol/L乙酸鈉液中，用2mol/L NaoH調整pH至7.0，加入20mL經DEPC處理的0.5mol/L EDTA(pH8.0)，再加經DEPC處理的水至總體積為1000mL過濾除菌，避光室溫保存。
(2)甲醛加樣緩沖液：1mmol/L EDTApPH8.0、0.25%溴酚蘭、0.25%二甲苯青FF、
50%甘油
2.2 操作步驟：
(1)制平板膠：1.2%瓊脂糖煮沸，冷卻至60℃，加入10×MOPS緩沖液及甲醛溶液，使三者的比例為3.5:1.1:1，或三者的終濃度分別為1.2%、1及10%，於室溫放置30分鍾或更長時間，使膠凝固。
(2)在無菌離心管中混合下列液體。
RNA(最多30μg) 4.5uL
10×MOPS電泳緩沖液 1.0uL
甲醛 3.5uL
65℃溫育15分鍾，水浴冷卻、離心
(3)加入2ul DEPC處理的加樣緩沖液上樣，進行電泳，5V/cm電壓，3小時直到溴酚蘭至膠的中部，可用已知RNA標本作分子量標准品，如28srRNA或9S兔β-球蛋白mRNA。
(4)電泳完畢，取出凝膠，浸泡在溴化乙錠溶液中(終濃度0.5g/L)染色30～45分鍾，紫外透射儀觀察分子量大小。

第二節 核酸蛋白轉移電泳及雜交

一、DNA Southern Blot及雜交
本技術可用於基因組DNA特定序列定位，尤其可分析某些基因的限制性內切酶長度多態性，對遺傳性疾病的早期基因診斷、產前診斷或基因變異等方面的研究有應用價值，其過程包括：樣品DNA內切酶水解、水解片斷的瓊脂糖凝膠電泳分離、分離後水解片斷的轉移(固定)、特異性DNA片斷的分子雜交及放射自顯影。
(一)樣品DNA內切酶水解
限制性內切酶(RE)可裂解雙鏈DNA，每種酶其特點是具有高度特異性的DNA裂解點和不同電離子強度的特殊反應條件。不同產品其反應條件不同，應根據說明書操作。單位(U)RE活性是在37℃ 1小時內能將1μg DNA所有特異性位點切斷的酶用量。若用兩種以上不同的內切酶，要注意RE的最適鹽濃度，要由低向高逐級添加適量鹽逐個進行DNA切割。
1、配液：10×限制性酶消化緩沖液
10×buffer O—無鹽：100mmol/L Tris HCL pH7.4
1mg/mL BSA
100mmoL/L MgCL2
10mmol/L DTT(二硫蘇糖醇)
10×bnffer L—低鹽：緩沖液O
0.5mol/L Nacl
10×bnffer H—高鹽：緩沖液O
1.0mol/L Nacl
2、操作步驟：
(1)將DNA(0.2～1.0μg)溶液加入EP管中,並加入適量H2O總體積為18μL，混勻。
(2)加入2mL 10×限制酶緩沖液，根據廠家建議的鹽濃度選擇不同的緩沖液。
(3)加1～2U限制性內切酶充分混合。
(4)37℃溫育適當時間，時間需先進行預試驗，摸索所需消化的時間，通常用瓊脂糖凝膠電泳鑒定，酶解充分，各片斷分子量從大到小分布均勻。
(5)加入0.5mol/L EDTA pH8.0使達到終濃度為10mmol/L終止反應。
(6)消化後的DNA直接進行瓊脂糖電泳，方法同前，可用於分析或Southern Blot。
(二)Southern Blot及雜交。
將經電泳走在瓊脂糖中的DNA變性、中和後，以毛細管作用在高鹽緩沖液中轉移至硝酸纖維膜上，再用放射性探針檢測與之雜交的DNA。
1、配液：
(1)變性溶液：1.5mol/L Nacl 0.5mol/L NaoH
(2)中和溶液：200mL 20×SSC
100mL 1mol/L HCL
100mL 1mol/L Tris HCL pH8.0加水至500mL。
(3)20×SSC： 在800mlH2O中溶解175.3g Nacl和88.2g檸檬酸鈉，加入數滴10mol/L NaoH調pH至7.0加水至1000ml，高壓消毒滅菌。
(4)預雜交液：12.5mL 1mol K3 PO4 pH7.4
125mL 20×SSC
25mL 100×Denhardt'S溶液
5mL 5mg/mL魚精DNA
250mL 100%去離子甲醯胺
82.5mL H2O(總體積為500mL)
(5)100×Denhardt'S液：10g聚蔗糖(Ficoll400)
10g聚乙烯吡咯烷硐
10g牛血清白蛋白(組分V)
加H2O至500ml
2、操作步驟(如圖20-1)：

圖20-1 Southern Blot裝置圖
(1)內切酶消化的DNA，總體積為50uL，加入10uL加樣緩沖液進行12-24瓊脂糖電泳。
(2)用溴化乙錠染色，紫外燈下觀察並照像，在膠的旁邊放一尺子。
(3)將電泳膠取出，用以下各溶液浸泡處理，同時輕輕搖動：
500mL 0.2mol/L HCL 10分鍾，水洗若干次
500mL變性液中浸泡15分鍾×2
500mL中和溶液浸泡30分鍾。
(4)剪一張硝酸纖維素膜，每邊小於膠3mm。
(5)剪3～5層濾紙，大小每邊比硝酸纖維膜小7mm，再剪一張濾紙，比膠的寬度長30～40cm，在一盤中加入數百毫升20×SSC，盤上搭一塊玻璃，濾紙可從玻璃雙側浸到盤中的溶液。
(6)逐層放置濾紙、凝膠、硝酸纖維素膜，其上再鋪濾紙及吸水紙，並加以重物，膠和硝酸纖維膜之間不可有氣泡，轉移24～36小時
(7)取出該膜，用圓珠筆標記方向，放入2×SSC中5分鍾，用濾紙吸干,80℃烘烤2小時。
(8)將該轉移膜放在塑料袋中，加入6～10mL預雜交液，排出氣泡，封口，42℃ 3小時或過夜。
(9)將標記的DNA探針煮沸5分鍾，立即冷卻，加入雜交液中，濃度為5×105 CPM/ML。
(10)倒去預雜交液，加入含探針的雜交液封口，42℃ 6h或過夜。
(11)取出轉移膜，按以下條件洗膜
1×SSC，0.1%SDS室溫2×15分鍾
0.25SSC，0.1%SDS,42℃ 2×15分鍾，氣中乾燥。
(12)將雜交後的膜曝光於X光片，暗盒中放射自顯影2～7天，-70℃。
(13)X片顯影、定影，然後讀片
結果分析：此雜交技術可以對基因結構進行分析。雜交陰性帶的大小，分布規律及根據帶條信號強度測量其含量。
二、RNA Northern Blot及雜交
此法是將RNA分子在變性瓊脂糖凝膠中可相互分離，隨後將RNA轉移至硝酸纖維素濾膜上，用放射性標記的探針進行DNA-RNA雜交，此法是研究RNA(特別是mRNA)的主要方法之一，可測量RNA的含量和大小。
1、配液：Northern 預雜交液：12.5m 1mol/L K3PO4 pH7.4
125mL 20×SSC
25mL 100×Danhardt's液
5mL 5mg/mL 魚精DNA
250mL 100%去離子甲醯胺
加H2O 至500mL-20℃貯存
Northern 雜交液：500mL預雜交液加入標記探針及10%磷酸葡聚糖。
2、操作步驟：
(1)RNA變性電泳方法同前
(2)待溴酚蘭走至膠的中部時，用水清洗膠數次，放置於500mL 10×SSC中浸泡45分鍾，輕輕搖動。
(3)測量膠的大小，按下列順序，從下向上為①橫跨玻璃雙側的濾紙，雙邊可浸至20×SSC溶液；②膠；③硝酸纖維素濾膜；④親和層吸紙；⑤吸水紙；⑥重物、轉移4～6小時。
(4)取出濾膜80℃烘烤2小時。
(5)用6～10mL Northern預雜交液，42℃預雜交過夜。
(6)將已標記的探針煮沸，立即冷卻，加入6～10mL Northern雜交液。
(7)去除預雜交液，加入含探針的雜交液，42℃，雜交過夜。
(8)按下列條件洗膜：1×SSC 0.1%SDS室溫2×15分鍾
0.25×SSC 0.1%SDS室溫2×15分鍾
(9)曝光於X光片暗盒中放射自顯影1天。顯影，定影，根據自顯影條帶的位置判定特定片斷的位置和順序，也可測含量。
三、蛋白Western Blot及分析
此項技術是一種蛋白質的固定和分析技術，是將已用聚丙烯醯胺凝膠或其它凝膠或電泳分離的蛋白質轉移到硝酸纖維濾膜上，固定在濾膜上的蛋白質成分仍保留抗原活性及與其它大分子特異性結合的能力，所以能與特異性抗體或核酸結合，其程序Sonthern Blot相似，故稱為Western Blot,第一抗體與膜上特異抗原結合後，再用標記的二抗(同位素或非同位素的酶)來檢測，此方法可檢測1ng抗原蛋白。
1、配液：
(1)轉移電泳緩沖液：20mmol/L Tris HCL pH8.0
150mmol/L 甘氨酸
加14.5g Tris粉 67.08g甘氨酸於4L水中，加入1200mL
甲醇，加水至6L
(2)麗春紅S溶液：0.5%麗春紅S
1%乙酸
2、操作步驟（如圖20-2）：

圖20-2 Western Blot裝置圖

(1)用已制備好的SDS-PAGE分離的蛋白凝膠。
(2)用一張濾紙，剪成與膠同樣大小，在轉移電泳緩沖液中預濕，放在Scotch-Brit Pad上，在膠的陰性端放上濾紙，膠的表面用該緩沖液浸濕，排出所有氣泡。
(3)在膠的陽極面放置同樣大小浸濕的硝酸纖維素膜，排出氣泡，再在濾膜的陽極端放置一張濾紙，排出氣泡，再放一個Scotch-Brit Pad。
(4)將以上「三明治」樣裝置放入一個塑料支撐物中間，將支撐物放入電轉移裝置中，加入電轉移緩沖液。
(5)接通電源：使膠上的蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，電壓為14V 4℃轉移4小時或過夜。
(6)將濾膜放入麗春紅S溶液中5分鍾，蛋白染色水中脫色2分鍾，照像，用印度墨水將分子量標准染色，在水中完全脫色。
(7)將濾膜放在塑料袋中，每3張加入5mL封閉緩沖液(1克速溶去脂奶粉溶於100ml PBS中)，封閉特異性抗體結合位點，室溫1h，搖動，倒出封閉緩沖液。
(8)在封閉緩沖液中稀釋第一抗體，加入後室溫放置1小時，將濾膜轉到塑料盒中，用200mL PBS洗四次，搖動。
(9)在封閉緩沖液中稀釋辣根過氧化物酶標記的二抗，重復步驟8。
(10)將濾膜放在100mL新配製的DAB底物溶液中，大約2～3分鍾就可顯色，用水沖洗終止反應、照像。
結果分析：分析陽性(顯色)條帶的分子量大小，而且根據信號(顏色)強弱分析蛋白表達量。

第三節 細胞的原位雜交技術

原位雜交(ISH)是一種可在細胞塗片、組織切片以及分裂中期染色體帶中檢測DNA或RNA的技術，此方法原理是由DNA或RNA的序列與互補的標記單鏈DNA/RNA探針結合形成標記的雙鏈雜交分子，本技術可對組織細胞原位的待測核酸分子進行定性，定量及定位分析。在細胞分化調節、基因定位、腫瘤遺傳學、分子病理學、病毒學等領域得到廣泛應用。經典的原位雜交技術包括載玻片處理，組織細胞的固定，探針的制備或選購，原位雜交，洗滌以及檢測，其中探針制備技術不屬於本章專業技術，故不作具體評敘，略交待制備使用原則。本章節主要介紹培養細胞的原位雜交技術。
一、探針的制備原則和選擇
探針為RNA或雙鏈、單鏈DNA，雙鏈探針較單鏈探針有很多缺點，探針必須變性、復性，降低了探針雜交效率，雙鏈探針在溶液中形成長的鏈狀結構傾向，限制了它的組織穿透能力。適用於基因組DNA雜交。由於原位雜交的探針將與高密度的細胞融合，因此，需要減短探針的長度或增加探針的濃度，但是過高濃度的探針往往會增加非特異性結合，因此每種探針應選擇適當的濃度。
探針的獲得常採用隨機引物延伸法的PCR合成和擴增，可獲大量的DNA探針，或利用帶有噬菌體強啟動子多克隆位點的質粒載體來合成RMA探針，也可利用質粒菌擴增質粒，經酶切後純化的基因片斷，均可以獲得制備探針原料。這些探針可以用同位素標記，也可以用非同位素標記，即光敏生物標記或地高辛配基標記於脫氧脲嘧啶三磷酸核苷(dUTP)上形成的地高辛-dUTP，可通過隨機引物或缺口平移法與探針的核酸分子相連，構成地高辛一配基標記的核酸探針。比探針可用抗地高辛抗體偶聯酶或熒光素通過松體結合和底物顯色或產生熒光來檢測。
這些探針基本均有市售，無需自行制備，只要根據說明書使用即可。
二、載玻片和蓋玻片預處理
為了防止探針的非特異貼附而保證細胞粘附而需處理：
1、用於檢測RNA的載玻片的處理
(1)用0.1mol/L HCL洗載玻片20分鍾，再用無水乙醇洗數次使其乾燥。
(2)在下列溶液中，65℃處理2小時
3×SSC 0.02%FicoLL400 0.02%聚乙稀吡咯烷酮(PVP)。
(3)固定在乙醇/乙酸(3:1 V/V)20分鍾，180℃烘烤2小時。
2、用於檢測DNA的載玻片的處理
以TESPA(three-amino-propyl-triethoxy-silane)塗載玻片。
3、對於蓋玻片：於0.1mol/L HCL中浸泡20分鍾，用無水乙醇洗，乾燥後用二甲基氯化硅硅化，180℃烤2小時。
三、組織細胞固定
理想的細胞固定過程應該保護細胞形態，同時確保目的基因DNA或RNA序列暴露。對於RNA-RNA原位雜交有效的固定劑是4%多聚甲醛和PLPD（磷酸緩沖液PBS、賴氨酸、過碘酸鹽及重酪酸鹽）。
1、塗片細胞原位雜交固定
(1)用含有0.02%EDTA的PBS洗滌細胞，於0.1%胰蛋白酶消化，收獲細胞計數，塗載玻片上。
(2)若檢測RNA，固定於4%多聚甲醛pH7.0，在4℃下放60分鍾，PBS洗5分鍾，系列乙醇脫水乾燥，-20℃保存。
(3)若檢測DNA，固定在4%多聚甲醛16～24小時，0.1mol/L Tris-HCL pH7.4洗2×5分鍾，浸泡在下述溶液中2×5分鍾：
0.25%(v/v)Tritonx-100；0.25%(v/v)Nonidet P40；0.1mol/L Tris-HCL pH7.4；再用0.1mol/L Tris-HCL pH7.4洗2×5分鍾。
(4)在100μg/ml蛋白酶K，50mmol/L Tris-HCL PH8.0，5mmol/L EDTA溶液中，37℃處理10分鍾，再用含有甘氨酸的0.1mol/L Tris-HCL PH7.4洗2×5分鍾。
(5)在20%(v/v)乙酸中40℃處理15分鍾，0.1mol/L Tris-HCL PH7.4洗2×5分鍾。
注意：對於DNA-DNA原位雜交多聚甲醛或福爾馬林均可，但對於地高辛檢測法必須用4%多聚甲醛，固定至少16小時，而且用蛋白酶K處理，這樣可明顯減少背景染色。
四、原位雜交
原位雜交與鹽濃度、溫度、甲醯胺濃度、pH等有關，DNA復性的溫度是16～32℃，DNA-RNA原位雜交，25℃最佳，RNA-DNA雜交，可用較高溫度，在pH5～9范圍內復性率基本上與pH無關。最好選用溫和的鹼性條件。甲醯胺有機溶劑可降低雙鏈核酸的穩定性，可避免雜交過程中處於過高的溫度，防止高溫破壞組織。
(一)同位素標記DNA探針的原位雜交
同位素標記的DNA探針，敏感性高，但要注意非特異結合，如35S標記探針在雜交前，用未經標記的dUTP預雜交，可減少非特異，可獲較好的細胞內定位，此外還常用3H或125I標記探針，但3H放射線弱，自顯影需100天曝光，不太理想，方法如下：
(1)取已形成單層的細胞的蓋玻片，懸浮細胞可採用離心法，將細胞粘附到塗有明膠的載玻片上。組織印片，冰凍切片等標本。
(2)將標本浸入甲醇固定5分鍾，再過3次4℃預冷的10%三氯醋酸。
(3)將細胞片標本浸入70%乙醇脫水，空氣乾燥，這時培養細胞蓋玻片應該用中性樹膠固定於載玻片上，注意細胞面向上。
(4)將細胞片放置在金屬盤內，並將托盤放入43℃水浴箱中預熱。
(5)直接向固定的細胞面滴加5mL含探針雜交液，然後用16mm蓋玻片覆蓋，其邊緣用橡膠液封閉。
(6)43℃恆溫水浴箱內培養18小時，此間保持箱內高濕度，防止因蓋玻片封閉不嚴導致雜交緩沖液乾涸。
(7)反應結束後，將玻片置於冰塊上，用鑷子小心剝下蓋玻片周邊的橡膠，將載玻片浸入垂直2×SSC溶液中，使蓋玻片脫落。
(8)將載玻片放入濕盒中，加2×SSC溶液浸沒玻片，加蓋玻片並用膠帶封閉濕盒。然後，將濕盒移入水浴箱中53℃處理30分鍾。
(9)在18℃用2×SSC洗玻片4次，每次5分鍾。
(10)玻片浸入70%乙醇脫水，空氣乾燥。
(11)將乾燥後的乾燥標本浸入新配製的核4乳膠液（核4乳膠液蒸餾水=1:1），垂直取出玻片，用濾紙擦去背面多餘膠，室溫乾燥5小時（在暗室中進行）。
(12)用黑紙包裹標本放在4℃冰箱曝光（3H標記的探針通常需2～4周，有時需長達100天，可造成高背景，而不理想）。
(13)按常規顯影、定影、水洗。
(14)對標本進行Giemsa或HE染色、脫水、封片。
結果分析：鏡下觀察，如需定量，可在鏡下計數銀顆粒或拍攝顯微照片，用圖象分析儀進行灰度分析。
(二)同位素標記RNA探針的原位雜交
RNA探針容易制備，合成率較高，成本低，易純化，可提高檢測敏感性。DNA-RNA、RNA-RNA雜交比DNA-DNA雜交穩定，能適應更多的條件。
(1)標本處理同前
(2)將RNA標記探針溶於雜交緩沖液中（5×107CPM/ml放射強度）。
50～70%去離子甲醯胺 2×SSC
0.5×Denhardt's液 1mmol/L EDTA pH7.0
200μg/mL變性魚精DNA 85℃ 5分鍾
(3)每張載玻片上滴加雜交液，使每張載玻片探針總量為2×105CPM，用一硅化的蓋玻片蓋住，封以不透性礦物油，在利於探針的溫度下（常為42℃）雜交7～18小時。
(4)用氯仿洗數次，去除礦物油，室溫下使蓋玻片在2×SSC液中滑落，再滴加50%～70%去離子甲醯胺，0.1×SSC液，雜交溫度下60分鍾，室溫2×SSC洗5分鍾，用50μg/mL RNaseA在2×SSC中消化去除單鏈RNA，再滴加50%～70%去離子甲醯胺，0.1×SSC,室溫15分鍾，室溫下用0.1×SSC洗5分鍾。
(5)將切片脫水，浸入由1%甘油稀釋的放射自顯影乳劑（1:1）中，放入暗盒中，在有硅膠乾燥劑存在下-70℃，存放5天（或者曝光於X光膠片24～48小時），隨後浸於液體乳劑。
(6)用HE染色。
(三)地高辛標記的DNA探針原位雜交
放射性同位素標記探針缺點是有放射損傷，易污染環境，需特殊防護和實驗條件，有半衰期受限、標記不穩定及曝光時間長。若改用生物素、乙醯氨基、熒光或地高辛標記可避免，其中以地高辛標記探針最敏感，隨機引物標記地高辛，其標記率很高，此探針用於原位雜交可獲高敏感性，好的細胞定位以及低背景。非同位標記探針還可以通過雙標記原位雜交法，同時測多條DNA序列。
(1)配液：①雜交緩沖液：2×SSC
5%（W/V）磷酸葡聚糖
50%去離子甲醯胺
②緩沖液I： 0.1mol/L Tris-HCL pH7.5
0.5mol/L Nacl
③緩沖液II： 0.1mol/L Tris-HCL pH9.5
0.1mol/L Nacl
5mmol/L MgCl2
(2)操作步驟：
①組織標本處理同前。
②將140ng/mL地高辛標記的探針加到雜交緩沖液中，每張滴加50μL雜交緩沖液，用蓋玻片蓋住，四周封以樹膠。
③將目的DNA和DNA探針放入90℃，進行變性10分鍾，雙鏈打開，42℃，在潮濕環境中雜交16小時。
④去除蓋玻片，按下列條件洗滌：
2×SSC室溫10分鍾→2×SSC室溫10分鍾→0.2×SSC室溫10分鍾→0.2×SSC 42℃ 20分鍾。
⑤再按以下方法處理：
1) 在緩沖液I中洗30分鍾。
2) 在含有20%羊血清的緩沖液I中洗30分鍾。
3) 滴加1:5000標有鹼性磷酸酶或辣根過氧化物酶的地高辛抗體，在裝有緩沖液I的濕盒中溫育20分鍾。
4) 在緩沖液I中洗2×20分鍾。
5) 在緩沖液II中洗60分鍾。
6) 加入下述溶液：緩沖液II
0.33mg/mL 四唑氮蘭
0.17mg/mL 5-bromo-4-Chlora-3-indoly' phosphate
7) 將切片浸於20mmol/L Tris-HCL pH7.5，5mmol/L EDTA終止反應。
⑥ 用底物顯色、復染、脫水、封片，按免疫組化常規法進行。
說明：
(1)用不同濃度和不同溫度的鹽溶液洗滌是為了去除探針與不完全同源序列雜交，減少非特異性顯色，其原則鹽濃度由高到低，溫度由低到高洗滌，洗滌過程中切勿使切片乾燥。
(2)應該有陽性和陰性對照，陽性對照：用該探針與已知含互補序列的組織細胞標本進行雜交。陰性對照：①應用RNA酶或DNA酶去除目的序列；②使用未標記探針；③不加核酸探針進行雜交（空白對照）；④用不含探針DNA的無關質粒DNA替代探針進行雜交；⑤同義RNA（Sense probe）進行雜交。

Ⅷ 制備乙醯乙酸乙酯純化過程為什麼要用減壓蒸餾

乙醯乙酸乙酯的沸點較高，好像180攝氏度，而且乙醯乙酸乙酯在受熱的溫度超過95攝氏度時就會分解，所以才採取減壓蒸餾來提純（靠蒸餾出來提純）
原理略：利用乙酸乙酯a-h的活性。。。。。。